Name: Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprenda a produzir camundongos transgênicos com alta eficiência usando injeção de vetores lentivirais no espaço perivitelino. Este método simples permite triagem rápida in vivo de efeitos de transgenes em modelos murinos.

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Agradecemos a Magali Dumont e Rolando Meloni pela leitura crítica do manuscrito e iVector e Phenoparc ICM núcleos de assistência técnica na produção de vetor de Lentivirus e animal habitação respectivamente. Este trabalho foi apoiado do Translationnelles Institut Hospitalo Universitaire de Neurociências de Paris, o IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. Relações públicas recebida financiamento para a associação de Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) e um conjunto JDRF / INSERM de concessão.

<ol><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+%28SCID%29+mice+carrying+human+cytokine+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li>
<li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li>
<li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse%2C+rat%2C+rabbit%2C+and+pig+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li>
<li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animals%3A+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
<li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li>
<li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
<li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).</li>
<li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741(2010).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
<li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD%2Fscid+background%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li>
<li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li>
<li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li>
<li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+generation+of+high-titer%2C+pantropic+retroviral+vectors%3A+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li>
<li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li>
<li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li>
<li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li>
<li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413(2010).</li>
<li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV%29+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+%28i-PITT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274(2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li>
<li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li>
<li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li>
<li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

A injeção de perivitelline de Lentivirus vetores em oócitos fertilizados descritos aqui resultou na produção de embriões transgênicos que rendeu mais de 70% dos embriões geneticamente modificados em relação ao número total de embriões coletados. Este resultado é consistente com relatórios anteriores e exemplifica a especificidade do procedimento2,7,10,11,12. Q...

O trabalho pioneiro de Gordon et al . em 1980 mostrou que, após a implantação em ratos pseudopregnant, a injeção de DNA de plasmídeo para o sexo masculino pró-núcleos de oócitos fertilizados pode render a produção de animais transgénicos que integrado a Plasmideo DNA1. A demonstração de que os mamíferos transgênicos podem ser gerados teve um enorme impacto sobre ciências da vida globais, abrindo o caminho para novos campos de pesquisa, tanto para as ciências básicas e ciências biomédicas translacionais. Nas últimas quatro décadas, a microinjeção de DNA tornou-se uma prática de rotina. Embora um enorme número de ratos transgênicos foram produzido, o método padrão não é totalmente utilizável para todas as estirpes de rato e requer demorado retrocruzamentos2,3. Sua aplicação a outras espécies permanece desafiador4 e o rendimento global de integração do transgene é limitado a alguns porcentagem de animais nascido5. Além disso, a eficácia da integração do transgene representa o fator limitante que explica o pobre rendimento total da injeção de DNA pró-nuclear. A este respeito, Integrativa vetores virais são as ferramentas mais eficientes para carga e integram transgenes em assim poderiam fornecer novos meios para aumentar significativamente o rendimento de integração, a única limitação é que o tamanho do transgene que não pode exceder 10 kb6 .
Particulas de Lentivirus vetores pseudo digitados com a proteína do envelope do vírus da estomatite Vesicular (VSV) são ferramentas de transferência do gene pantropic e altamente integrativa e podem ser usados para transduce oócitos fertilizados7. A zona pelúcida envolvendo oócitos é uma barreira natural de vírus e precisa ser passado para permitir a transdução com os vetores de Lentivirus. Animais transgénicos foram gerados pelo transducing oócitos fertilizados após micro perfuração ou remoção da zona pelúcida8,9. No entanto, injeção sob a zona pelúcida no espaço perivitelline parece ser o método mais simples para transduce os ovos fertilizados como inicialmente descrito por Lois e colegas7.
A injeção de perivitelline de Lentivirus vetores permite altos rendimentos na produção de animais transgénicos que estão acima de 70% dos animais nascidos. Tal rendimento é mais 10-fold maior do que o melhor rendimento que pode ser conseguido usando padrão pró-núcleos DNA injeção7,10,11. Neste contexto, uma única sessão de injeções irá gerar pelo menos 50 fundadores transgénicos (F0). O grande número de fundadores é, portanto, compatível com fenotipagem do transgene efeito diretamente realizada em F0 ratos sem a necessidade de gerar linhas de rato transgénico. Esta vantagem permite a seleção rápida do efeito do transgene e é especificamente adaptada para executar na vivo ganho e perda de estudos de função dentro de semanas. Além disso, elementos reguladores do DNA podem também ser rapidamente analisados para mapear enhancers e motivos de DNA vinculados por fatores de transcrição11,12. Com injeções pró-nuclear, transgenes integrar normalmente como várias cópias em um único locus. Com vetores de Lentivirus, integração ocorre em múltiplos loci como uma única cópia por locus10,13. Portanto, a multiplicidade dos loci integrado é provavelmente associada a penetrância de expressão muito alta observada em fundadores transgénicos, que faz com que o novo modelo gerado mais robusto.
Importante, quando usando injeção pró-nuclear do ADN, visualização dos pró-núcleos durante o procedimento é absolutamente necessária. Essa limitação técnica impede o uso de oócitos fertilizados, provenientes de uma grande variedade de estirpes de rato. Portanto, a produção de um modelo transgênico em uma determinada tensão para qual pró-núcleos são invisíveis exige a produção de animais em uma cepa permissiva, seguido pelo menos 10 sucessivos retrocruzamentos para transferir o transgene no mouse desejado estirpe. Com as injeções de vetor de Lentivirus, perivitelline espaço é sempre visível e a injeção não requer habilidades altamente específicas. Por exemplo, ratos transgénicos de NOD/SCID que não são apropriados para injeção de pró-núcleos foram obtidos com o vector viral injeções14.
Aqui, apresenta-se um protocolo abrangente para permitir que a simples produção de camundongos transgênicos usando injeções de vetor de Lentivirus no espaço perivitelline de um embrião de fase de uma célula. Expressão do transgene controlada com qualquer onipresente ou promotores específicos de célula é descrito em detalhes.
O backbone de Lentivirus de ΔU3 de pTrip foi usado no presente estudo15. Esse vetor permite produzir vetores de Lentivirus defeituoso replicação, no qual a sequência de U3 foi parcialmente excluída para remover a atividade de promotor U3 e gerar um self inactivating vector (SIN)16. Estoques de vetor de Lentivirus foram produzidos por transfecção transiente de células HEK-293T com o p8.91 encapsulamento do plasmídeo (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, a codificação a estomatite vesicular (VSV) de vírus glicoproteína-G17e o ΔU3 de pTRIP pHCMV-G vector recombinante. O processo de produção detalhado é fornecido como métodos complementares.
Produção das unidades populacionais de vetor de Lentivirus de alta concentração é realizada em condições de biossegurança nível II (BSL-2). Isto é verdade para a maioria dos transgenes exceto oncogenes que têm de ser produzidos em BSL-3. Portanto, a produção em condições de BSL-2 para a maioria dos casos é suficiente. Além disso, o uso e a produção são geralmente desconectados para a maioria das agências reguladoras nacionais, lidando com organismos geneticamente modificados (OGM). Quantidades limitadas de replicação incompetente SIN Lentivirus vetores (abaixo de 2 µ g da proteína do capsídeo p24) podem ser usadas sob condições de BSL-1 conforme descrito pela agência francesa OGM, de acordo com as recomendações da União Europeia.

<table><tbody><tr><td>PMSG 50UI</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>hCG 5000UI</td><td>Sigma</td><td>CG5-1VL</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 100 mm</td><td>Dutsher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4 poços Prato Nunc</td><td>Dutsher</td><td>56469</td><td>prato de fertilização in vitro</td></tr><tr><td>M2 médio</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 médio</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Filtro de seringa</td><td>Dutsher</td><td>146611</td><td></td></tr><tr><td>Enzima Hialuronidase 30mg</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>embrião de camundongo testado</td></tr><tr><td>Insulina serynge</td><td>VWR</td><td>613-3867</td><td>Terumo Myjector</td></tr><tr><td>Pinça curva</td><td>Moria</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura curva</td><td>Moria</td><td>MC26</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Aparelho Harvard</td><td>GC 100-10</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta horizontal</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>Transferman NK2 5188</td><td>A iluminação de contraste de modulação Hoffman é necessária</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Eppendorf</td><td>Celltram air</td><td></td></tr><tr><td>Controler de pipeta de retenção</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>embrião de rato testado</td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td>Pode ser usado para injetar DNA ou vetores virais</td></tr><tr><td>Dumont # 5 pinças</td><td>Moria</td><td>MC 40</td><td></td></tr><tr><td>vannas micro tesoura</td><td>Moria</td><td>9600</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>centravet</td><td>ISO005</td><td>ISO-VET 100% 250ml</td></tr><tr><td>ocrygel</td><td>centravet</td><td>OCR002</td><td></td></tr><tr><td>Povidona iodure</td><td>centravet</td><td>VET001</td><td>vetedina 120ml</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>centravet</td><td>BUP002</td><td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Cloridrato de Trizma</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>proteinase em pó</td></tr><tr><td>K</td><td>Sigma</td><td>P2308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>oneTaq kit</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tira de 8 tubos</td><td>PCR 4titude 4ti-0781</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 poços termociclador</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Veriti</td></tr><tr><td>Genomic DNA mini kit</td><td>invitrogen</td><td>K1820-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Master mix</td><td>Roche</td><td>4887352001</td><td>SYBR Green&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa multipoços 384</td><td>Roche</td><td>5217555001</td><td></td></tr><tr><td>instrumento qPCR 384 poços</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480</td></tr></tbody></table>

particulas de lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Há quase 40 anos, injeção de DNA pró-nuclear representa o método padrão para gerar ratos transgénicos com integração aleatória de transgenes. Um procedimento de rotina é amplamente utilizado em todo o mundo e sua principal limitação reside na eficácia da integração do transgene, resultando em um baixo rendimento dos animais fundador pobre. Apenas alguns por cento dos animais nascidos após a implantação de oócitos fertilizados injetados integraram o transgene. Em contraste, Lentivirus vetores são ferramentas poderosas para a transferência de genes integrativa e sua utilização para transduce oócitos fertilizados permite uma produção altamente eficiente do fundador ratos transgénicos com um rendimento médio acima de 70%. Além disso, toda a tensão do mouse pode ser usada para produzir animais transgénicos e a penetrância da expressão do transgene é extremamente elevada, acima de 80% com particulas de Lentivirus transgênese mediada comparado a microinjeção de DNA. O tamanho do fragmento de DNA que pode ser a carga pelo vetor de Lentivirus é limitado a 10 kb e representa a principal limitação deste método. Usando um simples e fácil de executar o procedimento de injeção por baixo da zona pelúcida de oócitos fertilizados, mais de 50 animais do fundador podem ser produzidos em uma única sessão da microinjeção. Tal método é altamente adaptado para executar, diretamente em animais fundador, ganho rápido e perda de estudos de função ou de regiões de DNA genômicas tela por sua capacidade de controlar e regular o gene expressão na vivo.

Animais transgénicos foram gerados usando o protocolo aqui apresentado. Representante resultados ambos onipresente e expressão de transgene específica de tipo de célula são ilustrados.
Expressão constitutiva de transgenes
Promotores onipresentes são ferramentas de pesquisa básica para expressar transgenes de forma sustentada e eficiente. Esses promotor...

Aqui, apresentamos um protocolo para promover a integração do transgene e produção de ratos transgénicos fundador com eficácia elevada por uma simples injeção de um vetor de Lentivirus no espaço de um oócito fertilizado perivitelline.

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Este método permite uma rápida triagem in vivo em camundongos, do efeito de um transgene, e é especificamente adaptado para realizar estudos de ganho ou perda de função, bem como um mapeamento de resposta e motivo de DNA. A principal vantagem dessa técnica é que o uso de previsão de animais transgênicos está acima de 70% do recém-nascido e pode ser aplicado a qualquer cepa de camundongos, incluindo animais transgênicos. Depois de eutanásia dos ratos, colete os ovidutos.Para começar a cirurgia, use uma tesoura para fazer uma grande incisão horizontal na cavidade abdominal. Em seguida, localize o oviduto entre o útero e o ovário. Em seguida, use fórceps curvos para remover o mesomário e a membrana com os vasos sanguíneos proeminentes.Em seguida, separe o oviduto do ovário e disseca o oviduto do ovário. Em seguida, puxe o oviduto e corte para longe do útero. Transfira todos os ovidutos coletados para m2 médios em temperatura ambiente.Ao manusear os ovidutos, tenha cuidado para evitar tocar na ampola inchada carregada com ovos fertilizados. Em seguida, adicione uma gota de 100 microliteres de solução de trabalho de hialuronidase a um prato de 10 centímetros. Em seguida, transfira os dois ovidutos para ele, para remover as células cumulus dos ovos.Sob um estereómico, use um par de seringas de insulina para proteger o oviduto enquanto rasga a ampola e dispersa os ovos fertilizados. Em seguida, use uma pipeta de vidro preparada com tubos e um porta-voz para aspirar todos os ovos. Usando esta ferramenta, transfira-as entre seis gotas de m2 médio para lavar as células cumulus circundantes.Em seguida, transfira os ovos lavados para um poço de 10 milímetros, em uma placa de quatro poços, preenchido com pré-aquecido com M16. Em seguida, transfira o prato para uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius. Em preparação, centrífugue a suspensão do vetor lentiviral preparada a 160 g por dois minutos, para pelotar os detritos frequentemente presentes em estoque lentiviral.Em um gabinete de segurança classe dois, transfira os supernantes para um novo tubo de 0,5 mililitro. Em seguida, carregue um microliter de supernadante, em uma pipeta de injeção. Em seguida, conecte a pipeta de injeção ao micromanipulador do lado direito.E anexar a pipeta de retenção ao micromanipulador do lado esquerdo. Agora, dispense oito microliters de m2 médio no centro do slide de depressão. E cubra com óleo de parafina leve para evitar evaporação.Em seguida, coloque 20 ovos nos locais rasos na gota sem criar bolhas. Em seguida, certifique-se de que a ponta da pipeta de injeção está aberta. Se não, toque a pipeta de injeção com a pipeta de retenção para abri-la.Em seguida, defina o microinjetor para injeções de 20 segundos. Agora, usando a pipeta de retenção e pressão manual aspirar um óvulo fertilizado que contém dois pronuclei e dois corpos polares. Em seguida, usando a pipeta de injeção injete o espaço perivitelline do ovo.Não toque na membrana plasmática. Ajuste a pressão para que o espaço perivitelline seja preenchido com solução. A pressão não deve exceder 600 hecto pascals.Imediatamente após injetar os 20 ovos, transfira o lote para um banho de meio M16 pré-aquecido. E incuba-los por pelo menos 30 minutos antes de implantá-los. 16 horas após o acasalamento de fêmeas normais para machos com vasectomias, verifique se há plugues de cópula.Use essas fêmeas para a implantação. Em seguida, faça pipetas de implantação com diâmetro interno de cerca de 150 mícrons. E com pontas polidas de chama que têm cerca de quatro a cinco milímetros de comprimento.Carregue uma pipeta com embrião testado, óleo de parafina leve até um pouco acima do ponto do ombro. Em seguida, aspire uma pequena bolha de ar e carregue ainda mais a pipeta com meio M2. Em seguida, aspire uma segunda bolha de ar.Agora, desenhe os embriões na pipeta um atrás do outro, minimizando o volume de meio entre os embriões. Finalize, aspirando uma pequena gota de óleo parafina apenas um embrião de largura. A preparação da pipeta de reimplantação é fundamental e precisa de muita prática.Os ovos na pipeta devem estar alinhados com praticamente nenhum meio entre eles. Em seguida, depois de anestesiar o rato e confirmar a anestesia com uma pitada de dedo raspar duas tiras de cabelo de dois centímetros ao longo da medula espinhal ao nível da última costela. Agora, coloque o rato em uma almofada de aquecimento em um campo estéril e drape-o, deixando uma janela para a pele exposta.Em seguida, higienize a pele exposta com esfoliantes alternados de iodoprovidone e 70% de etanol. Para a implantação, primeiro faça uma incisão transversal de um centímetro e deslize a pele lateralmente até que o ovário cor de laranja seja visível através da parede do corpo. Em seguida, faça uma incisão de cinco milímetros com a tesoura fina e pegue a almofada de gordura com um grampo buldogue atraumatic.Uma vez que a almofada é agarrada, puxe o ovário, o oviduto e o topo do útero. Em seguida, localize a ampola e faça uma hemiseção com tesoura vannas, no segmento de oviduto que liga o ovário à ampola. Em seguida, introduza a pipeta de embrião de transferência e ejete os ovos.Parando na primeira bolha de ar depois que os ovos foram liberados. Tenha os materiais necessários preparados para repetir o procedimento no segundo oviduto. E uma vez completado, feche a pele com clipes de ferida.Imediatamente após o fechamento da pele, injete inexperitoneaticamente analgésico e coloque o animal na câmara de recuperação com um elemento de aquecimento de 39 graus Celsius. Monitore até que esteja totalmente acordado. O animal transgênico foi gerado utilizando-se o método apresentado.Um vetor lentiviral de alto título foi produzido usando um melhorador de base de 2,3 quilos para neurogenina-3 para conduzir eGFP. Ou como controle, um fragmento de cromossomo seis para dirigir eGFP. A integração em embriões foi bastante bem sucedida.Dos embriões, o broto pancreático foi seccionado e imunosterado para procurar expressão localizada de eGFP. Mais de 90% dos vetores, com o intensificador neurogenin-3, expresso eGFP em células expressas neurog3. No entanto, nenhum dos vetores de controle integrados expressou eGFP no broto pancreático.Os locais de integração transgene foram avaliados por PCR quantitativo, utilizando o gene CDX2 como controle. O número médio de locais de integração foi de cerca de 20 utilizando a construção neurogenina-3, ou 10 usando a construção de controle. Curiosamente, o titer de transdução viral usado para a construção neurogenina-3, era cerca de o dobro do vetor de controle.Sugerindo uma relação entre o titer de transdução e o número de integrações. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar um grande número de embriões transgênicos fundadores usando injeção de perivitelline de vetores lentivirais com alta eficácia. Uma vez dominada, essa técnica pode produzir até 50 animais fundadores em um único dia de microinjeção, se for realizada corretamente.Após este procedimento, outros métodos como a injeção de DNA pronuclear titer podem ser realizados, a fim de estabelecer linhas de camundongos transgênicos. Não se esqueça que trabalhar com vetores lentivirais está sujeito à autorização do seu comitê local de OGM. Esses vetores podem ser extremamente perigosos e a precaução deve ser sempre tomada durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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