Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp

Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa em neurociência, como caracterizar a população neurológica ou identificar fontes e alvos de sistemas de transmissão. A principal vantagem desta técnica é que ela permite determinar o perfil de expressão de um conjunto pré-selecionado de genes de uma única célula de forma rápida e fácil. Portanto, esse método pode fornecer informações sobre o mouse de diversidade aleatória.

Também pode ser aplicado a outros tipos de células, como astrócitos e em muitos modelos animais. Esta demonstração deste método é crítica, pois as etapas de detenção e aspiração podem ser difíceis de aprender porque os dados precisam de uma quantidade de citoplasma para serem analisados. Antes de seccionar, prepare um kit de dissecção contendo tesoura cirúrgica, tesoura de íris fina, duas espátulas, fórceps, um disco de filtro de papel e cola de cianoacrilato.

Em seguida, sature a solução de corte a frio com carbogyn e resfrie a câmara de corte a 20 graus Celsius negativos. Em seguida, remova o couro cabeludo do animal e abra o crânio. Extraia o cérebro com cuidado e coloque-o em um pequeno copo cheio de solução de corte a frio com gelo carbogenado.

Em seguida, remova a câmara de corte de 20 graus Celsius negativos e remova a umidade com uma toalha de papel. Disseque cuidadosamente o cérebro para isolar a região de interesse. Cole-o na câmara de corte e adicione a solução de corte fria e carboginada.

Usando um vibratone, corte fatias de 300 micrômetros de espessura. Transfira as fatias para uma câmara de repouso cheia de solução de corte oxigenada à temperatura ambiente e deixe-as recuperar por pelo menos 30 minutos. Para RT-PCR de célula única e caracterização de células alvo, limite o registro de células inteiras a não mais que 20 minutos para preservar a mRNAse.

No final da gravação, prepare um tubo de PCR de 500 microlitros preenchido com dois microlitros de mistura 5xRT e 0,5 microlitros de 20xDTT. Gire-o e guarde-o no gelo. Em seguida, colha o citoplasma da célula aplicando uma leve pressão negativa.

Monitore e controle o conteúdo da célula de entrar na pipeta, mantendo uma vedação firme e evite coletar o núcleo se alguns genes forem considerados. No caso do gene, é essencial evitar a coleta do núcleo e incluir um conjunto de primers destinados a amplificar o gDNA para se preparar para a contaminação geral. Se o núcleo estiver se aproximando da ponta da pipeta, libere a pressão negativa e afaste a pipeta.

Certifique-se de que o selo hermético seja preservado e reinicie a coleta do citoplasma no novo local da pipeta. Em seguida, retire a pipeta suavemente para formar um remendo de fora para fora para limitar a contaminação pelos detritos extracelulares e favorecer o fechamento da membrana celular para posterior análise histoquímica. Lembre-se de que protuberâncias, micromanipuladores, teclado de computador ou mouse de computador são fontes de contaminação por RNASE carregadas de prótons.

Se eles foram tocados durante a gravação, troque as luvas. Em seguida, conecte a pipeta ao expulsor e expulse seu conteúdo para o tubo de PCR aplicando pressão positiva. Quebre a ponta da pipeta no tubo de PCR para ajudar na coleta de seu conteúdo.

Em seguida, centrifugue brevemente o tubo, adicione 0,5 microlitros de inibidor de RNAse e 0,5 microlitros de RTAse. Misture delicadamente, centrifugue novamente e incube durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, gire o tubo e armazene-o a 80 graus Celsius negativos por vários meses.

Até a análise de PCR e realização da primeira etapa de amplicação. Para validar a PCR, misture e dilua um par de primers, adicione um micromolar com a pipeta dedicada ao RTPCR de célula única. Defina o termociclador por três minutos a 95 graus Celsius, execute 40 ciclos seguidos por uma etapa final de alongamento a 72 graus Celsius por cinco minutos.

Para minimizar a formação de dímeros de primer, execute uma partida a quente colocando os tubos de PCR no termociclador pré-aquecido a 95 graus Celsius. Após 30 segundos, expulse rapidamente 20 microlitros da mistura de primer por cima do óleo. Depois que o par de primers for validado, teste-o com o protocolo multiplex.

Misturar e diluir o primário externo a um micromolar. Armazene a mistura de primer multiplex a 20 graus Celsius negativos por várias semanas. Em seguida, prepare uma pré-mistura e coloque-a no gelo.

Agite o tubo de PCR e gire-o e adicione duas gotas de óleo mineral. Após três minutos a 95 graus Celsius, execute 20 ciclos de PCR. Efectue um arranque a quente conforme descrito com 20 microlitros de mistura de primários multiplex.

Em seguida, prepare um número de tubos de PCR idênticos ao número de genes que estão sendo analisados. Prepare uma pré-mistura usando um microlitro do primeiro produto de PCR por gene como modelo. Ajuste todos os volumes de acordo com o número de genes a serem analisados e considere o uso de 10% de volume extra para compensar erros de pipetagem.

Agite suavemente, gire o tubo e despache 80 microlitros de pré-mistura em cada tubo de PCR. Adicione duas gotas de óleo mineral por tubo sem tocar na parede ou na tampa dos tubos. Execute 35 ciclos de PCR e, em seguida, execute uma partida a quente expelindo 20 microlitros de mistura interna de primer.

Analisar os segundos projetos de PCR por eletroforese em gel de aragose. Um neurônio piramidal da camada cinco foi visualmente identificado por seu grande soma e um dendrito apical proeminente. O registro de células de tração revelou propriedades eletrofisiológicas típicas de neurônios de pico regulares da camada cinco com baixa resistência de entrada, potenciais de ação duradouros e adaptação pronunciada de frequência de pico.

A análise molecular desse neurônio revelou a expressão de vGluT1, confirmando seu fenótipo glutamidérgico. Este neurônio também expressou somatostatina e o ATP1-alfa-1 e três subunidades dos ATPAs de sódio-potássio. A marcação de biocitina dos neurônios registrados confirmou uma morfologia piramidal.

Como esperado dos neurônios glutamiterérgicos, a análise molecular de 26 células piramidais da camada cinco revelou a expressão de vGluT1, mas nenhum dos dois GADs. Uma vez que a técnica pode ser feita dentro de dois dias, se for pré-executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter muito cuidado para evitar contaminações.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sondar a expressão de 10s de genes simultaneamente a partir de células únicas caracterizadas por aglomerados de adesivos de acordo com fatias de cérebro, após a coleta de citoplasma, transcrição reversa e PCRs de início a quente. Não se esqueça de que trabalhar com brometo de etídio pode ser extremamente perigoso e precauções como usar luvas e jalecos devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.