Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

O objetivo geral deste protocolo é fornecer acesso a olhos de galinha embrionários em um ambiente in vitro para permitir um estudo aprofundado de vias complexas de desenvolvimento no embrião. Na galinha embrionária, estudar o olho costuma ser difícil, devido ao desenvolvimento das pálpebras, ao movimento do embrião e ao crescimento de tecidos embrionários extras. Compostos como drogas e inibidores também podem ter efeitos letais no embrião, dificultando o uso desses compostos para modular as vias gênicas.

Os avanços na cultura de tecidos in vitro permitiram aos cientistas isolar esses tecidos e eliminar muitas dessas barreiras mencionadas. Nosso protocolo é vantajoso porque nos permite estudar o olho como um todo, incluindo todos os tecidos que têm o potencial de interagir durante o desenvolvimento, como a retina neural e o epitélio pigmentado da retina. Comece autoclavando os materiais para garantir que todas as soluções e equipamentos sejam estéreis antes do procedimento.

Para isso, autoclave dois litros de água destilada e um litro de soro fisiológico, juntamente com uma caixa de lenços de papel, papel de filtro semiporoso, tela de arame, recipientes de água e pipetas de vidro descartáveis. Esterilize completamente as prateleiras e a porta da incubadora usando etanol 70%, encha os recipientes com água destilada autoclavada e pré-aqueça a incubadora a 37 graus Celsius. Pré-aqueça o meio nutriente, juntamente com um tubo do antibiótico penicilina estreptomicina na incubadora.

Coloque uma toalha de papel no espaço de trabalho e esterilize com etanol a 70%. Esterilize todas as pinças e tesouras. Com a cabeça de galinha em solução salina autoclavada, corte a cabeça do pintinho na linha média, deixando um pouco de tecido intacto ao redor de cada olho.

O tecido extra ajudará o olho a manter alguma tensão na cultura, além de auxiliar na absorção de nutrientes por todo o olho e evitar que o olho escorregue do papel de filtro. Esses tecidos também servem como pontos de referência ao orientar o olho em análises posteriores. Deixe o tecido dissecado em soro fisiológico para pintinhos em temperatura ambiente enquanto prepara a cultura.

Prepare o prato de cultura. Coloque duas placas de Petri de 35 milímetros dentro de uma placa de Petri de 100 milímetros. Coloque um estágio de malha de arame em cada prato pequeno.

Coloque a meia cabeça com o olho em um pedaço de papel de filtro, inclinando levemente para garantir que o olho não escorregue do papel. Transfira o lenço e o papel de filtro para a pequena placa de Petri no topo do estágio de tela de arame. Repita com a outra meia cabeça do mesmo embrião.

Adicione meio de cultura a cada uma das duas pequenas placas de Petri. Traga o meio até o nível do papel de seda. Não mergulhe o tecido no meio.

Adicione 50 microlitros da solução estoque de antibiótico penicilina estreptomicina ao meio nutriente em cada placa para prevenir infecções bacterianas. Coloque um pedaço dobrado de tecido fino na borda interna da placa de Petri maior e umedeça-o com água destilada. Incube a cultura na incubadora escura a 37 graus Celsius por até quatro dias.

Após a cultura, remova o tecido do papel de filtro e fixe em 4% de paraformaldeído. A primeira coluna mostra um olho HH34, representando o olho embrionário do pintinho no início do cultivo. A segunda coluna mostra um olho de pintinho embrionário cultivado por quatro dias, começando em HH34.

A terceira coluna mostra um olho HH38, que corresponde a quatro dias de desenvolvimento in-ovo além do HH34. Os painéis A a F não são corados, enquanto os painéis G a I são corados para a enzima fosfatase alcalina. A linha superior, painéis A a C, mostra que o olho continua a se desenvolver ao longo da cultura, evidenciado pelo aparecimento de botões de penas e pelo crescimento das pálpebras, indicado por setas em cada painel.

A linha do meio, painéis D a F, mostra que as papilas conjuntivais começam a degenerar em cultura. A linha inferior, painéis G a I, mostra que o padrão espaço-temporal de indução do ossículo escleral é mantido em cultura, servindo como um exemplo de uma via de desenvolvimento que pode ser estudada usando este método. Este protocolo permite que os tecidos mantenham os principais aspectos espaciais e temporais do desenvolvimento ao longo de toda a cultura.

Este protocolo representa um avanço fundamental na cultura de órgãos sensoriais inteiros, fornecendo metodologia alternativa para estudar as intrincadas vias de desenvolvimento envolvidas.