Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento

O objetivo deste protocolo é sequenciar o genoma de um organismo microscópico chamado tardígrados. Estabelecemos um método para sequenciar o genoma de um tardígrado, Hypsibius dujardini, a partir de um único espécime com apenas 50 picogramas de DNA genômico com uma aplicação de genoma completo. Depois de isolar um único tardígrado, minimizamos a contaminação bacteriana usando antibióticos e inspeção visual.

Também utilizamos dois métodos de homogeneização. Primeiro e mais comumente usado em C.elegans usando ciclos de congelamento e descongelamento e, segundo, uma britagem manual do tardígrado com uma ponta de pipeta. O DNA é então usado para construir uma biblioteca de sequenciamento e, em seguida, é sequenciado em um instrumento MiSeq.

Um resumo geral do protocolo. Após o isolamento de um único indivíduo, ele é submetido a três ciclos de congelamento e descongelamento para homogeneização. O DNA genômico é extraído e purificado e fragmentado por sonicação.

Em seguida, uma biblioteca de sequenciamento é construída e, após a validação da distribuição do tamanho da biblioteca, ela é sequenciada com um instrumento de sequenciamento. Prepare o gel de agarose 2% usando água destilada como solvente em uma placa de cultura de plástico de 90 milímetros e 10 milímetros de estreptomicina de penicilina a 1% com água destilada. O gel pode ser armazenado por duas a três semanas em uma incubadora ajustada a 18 graus.

Colete um único tardígrado e coloque na placa de ágar preparada e lave com água destilada duas a três vezes para remover as partículas restantes. Coloque o tardígrado único em antibióticos estreptomicina penicilina por duas a seis horas para remover a contaminação bacteriana e coloque o animal descontaminado em um vidro limpo usando uma pipeta P10. Observe o tardígrado ao microscópio com ampliação de 500 vezes e confirme se não há bactérias remanescentes.

Colete o indivíduo usando uma pipeta P10 com no máximo cinco microlitros de líquido e coloque em um tubo de PCR de baixa ligação e remova o excesso de líquido o máximo possível. Homogeneização e extração de DNA. Homogeneizar o animal para obter DNA genômico com um dos seguintes métodos.

Homogeneização com ciclos de congelamento e descongelamento. Imediatamente após a etapa 2.5, adicione 100 microlitros de tampão de lise ao tubo de PCR contendo o tardígrado. Coloque o tubo de PCR em nitrogênio líquido por 10 minutos e passe para um bloco de calor, aqueça a 37 graus por 10 minutos.

Repita esta etapa três vezes. Britagem manual. Sob um microscópio estereoscópico, esmague o indivíduo com uma ponta de pipeta P10 pressionando o animal contra a parede do tubo de PCR e adicione imediatamente 100 microlitros de tampão de lise.

Incube por 30 minutos em temperatura ambiente para que ocorra a lise. Transfira o volume completo da mistura de lise para um microtubo limpo de baixa ligação de 1,5 mililitros. Adicione 100 microlitros de tampão de lise ao tubo de PCR de baixa ligação, que é usado para homogeneização e agora está vazio.

E após a pipetagem, transfira a mistura para 1,5 microtubo de baixa ligação. Repita esta etapa duas vezes. Adicione 300 microlitros de tampão de lise a um tubo de PCR de baixa ligação e, após a pipetagem, mova a mistura para um microtubo de baixa ligação de 1,5 mililitro.

Adicione o total de 600 microlitros de mistura de lise à coluna de centrifugação colocada no tubo de coleta e centrifugue a 10.000 G por um minuto. Reaplicar o fluxo até à coluna e centrifugar a 10 000 g durante um minuto. Esta etapa é crítica para garantir que a maior parte do DNA genômico esteja ligada à coluna.

Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem à coluna de centrifugação e centrifugue a 10.000 G por um minuto. Transfira a coluna de centrifugação para um microtubo limpo de 1,5 mililitro. Aplique 20 microlitros de 10 milimolares primeiro ACL na coluna de centrifugação e aguarde cinco minutos em temperatura ambiente.

Centrifugar a 10 000 g durante um minuto. O tampão de diluição não deve conter EDTA, pois interfere com as enzimas de preparação laboratorial. Reaplique o fluxo até a coluna de centrifugação e, após cinco minutos de incubação à temperatura ambiente, centrifugue por um minuto a 10.000 G. Construção da biblioteca de sequenciamento.

Fragmentação do DNA. Transfira 15 microlitros de eluição de DNA genômico para um microtubo de 15 microlitros para fragmentação do DNA e centrifugue por um minuto usando uma centrífuga de mesa. Fragmente o DNA genômico em 550 pares de bases.

Após a pipetagem, transfira 10 microlitros de mistura de DNA fragmentado para um tubo de PCR limpo e de baixa ligação. O experimento pode ser interrompido aqui. Preserve o DNA a quatro ou menos 20 graus.

Construção de biblioteca de sequenciamento. É absolutamente crítico usar o kit especificado nos procedimentos a seguir, devido ao DNA de baixa entrada. Prepare os reagentes necessários, seguindo o protocolo do fabricante, e construa a biblioteca de sequenciamento sem nenhuma modificação.

Depois de aplicar a mistura de amplificação de biblioteca a uma mistura de síntese de biblioteca, execute a reação de PCR em um termociclador. A reação de PCR foi conduzida conforme mostrado. Purificação da reação de PCR.

Adicione 50 microlitros de esferas magnéticas e pipete 10 vezes e centrifugue brevemente com uma microcentrífuga de mesa. Incube por dois minutos em temperatura ambiente. Incubar em suporte magnético durante cinco minutos, ou até que a solução fique completamente límpida, e remover o sobrenadante.

Siga o protocolo do fabricante. Transfira o sobrenadante sem perturbar o pellet para um novo tubo de PCR de baixa ligação. Verificação e quantificação da qualidade do DNA e sequenciamento.

Validação da distribuição do tamanho da biblioteca de DNA. Adicione três microlitros de água de amostra com um microlitro de biblioteca de sequenciamento e misture bem por um minuto com um vórtice e centrifugue brevemente com uma centrífuga de mesa. Realize eletroforese e valide a distribuição do tamanho da biblioteca com o software associado.

O pico do fragmento principal deve variar amplamente de cerca de 300 a 1.000 pares de bases. Quantificação de DNA. Adicione 796 microlitros do tampão da solução e quatro microlitros do reagente de fluorescência e misture bem.

Dispense 190 microlitros da solução de trabalho em dois tubos de ensaio e 197 microlitros em um tubo de ensaio. Adicione 10 microlitros de padrões com concentrações conhecidas de DNA a cada tubo de ensaio contendo 190 microlitros de solução de trabalho e três microlitros da biblioteca preparada para testar o tubo contendo 197 microlitros de solução de trabalho. Vortex brevemente e centrifugue na centrífuga de mesa.

Quantifique o DNA usando um fluorômetro com três configurações de microlitro. Sequenciamento da biblioteca de DNA. Prepare a biblioteca de sequenciamento com base no protocolo do fabricante.

Defina o de reagente e a célula de fluxo no instrumento de sequenciamento e insira as informações de execução do sequenciamento, seguindo o protocolo do fabricante. Execute o sequenciamento. Resultados representados.

A exposição de contaminantes na extração de DNA de alta qualidade continua sendo o ponto crítico em nosso protocolo. Para examinar visualmente se eles são contaminantes, incubamos o tardígrado em antibióticos, que são penicilina e estreptomicina, e também examinamos o indivíduo sob um microscópio de 500 vezes. Como mostrado aqui, micróbios visíveis ao redor dos tardígrados são completamente iluminados.

Após homogeneização eficiente, extração de DNA, fragmentação e preparação da biblioteca. A distribuição de tamanho da biblioteca é validada usando uma eletroforese de alta sensibilidade para controle de qualidade. As linhas roxa e verde indicam marcadores superior e inferior em 1, 500 e 25 pares de bases, respectivamente.

A pista L é um marcador de escada, a pista S e N1 a N4 são cinco réplicas do mesmo experimento, todas a partir de um único espécime de tardígrado. Como pode ser visto pelo amplo uniforme e distribuição entre 200 e 1.000 pares de bases, nosso protocolo é altamente reprodutível, mesmo com a entrada ultrabaixa. Aqui está o resultado do controle de qualidade rápido, para leituras sincronizadas obtidas de uma única execução de sequenciamento.

As leituras são obtidas como extremidades sobressalentes de 300 pares de bases, onde as leituras direta e reversa são mostradas na parte superior e inferior, respectivamente. A distribuição mostrada aqui é típica de leituras finais de 300 pares, com chamadas de base de altíssima qualidade acima de Q30 para os primeiros 200 pares de bases e diminuindo gradualmente até o final. Portanto, esse método usa apenas um único indivíduo para uma amostra.

Não há requisitos de grandes quantidades de animais, como os exigidos em projetos anteriores de sequenciamento do genoma de tardígrados. Os métodos de cultura para a maioria dos tardígrados ainda não foram estabelecidos. Portanto, permitir o sequenciamento genômico de um único indivíduo, como aqueles diretamente do trabalho de campo, terá um grande impacto na biologia molecular dos tardígrados e, possivelmente, em outros pequenos animais.

Nossos métodos de sequenciamento de DNA possibilitam a análise de outros numerosos organismos microscópicos que ainda não foram sequenciados, como espécies raras de hogweed, nematóides, abetos d'água e outras opções, conectando a parte das zonas e uma área pública mais ampla, promovendo o cenário onde vários mecanismos biológicos podem ser possíveis.