Investigando a germinação de Teliospore usando a análise de Microrespiration e Microdissection

O objetivo geral dos procedimentos apresentados aqui é identificar estágios de germinação de esporos para que os níveis de transcrição gênica possam ser avaliados. A análise dessas mudanças fornecerá mais conhecimento de um estágio crítico na dispersão da doença. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre transições durante a germinação de teliósporos que estão ligadas a mudanças nos níveis de transcrição gênica e, portanto, refletem mudanças no controle da expressão gênica.

As principais vantagens desta técnica são que ela identifica transições no nível de respiração que não correspondem a interruptores morfológicos visíveis e permite o isolamento físico de teliósporos em estágios distintos de germinação. Essa técnica tem implicações para o controle da disseminação do patógeno, pois permite identificar transições importantes na germinação de esporos, que, se alteradas, podem bloquear a disseminação da doença. Comece este procedimento com infecção por espiga de milho, colheita de teliósporos, bem como viabilidade de teliósporos e teste de germinação, conforme descrito no protocolo de texto.

Para induzir a germinação, primeiro pese uma quantidade igual de teliósporos para cada experimento de respiração. Em um gabinete de biossegurança, adicione os teliósporos a uma câmara de respiração autoclavada. Encha a câmara com caldo de batata dextrose, suplementado com sulfato de estreptomicina e sulfato de canamicina.

Pipete para cima e para baixo para criar uma suspensão de teliósporos. Coloque a tampa da câmara na câmara para criar uma vedação hermética. Para obter a medição de OCR, primeiro coloque a câmara no rack da câmara dentro de um banho-maria.

Em seguida, coloque a sonda de oxigênio dentro da abertura da câmara. Monitore os pontos de dados que aparecem em tempo real no programa de taxa de rastreamento do sensor. Deixe a sonda estabilizar por aproximadamente três minutos após a sonda ser colocada na câmara.

Clique em Medir para medir os níveis de oxigênio continuamente por seis horas com medições registradas em intervalos de dois segundos. Pare a medição e repita essas etapas para cada amostra a ser analisada antes de exportar os dados para o Microsoft Excel e executar a análise de dados conforme descrito no protocolo de texto. Coloque aproximadamente 10 miligramas de teliósporos umatus em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Suspenda os teliósporos em 500 microlitros de PDB suplementado com sulfato de estreptomicina. Pipete suavemente para misturar até que não haja aglomerados de teliósporos no meio. Transferir a suspensão de teliósporos para um balão Erlin Meyer de 250 mililitros autoclavado, contendo PDB, suplementado com sulfato de estreptomicina.

Incubar o balão durante a noite a 28 graus Celsius, agitando a 90 RPM. Prepare uma placa de Petri pipetando quatro a cinco gotas de cinco microlitros de água destilada na parte superior da placa de Petri. Em seguida, pipetar três gotículas de dois microlitros de solução de estabilização de RNA na placa de Petri para serem usadas para coleta de amostras.

Pipetar também 30 gotículas de cinco microlitros de teliósporos em germinação na placa de Petri. Adicione 15 mililitros de óleo mineral à placa de Petri. Certifique-se de que todas as gotículas estejam cobertas por óleo antes de prosseguir.

Em seguida, prepare um microcapilar com um diâmetro intermediário de 15 mícrons, flange de um milímetro, comprimento de 55 mililitros e um ângulo de ponta de 20 graus. Coloque-o no suporte microcapilar e mergulhe-o no óleo mineral, onde a ação capilar permitirá que o óleo mineral entre no microcapilar. Libere a pressão no microcapilar antes de trazê-lo para a gota de água.

Aspire para preparar o microcapilar com água. Usando os controles do micromanipulador, mova o microcapilar preparado para uma das gotículas de germinação e penetre na gota. Abaixe o microcapilar e traga a boca do microcapilar até um teliósporo em germinação no estágio de germinação de interesse.

Aspire lentamente para capturar o teliósporo em germinação. Pare de aspirar assim que o teliósporo entrar no microcapilar. Repita até que haja aproximadamente cinco teliósporos no microcapilar.

Eleve o microcapilar com o micromanipulador e leve-o para a gota de coleta da solução de estabilização de RNA. Penetre na gotícula e injete os teliósporos na gota. Repita essas etapas até que aproximadamente 1.000 teliósporos tenham sido capturados.

Para recuperar a gota de coleta, pipete a gota de coleta e transfira-a para a tampa do tubo de microcentfuga livre de 2,0 mililitros do DNA de um RNA. Cuidadosamente o óleo mineral com a pipeta, sem perturbar a gota de coleta. Os teliósporos agora podem ser usados para aplicações a jusante, como isolamento de RNA.

Este gráfico ilustra um resultado típico da avaliação das mudanças no nível de oxigênio em suspensões de teliósporos induzidos a germinar. Em relação aos teliósporos não induzidos, a separação que indica o início da respiração ocorre em cerca de 30 minutos. Considerando que leva cerca de 15 minutos para configurar e transportar a amostra para a sonda de oxigênio, esse tempo é na verdade de 45 minutos.

Aqui são mostrados os cinco estágios da germinação dos teliósporos. No estágio um, os teliósporos são induzidos a germinar, mas não mostram sinais morfológicos de germinação. Os teliósporos do estágio dois mostram um promicélio emergido com um comprimento menor que o diâmetro do teliósporo.

No estágio três, o comprimento do promicélio é maior que o diâmetro do teliósporo. O estágio quatro é caracterizado por promicélios com basidiósporos aderidos. E no estágio cinco, há basidiósporos brotando.

Aqui, os teliósporos de germinação assíncrona são mostrados e o microcapilar é posicionado próximo a um teliósporo de estágio três. O teliósporo do estágio três é então aspirado para o microcapilar e transferido para uma gota de solução de coleta. Uma vez dominada, esta técnica de microdissecção pode ser usada para isolar 1.000 teliósporos específicos do estágio em seis a sete horas.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fazer pausas frequentes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar fisicamente os esporos em estágios morfologicamente distintos de germinação. E identifique o momento do início da respiração.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, devido à necessidade de manter a esterilidade. E a necessidade de paciência e isolamento de tipos de células por microdissecação. O desenvolvimento dessa técnica abre caminho para que os patologistas de plantas fúngicas explorem os aspectos morfológicos e moleculares da germinação em fungos devastadores de carvão e ferrugem que ameaçam a segurança alimentar global.

Embora essa técnica se aplique a nós, ligomatistas, ela também pode ser usada em muitos outros patógenos agrícolas devastadores que resultam em bilhões de dólares em perdas anualmente. Após este procedimento, outros métodos, como o isolamento de RNA, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como, qual é o perfil e o momento da mudança no nível de transcrição?