Name: Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda RT-PCR multiplex de célula única após patch-clamp para análise de perfis de expressão gênica em neurônios piramidais da camada cinco. Este método permite caracterizar a diversidade celular em neurociência.

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Agradecemos o Dr. Alexandre Mourot por seus comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por concessões da Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 e ANR-17-CE37-0010-03), BLG é suportado pelo fellowship da Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Agradecemos a facilidade animal do IBPS (Paris, França).

Os autores não têm nada para divulgar.

Única célula multiplex RT-PCR após remendo-braçadeira pode sondar simultaneamente e de forma confiável a expressão de mais de 30 genes em células electrophysiologically identificadas5. Analisando a expressão do gene no nível da célula única requer iniciadores de PCR altamente eficientes. Um dos passos mais limitantes é a coleção de conteúdo da célula. Sua eficiência depende do diâmetro da ponta da pipeta de patch, que deve ser tão grande quanto possível enquanto o tamanho de pilha de correspondênc...

O córtex cerebral é composto por numerosos tipos de células envolvidos em vários processos fisiológicos. Sua identificação e caracterização, um pré-requisito para a compreensão de suas funções específicas, podem ser muito desafiadoras dada a grande diversidade morfológica, fisiológica e molecular que caracteriza tipos de célula cortical1 ,2,3,4.
Célula única multiplex RT-PCR baseia-se na combinação da remendo-braçadeira e técnicas de RT-PCR. Ele pode sondar simultaneamente a expressão de mais de 30 genes predefinidos em células electrophysiologically identificadas5. A inclusão de um marcador neuronal em gravação pipeta mais permite a caracterização morfológica das células gravadas após a revelação histochemical6,7,8,9, 10. é uma técnica muito útil para a classificação dos tipos neuronais com base na análise multivariada de suas características fenotípicas5,9,10,11,12 ,13,14. Única célula multiplex RT-PCR é também adequado para a caracterização de células não-neuronais como astrócitos15,16,17e pode ser aplicado virtualmente a cada cérebro estrutura18, 19,20,21,22,23 e célula tipo, supondo que eles podem ser gravados em configuração de células inteiras.
Esta técnica é muito conveniente para a identificação das fontes de celulares e/ou alvos de transmissão sistemas7,8,15,16,20,21, 24,25,26,,27,28, especialmente quando os anticorpos específicos são escassos. Ele se baseia em gravações de remendo-braçadeira de células visualmente identificados29e assim também permite a segmentação de células em um ambiente celular específico8,15,16. Além disso desde a cytoarchitecture do tecido cerebral é preservada em fatias do cérebro, essa abordagem também permite que o estudo das relações anatômicas das células caracterizadas com elementos neuronais e não-neuronal7,8 , 18.
Uma vez que esta técnica é limitada pela quantidade de citoplasma colhida e pela eficiência do RT, a detecção de mRNA, expressado em número de cópia baixa pode ser difícil. Embora outras abordagens baseadas na tecnologia RNaseq permitem analisar a transcriptoma inteira de células únicas3,4,30,31, não necessariamente precisam de sequenciadores caros elevado-throughput disponível para todos os laboratórios. Desde que a técnica de RT-PCR multiplex única célula usa pontos de extremidade do PCR, exige somente thermocyclers amplamente disponível. Ele pode ser facilmente desenvolvido em laboratórios equipados com instalações eletrofisiológicas e não requer equipamento caro. Ele pode fornecer, dentro de um dia, uma análise qualitativa da expressão de um conjunto predefinido de genes. Assim, esta abordagem oferece um fácil acesso para a caracterização molecular das células individuais de forma rápida.

<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>Alinhamento múltiplo para design de primer</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr><tr><td>Primers aleatórios</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4065-52</td><td>RT e PCR</td></tr><tr><td>RNasin Inibidores de ribonuclease</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptase reversa</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerase</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td> <td>PCR / dessalinizado e diluído a 200 &micro; Tubos M</td></tr><tr><td>, 0,5 mL, tampa plana</td><td>Série ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT e PCR</td></tr><tr><td>BT10 - 10 &micro; Ponta de Filtro L</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT e PCR</td></tr><tr><td>Série BT20 - 20 &micro; Ponta de Filtro L</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT e PCR</td></tr><tr><td>BT200 Series - 200 &micro; L Ponta de Filtro</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT e PCR</td></tr><tr><td>BT1000 Series - 1000 &micro; L Ponta de Filtro</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT e PCR</td></tr><tr><td>DNA Thermal Cylcer</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>E1510-10ML</td><td>Eletroforese em gel</td></tr> de <tr><td>agarose Tampão Tris-Borato-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>T4415-1L</td><td>Eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>UltraPure</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>Eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>&Phi; X174 DNA-Hae III Digest</td><td>NEB (New England BioLabs)</td> <td>N3026S</td><td>Eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>Kodak</td><td></td><td>Eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>Eletroforese Fonte de alimentação EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>Eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Modelo SHU13</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td> <td>Eletroforese</td></tr> <tr><td>em gel de agarosePapel liso com aparência acetinada</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>Patch clamp solução interna</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>60377</td><td>Patch clamp solução interna</td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter) -N, N, N&prime;, N&prime;-ácido tetracético</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>E3889</td><td>Patch clamp solução interna</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H4034</td><td>Patch clamp solução interna</td></tr><tr><td>D-gluconato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G4500</td><td>Patch clamp solução interna</td></tr><tr><td>Solução de cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M1028</td><td>Patch clamp solução interna</td></tr><tr><td>5500 Osmômetro de pressão de vapor</td><td>Wescor</td><td></td><td>Patch clamp solução interna</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B4261</td><td>Solução interna de patch clamp</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5016</td><td>Preparação de fatia</td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose monohidratada</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>49159</td><td>Preparação de fatia</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S6191</td><td>Preparação de fatia</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60128</td><td>Preparação de fatia</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>31437-M</td><td>Preparação de fatias</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5011</td><td>Preparação de fatias</td></tr><tr><td>Solução de cloreto</td><td>de magnésio Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>63069</td><td>Preparação de fatias</td></tr><tr><td>Solução de cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>21115</td><td>Preparação de</td></tr> <tr>fatias<td>Ácido quinurênico</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>Preparação de fatias</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>Preparação de fatias</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>Preparação de fatias</td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>Patch Clamp limpeza de configuração</td></tr><tr><td>Parede fina Capilares de vidro com filamento</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Narishige</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>BX51WI Microscópio vertical</td><td>Olympus</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>XC-ST70 / CE CCD B / W CÂMERA DE VÍDEO</td><td>Sony</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplificador</td><td>Patch Clamp da Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Patch Clamp</td>da <td>Molecular Devices</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 pacote de software</td><td>Seringa Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>E Series com Corpo Reto (Suporte)</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>S7907</td><td>Revelação histoquímica</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>S8282</td><td>Revelação histoquímica</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>P6148</td><td>Revelação histoquímica</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>X100</td><td>Revelação histoquímica</td></tr><tr><td>Gelatina de pele</td> <td>de peixe de água friaSigma-Aldrich (Merck)</td> <td>G7041</td><td>Revelação histoquímica</td></tr><tr><td>Estreptavidina, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>Revelação histoquímica</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>Revelação histoquímica</td></tr></tbody></table>

Única célula transcrição reversa multiplex cadeia da polimerase após patch-clamp

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

O córtex cerebral é composto de numerosos tipos de células exibindo várias características morfológicas, fisiológicas e moleculares. Esta diversidade dificulta a fácil identificação e caracterização destes tipos de células, os pré-requisitos para estudar suas funções específicas. Este artigo descreve o multiplex única célula transcrição reversa do polymerase reação em cadeia (RT-PCR) protocolo, que permite, depois da gravação em fatias, remendo-braçadeira para detectar, simultaneamente, a expressão de dezenas de genes em uma única célula. Este método simples pode ser implementado com caracterização morfológica e é amplamente aplicável para determinar as características fenotípicas de vários tipos de células e seu ambiente celular particular, como na proximidade de vasos sanguíneos. O princípio do presente protocolo é gravar uma célula com a técnica patch-clamp, colheita e inverter transcreva seu conteúdo citoplasmático, e para detectar qualitativamente a expressão de um conjunto predefinido de genes por multiplex PCR. Requer um design cuidadoso dos iniciadores de PCR e intracelular remendo-braçadeira solução compatível com RT-PCR. Para garantir uma transcrição seletiva e confiável detecção, esta técnica também exige controles apropriados do citoplasma colheita às etapas de amplificação. Embora discutido aqui deve ser rigorosamente as precauções, praticamente qualquer laboratório eletrofisiológico pode usar célula única técnica de RT-PCR multiplex.

Uma validação representante de RT-PCR multiplex é mostrada na Figura 3. O protocolo foi concebido para sondar, simultaneamente, a expressão de 12 diferentes genes. O vGluT1 de transporte vesicular glutamato foi tomada como um controle positivo para glutamatérgico neurônios42. O GABA sintetizando enzimas (GAD65 e 67 GAD), neuropeptídeo Y (NPY) e somatostatina (SOM) foram utilizados como marcadores de gabaérgica interneurônios<sup class=...

Este protocolo descreve os passos críticos e as precauções necessárias para executar a única célula multiplex transcrição reversa reação em cadeia da polimerase após remendo-braçadeira. Esta técnica é um método simples e eficaz para analisar o perfil de expressão de um conjunto predeterminado de genes de uma única célula caracterizada por gravações de remendo-braçadeira.

Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa em neurociência, como caracterizar a população neurológica ou identificar fontes e alvos de sistemas de transmissão. A principal vantagem desta técnica é que ela permite determinar o perfil de expressão de um conjunto pré-selecionado de genes de uma única célula de forma rápida e fácil. Portanto, esse método pode fornecer informações sobre o mouse de diversidade aleatória.Também pode ser aplicado a outros tipos de células, como astrócitos e em muitos modelos animais. Esta demonstração deste método é crítica, pois as etapas de detenção e aspiração podem ser difíceis de aprender porque os dados precisam de uma quantidade de citoplasma para serem analisados. Antes de seccionar, prepare um kit de dissecção contendo tesoura cirúrgica, tesoura de íris fina, duas espátulas, fórceps, um disco de filtro de papel e cola de cianoacrilato.Em seguida, sature a solução de corte a frio com carbogyn e resfrie a câmara de corte a 20 graus Celsius negativos. Em seguida, remova o couro cabeludo do animal e abra o crânio. Extraia o cérebro com cuidado e coloque-o em um pequeno copo cheio de solução de corte a frio com gelo carbogenado.Em

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

Neurônios são os primeiros caracterizada eletrofisiologicamente. Em seguida, o citoplasma do neurônio gravado é aspirado e submetido a transcrição reversa-PCR para detectar a expressão de mRNAs de enzimas neurotransmissor síntese, canais iônicos e receptores.

Perfil de tensão-gated Expressão mRNA canais de potássio em neurônios da substância negra usando uma única célula RT-PCR Técnicas

Perfil de expressão única célula permite a análise detalhada de expressão gênica de células individuais. Descrevemos métodos para o isolamento dos cardiomiócitos, e preparar a lisados ​​resultando tanto para microarray transcriptoma todo ou qPCR de metas específicas.

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

Um método para o isolamento de um único células da retina e amplificação subsequente dos seus ADNc é descrito. Unicelulares Transcritômica revela o grau de heterogeneidade celular presente num tecido e descobre genes novo marcador de populações de células raras. O protocolo que acompanha pode ser ajustado para se adequar muitos tipos de células diferentes.

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Este protocolo descreve uma técnica chamada eletrofisiologia de patch clamp de célula inteira, que é um método para estudar propriedades elétricas de neurônios de Mauthner e outras células reticuloespinhais em embriões de peixe-zebra.

Eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras: um método para estudar as propriedades elétricas dos neurônios

Multi-eletrodo gravações de patch-clamp constitui uma tarefa complexa. Aqui nós mostramos como, através da automatização de muitas das etapas experimentais, é possível acelerar o processo conducente à melhoria qualitativa no desempenho e número de gravações.

A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Este protocolo descreve a forma de avaliar a expressão de uma grande variedade de genes ao nível clonal. De uma única célula RT-qPCR produz resultados altamente confiáveis, com uma forte sensibilidade para centenas de amostras e genes.

Expressão Gênica de uma única célula Usando Multiplex RT-qPCR Caracterizar Heterogeneidade de rara populações linfóides

Este artigo descreve como a seletividade iônica da channelrodopsina é determinada com registros eletrofisiológicos de patch-clamp de células inteiras usando células HEK293. Aqui, o procedimento experimental para investigar a seletividade de cloreto de uma channelrodopsina seletiva de ânions é demonstrado. No entanto, o procedimento é transferível para outras canalrodopsinas de seletividade distinta.

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

Aprenda RT-PCR multiplex de célula única após patch-clamp para análise de perfis de expressão gênica em neurônios piramidais da camada cinco. Este método permite caracterizar a diversidade celular em neurociência.

Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp

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