Name: Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprenda a produzir camundongos transgênicos com alta eficiência usando injeção de vetores lentivirais no espaço perivitelino. Este método simples permite triagem rápida in vivo de efeitos de transgenes em modelos murinos.

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Agradecemos a Magali Dumont e Rolando Meloni pela leitura crítica do manuscrito e iVector e Phenoparc ICM núcleos de assistência técnica na produção de vetor de Lentivirus e animal habitação respectivamente. Este trabalho foi apoiado do Translationnelles Institut Hospitalo Universitaire de Neurociências de Paris, o IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. Relações públicas recebida financiamento para a associação de Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) e um conjunto JDRF / INSERM de concessão.

<ol><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+%28SCID%29+mice+carrying+human+cytokine+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li>
<li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li>
<li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse%2C+rat%2C+rabbit%2C+and+pig+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li>
<li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animals%3A+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
<li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li>
<li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
<li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).</li>
<li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741(2010).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
<li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD%2Fscid+background%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li>
<li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li>
<li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li>
<li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+generation+of+high-titer%2C+pantropic+retroviral+vectors%3A+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li>
<li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li>
<li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li>
<li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li>
<li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413(2010).</li>
<li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV%29+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+%28i-PITT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274(2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li>
<li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li>
<li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li>
<li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

A injeção de perivitelline de Lentivirus vetores em oócitos fertilizados descritos aqui resultou na produção de embriões transgênicos que rendeu mais de 70% dos embriões geneticamente modificados em relação ao número total de embriões coletados. Este resultado é consistente com relatórios anteriores e exemplifica a especificidade do procedimento2,7,10,11,12. Q...

O trabalho pioneiro de Gordon et al . em 1980 mostrou que, após a implantação em ratos pseudopregnant, a injeção de DNA de plasmídeo para o sexo masculino pró-núcleos de oócitos fertilizados pode render a produção de animais transgénicos que integrado a Plasmideo DNA1. A demonstração de que os mamíferos transgênicos podem ser gerados teve um enorme impacto sobre ciências da vida globais, abrindo o caminho para novos campos de pesquisa, tanto para as ciências básicas e ciências biomédicas translacionais. Nas últimas quatro décadas, a microinjeção de DNA tornou-se uma prática de rotina. Embora um enorme número de ratos transgênicos foram produzido, o método padrão não é totalmente utilizável para todas as estirpes de rato e requer demorado retrocruzamentos2,3. Sua aplicação a outras espécies permanece desafiador4 e o rendimento global de integração do transgene é limitado a alguns porcentagem de animais nascido5. Além disso, a eficácia da integração do transgene representa o fator limitante que explica o pobre rendimento total da injeção de DNA pró-nuclear. A este respeito, Integrativa vetores virais são as ferramentas mais eficientes para carga e integram transgenes em assim poderiam fornecer novos meios para aumentar significativamente o rendimento de integração, a única limitação é que o tamanho do transgene que não pode exceder 10 kb6 .
Particulas de Lentivirus vetores pseudo digitados com a proteína do envelope do vírus da estomatite Vesicular (VSV) são ferramentas de transferência do gene pantropic e altamente integrativa e podem ser usados para transduce oócitos fertilizados7. A zona pelúcida envolvendo oócitos é uma barreira natural de vírus e precisa ser passado para permitir a transdução com os vetores de Lentivirus. Animais transgénicos foram gerados pelo transducing oócitos fertilizados após micro perfuração ou remoção da zona pelúcida8,9. No entanto, injeção sob a zona pelúcida no espaço perivitelline parece ser o método mais simples para transduce os ovos fertilizados como inicialmente descrito por Lois e colegas7.
A injeção de perivitelline de Lentivirus vetores permite altos rendimentos na produção de animais transgénicos que estão acima de 70% dos animais nascidos. Tal rendimento é mais 10-fold maior do que o melhor rendimento que pode ser conseguido usando padrão pró-núcleos DNA injeção7,10,11. Neste contexto, uma única sessão de injeções irá gerar pelo menos 50 fundadores transgénicos (F0). O grande número de fundadores é, portanto, compatível com fenotipagem do transgene efeito diretamente realizada em F0 ratos sem a necessidade de gerar linhas de rato transgénico. Esta vantagem permite a seleção rápida do efeito do transgene e é especificamente adaptada para executar na vivo ganho e perda de estudos de função dentro de semanas. Além disso, elementos reguladores do DNA podem também ser rapidamente analisados para mapear enhancers e motivos de DNA vinculados por fatores de transcrição11,12. Com injeções pró-nuclear, transgenes integrar normalmente como várias cópias em um único locus. Com vetores de Lentivirus, integração ocorre em múltiplos loci como uma única cópia por locus10,13. Portanto, a multiplicidade dos loci integrado é provavelmente associada a penetrância de expressão muito alta observada em fundadores transgénicos, que faz com que o novo modelo gerado mais robusto.
Importante, quando usando injeção pró-nuclear do ADN, visualização dos pró-núcleos durante o procedimento é absolutamente necessária. Essa limitação técnica impede o uso de oócitos fertilizados, provenientes de uma grande variedade de estirpes de rato. Portanto, a produção de um modelo transgênico em uma determinada tensão para qual pró-núcleos são invisíveis exige a produção de animais em uma cepa permissiva, seguido pelo menos 10 sucessivos retrocruzamentos para transferir o transgene no mouse desejado estirpe. Com as injeções de vetor de Lentivirus, perivitelline espaço é sempre visível e a injeção não requer habilidades altamente específicas. Por exemplo, ratos transgénicos de NOD/SCID que não são apropriados para injeção de pró-núcleos foram obtidos com o vector viral injeções14.
Aqui, apresenta-se um protocolo abrangente para permitir que a simples produção de camundongos transgênicos usando injeções de vetor de Lentivirus no espaço perivitelline de um embrião de fase de uma célula. Expressão do transgene controlada com qualquer onipresente ou promotores específicos de célula é descrito em detalhes.
O backbone de Lentivirus de ΔU3 de pTrip foi usado no presente estudo15. Esse vetor permite produzir vetores de Lentivirus defeituoso replicação, no qual a sequência de U3 foi parcialmente excluída para remover a atividade de promotor U3 e gerar um self inactivating vector (SIN)16. Estoques de vetor de Lentivirus foram produzidos por transfecção transiente de células HEK-293T com o p8.91 encapsulamento do plasmídeo (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, a codificação a estomatite vesicular (VSV) de vírus glicoproteína-G17e o ΔU3 de pTRIP pHCMV-G vector recombinante. O processo de produção detalhado é fornecido como métodos complementares.
Produção das unidades populacionais de vetor de Lentivirus de alta concentração é realizada em condições de biossegurança nível II (BSL-2). Isto é verdade para a maioria dos transgenes exceto oncogenes que têm de ser produzidos em BSL-3. Portanto, a produção em condições de BSL-2 para a maioria dos casos é suficiente. Além disso, o uso e a produção são geralmente desconectados para a maioria das agências reguladoras nacionais, lidando com organismos geneticamente modificados (OGM). Quantidades limitadas de replicação incompetente SIN Lentivirus vetores (abaixo de 2 µ g da proteína do capsídeo p24) podem ser usadas sob condições de BSL-1 conforme descrito pela agência francesa OGM, de acordo com as recomendações da União Europeia.

<table><tbody><tr><td>PMSG 50UI</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>hCG 5000UI</td><td>Sigma</td><td>CG5-1VL</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 100 mm</td><td>Dutsher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4 poços Prato Nunc</td><td>Dutsher</td><td>56469</td><td>prato de fertilização in vitro</td></tr><tr><td>M2 médio</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 médio</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Filtro de seringa</td><td>Dutsher</td><td>146611</td><td></td></tr><tr><td>Enzima Hialuronidase 30mg</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>embrião de camundongo testado</td></tr><tr><td>Insulina serynge</td><td>VWR</td><td>613-3867</td><td>Terumo Myjector</td></tr><tr><td>Pinça curva</td><td>Moria</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura curva</td><td>Moria</td><td>MC26</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Aparelho Harvard</td><td>GC 100-10</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta horizontal</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>Transferman NK2 5188</td><td>A iluminação de contraste de modulação Hoffman é necessária</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Eppendorf</td><td>Celltram air</td><td></td></tr><tr><td>Controler de pipeta de retenção</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>embrião de rato testado</td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td>Pode ser usado para injetar DNA ou vetores virais</td></tr><tr><td>Dumont # 5 pinças</td><td>Moria</td><td>MC 40</td><td></td></tr><tr><td>vannas micro tesoura</td><td>Moria</td><td>9600</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>centravet</td><td>ISO005</td><td>ISO-VET 100% 250ml</td></tr><tr><td>ocrygel</td><td>centravet</td><td>OCR002</td><td></td></tr><tr><td>Povidona iodure</td><td>centravet</td><td>VET001</td><td>vetedina 120ml</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>centravet</td><td>BUP002</td><td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Cloridrato de Trizma</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>proteinase em pó</td></tr><tr><td>K</td><td>Sigma</td><td>P2308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>oneTaq kit</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tira de 8 tubos</td><td>PCR 4titude 4ti-0781</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 poços termociclador</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Veriti</td></tr><tr><td>Genomic DNA mini kit</td><td>invitrogen</td><td>K1820-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Master mix</td><td>Roche</td><td>4887352001</td><td>SYBR Green&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa multipoços 384</td><td>Roche</td><td>5217555001</td><td></td></tr><tr><td>instrumento qPCR 384 poços</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480</td></tr></tbody></table>

particulas de lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Há quase 40 anos, injeção de DNA pró-nuclear representa o método padrão para gerar ratos transgénicos com integração aleatória de transgenes. Um procedimento de rotina é amplamente utilizado em todo o mundo e sua principal limitação reside na eficácia da integração do transgene, resultando em um baixo rendimento dos animais fundador pobre. Apenas alguns por cento dos animais nascidos após a implantação de oócitos fertilizados injetados integraram o transgene. Em contraste, Lentivirus vetores são ferramentas poderosas para a transferência de genes integrativa e sua utilização para transduce oócitos fertilizados permite uma produção altamente eficiente do fundador ratos transgénicos com um rendimento médio acima de 70%. Além disso, toda a tensão do mouse pode ser usada para produzir animais transgénicos e a penetrância da expressão do transgene é extremamente elevada, acima de 80% com particulas de Lentivirus transgênese mediada comparado a microinjeção de DNA. O tamanho do fragmento de DNA que pode ser a carga pelo vetor de Lentivirus é limitado a 10 kb e representa a principal limitação deste método. Usando um simples e fácil de executar o procedimento de injeção por baixo da zona pelúcida de oócitos fertilizados, mais de 50 animais do fundador podem ser produzidos em uma única sessão da microinjeção. Tal método é altamente adaptado para executar, diretamente em animais fundador, ganho rápido e perda de estudos de função ou de regiões de DNA genômicas tela por sua capacidade de controlar e regular o gene expressão na vivo.

Animais transgénicos foram gerados usando o protocolo aqui apresentado. Representante resultados ambos onipresente e expressão de transgene específica de tipo de célula são ilustrados.
Expressão constitutiva de transgenes
Promotores onipresentes são ferramentas de pesquisa básica para expressar transgenes de forma sustentada e eficiente. Esses promotor...

Aqui, apresentamos um protocolo para promover a integração do transgene e produção de ratos transgénicos fundador com eficácia elevada por uma simples injeção de um vetor de Lentivirus no espaço de um oócito fertilizado perivitelline.

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Este método permite uma rápida triagem in vivo em camundongos, do efeito de um transgene, e é especificamente adaptado para realizar estudos de ganho ou perda de função, bem como um mapeamento de resposta e motivo de DNA. A principal vantagem dessa técnica é que o uso de previsão de animais transgênicos está acima de 70% do recém-nascido e pode ser aplicado a qualquer cepa de camundongos, incluindo animais transgênicos. Depois de eutanásia dos ratos, colete os ovidutos.Para começar a cirurgia, use uma tesoura para fazer uma grande incisão horizontal na cavidade abdominal. Em seguida, localize o oviduto entre o útero e o ovário. Em seguida, use fórceps curvos para remover o mesomário e a membrana com os vasos sanguíneos proeminentes.Em seguida, separe o oviduto do ovário e disseca o oviduto do ovário. Em seguida, puxe o oviduto e corte para longe do útero. Transfira todos os ovidutos coletados para m2 médios em temperatura ambiente.Ao manusear os ovidutos, tenha cuidado para evitar tocar na ampola inchada carregada com ovos fertilizados. Em seguida, adicione uma gota de 100 microliteres de solução de trabalho de hialuronidase a um prato de 10 centímetros. Em seguida, transfira os do

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Este vídeo descreve a injeção pronuclear de vetores lentivirais no espaço perivitelino de um embrião de camundongo fertilizado. O lentivírus contém o transgene, que é incorporado ao genoma do embrião fertilizado, dando origem a camundongos transgênicos.

Injeção de perivitelina baseada em vetor lentiviral: um método para transduzir o gene de interesse em oócitos de camundongo unicelular fertilizados

Este vídeo demonstra a marcação viral e o transplante de células de eminência ganglionar medial (MGE) para estudos in vivo. Ele descreve as etapas envolvidas na transdução de células MGE com um repórter viral, transplantando essas células transduzidas para o córtex de um filhote de camundongo e permitindo a expressão do repórter em subtipos específicos de interneurônios.

Marcação e transplante mediados por vírus de células de eminência ganglionar medial para estudos in vivo

MicroRNAs têm papéis importantes na estrutura e função cerebral. Aqui nós descrevemos um método para impor miRNA hipocampo sobre-expressão usando a injeção estereotáxica de um lentivírus miRNA-expressando engenharia. Esta abordagem pode servir como um modo relativamente rápido para avaliar...

Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

Aqui descrevemos um procedimento baseado no uso de partículas lentivirais para a modificação genética de longo prazo de células-tronco neurais e/ou suas células ependimárias adjacentes no nicho neurogênico ventricular-subventricular adulto que permite a análise separada de efeitos celulares autônomos e não autônomos, dependentes de nicho em células-tronco neurais.

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem.

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

Mouse de ovos fertilizados e embriões adiantados do palco são protegidos pela zona pelúcida, uma matriz de glicoproteína que forma uma barreira contra a entrega do gene. Este artigo descreve um protocolo para perfurar a zona com um laser para transduce células embrionárias com vetores Lentivirus e criar ratos transgénicos.

Entrega de gene lentiviral assistida por laser em óvulos fertilizados de camundongos

Este protocolo descreve as etapas necessárias para gerar um modelo de sistema em que a transcrição de um gene endógeno de interesse pode ser condicionalmente controlada em animais vivos ou células usando reforçada ALC repressor e/ou sistemas de ativador de tet .

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

Este artigo tem como objetivo fornecer a metodologia para transgênese lentiviral em embriões de ratos usando múltiplas injeções de uma suspensão do vírus no espaço de perivitelline zigogote. Ratos fêmeas que são acasalados com uma cepa masculina fértil com uma cor de pele dominante diferente é usado para gerar mães adotivas pseudográvidas.

Geração de ratos transgênicos usando uma abordagem vetorial lentiviral

Aqui, um protocolo de produção de AAV baseado em células HEK293 de suspensão é apresentado, resultando em tempo e mão de obra reduzidos necessários para a produção de vetores usando componentes que estão disponíveis para fins de pesquisa de fornecedores comerciais.

Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293

Aprenda a produzir camundongos transgênicos com alta eficiência usando injeção de vetores lentivirais no espaço perivitelino. Este método simples permite triagem rápida in vivo de efeitos de transgenes em modelos murinos.

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores (Vídeo) | JoVE Journal

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

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