Name: Investigando a germinação de Teliospore usando a análise de Microrespiration e Microdissection (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a analisar a germinação de teliósporos em fungos causadores de doenças agrícolas usando microrespiração e microdissecção. Este método permite isolar estágios específicos e estudar mudanças metabólicas e de expressão gênica.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Paul Frost para uso de seu microrespirometer e Nicole Wagner e Alex Bell para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por uma bolsa NSERC para B.J.S.

1. infecção de espiga de milho
<ol><li>Crescer Zea mays (CV. Golden Bantam) até que as espigas são formadas e começaram a seda (aproximadamente 60 dias).</li>
	<li>Cultura haploides compatíveis U. maydis cepas usando protocolos padrão como anteriormente descrito7.</li>
	<li>Infectar as espigas de milho usando protocolos padrão, como descrito anteriormente,7.</li>
</ol>2. teliospore colheita
<ol><li>Equipamento de autoclave (funil de Büchner, frascos de Büchner, liquidificadores, garrafas de 250 mL centrífuga, espátulas planas e água) usando um padrão seco ciclo com pelo menos 30 min esterilização a 121 ° C (ciclo líquido padrão para água).</li>
	<li>Remova infectadas espigas de plantas (aproximadamente infecção de postagem de 28-35 dias) usando uma navalha e coloque as espigas em uma bandeja coberta de protetor de banco.</li>
	<li>Remover os tumores de espigas com uma lâmina de barbear e recolher num copo.</li>
	<li>Encher um copo de liquidificador de laboratório de 250 mL com tumores até aproximadamente 1/3 completo e adicionar autoclavado dH2O até o copo do liquidificador é de aproximadamente 3/4 completo. Perturbar os tumores por pulsando o misturador no ponto baixo, até homogeneizado.</li>
	<li>Conecte a bomba de vácuo para uma armadilha de água e em seguida para um balão de Büchner de 1 L.</li>
	<li>Inserir o balão grande funil de Büchner e forre o fundo do funil de Büchner com quatro camadas de gaze.</li>
	<li>Ligue a bomba de vácuo.</li>
	<li>Despeje uma porção dos tumores homogeneizadas através da gaze de algodão e raspar com uma espátula.</li>
	<li>Despeje algumas dH2O pano a fim de liberar os teliospores através de.</li>
	<li>Repita até o dH2O passando a gaze é claro.</li>
	<li>Torça o pano contendo o material homogeneizado tumor no filtro para garantir a recuperação máxima teliospore.</li>
	<li>Quando o balão de Büchner 1L está ficando perto de cheio, esvazie-a em um Erlenmeyer de grande e reserve.</li>
	<li>Colocar um novo pedaço de gaze no filtro e repita os passos (2.7-2.12) até que todos os tumores foram interrompidos e filtrados.</li>
	<li>Despeje os teliospores filtradas em frascos de 250ml autoclavado centrífuga e centrifugar a 1.000 x g por 5 min e decante o sobrenadante.</li>
	<li>Repita a etapa 2.14 até todos os teliospores filtrados são peletizados por centrifugação.</li>
	<li>Suspenda as bolinhas em uma pequena quantidade de água e transferir para tubos de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 1.000 x g por 5 min e decante o sobrenadante.</li>
	<li>Suspender o pellet em aproximadamente 50 mL de dH2O, centrifugar os tubos a 1.000 x g por 5 min e decante o sobrenadante. Delicadamente raspe a camada superior cinza com uma espátula e deposite. Repita até que já não há uma camada de cinza por cima.</li>
	<li>Seca as amostras durante a noite num exsicador de vácuo.</li>
	<li>Loja teliospores secas a 4 ° C até o uso.</li>
	<li>
Se desejado, trate as teliospores com sulfato de cobre8 antes de induzir a germinar. Se não for tratada, em seguida, execute minuciosa análise microscópica dos teliospores para confirmar a amostra representa teliospores puras e é desprovida de bactérias ou outras contaminações.
	<ol>
<li>Pese cerca de 50 mg de teliospores em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione cerca de 1,0 mL de 0,75% CuSO4 para o tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo os teliospores. Pipete para cima e para baixo suspender os teliospores da solução de CuSO4 seguido de agitar a amostra durante 3 h.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 2.500 x g por 5 min e retire o sobrenadante. Resuspenda o pellet de teliospore com água estéril, repetir a centrifugação e remover o sobrenadante.</li>
		<li>Repita a etapa 2.21.3 mais duas vezes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. teliospore viabilidade e teste de germinação
<ol><li>Pese cerca de 10 mg de teliospores U. maydis em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para avaliar sua viabilidade e o tempo de germinação.</li>
	<li>Em uma armário de biossegurança, prepare batata dextrose caldo de carne (PDB, 24 g/L) suplementado com sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL).</li>
	<li>Suspenda os teliospores em 500 µ l do PDB. Delicadamente, pipete para misturar e quebrar todos os grupos de teliospores.</li>
	<li>Transferi a suspensão de teliospore para um esterilizada 250ml balão de Erlenmeyer contendo 10 mL de APO.</li>
	<li>Incube o frasco a 28 ° C, agitando a 90 rpm para 12-16 h.</li>
	<li>Em uma armário de biossegurança, retire uma amostra de 20 µ l dos teliospores induzido a germinar e preparar uma lâmina de microscópio.</li>
	<li>
Usando um microscópio, visualmente avalie estágios de germinação que estão presentes e a presença de contaminação bacteriana.
	<ol>
<li>Contar o número de teliospores em encena através de V usando um hemocytometer e determinar a porcentagem que tem germinado.</li>
		<li>Se única fase I teliospores estão presentes, continuar a incubar o frasco para um total de 24 h antes de avaliar a germinação de teliospore. Continue a incubação por um período máximo de 48 h antes de considerar a amostra inviáveis.</li>
		<li>Se houver contaminação bacteriana, completar o PDB com sulfato de canamicina (50 µ g/mL) bem como sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL) e em seguida, repita as etapas de 3.1 a 3.7. Se persistir de contaminação bacteriana, tratar teliospores com sulfato de cobre e repita as etapas de 3.1 a 3.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. indução da germinação para monitorização da respiração
<ol><li>Pesar a quantidade igual (ex., 50 mg) de teliospores para cada experiência de respiração.</li>
	<li>Em uma armário de biossegurança, adicione teliospores para uma câmara de respiração autoclavados.</li>
	<li>Encher a câmara com PDB (24 g/L) suplementado com sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL) e sulfato de canamicina (50 µ g/mL).</li>
	<li>Pipete para cima e para baixo para criar uma suspensão de teliospore.</li>
	<li>Coloque a tampa de câmara na câmara para criar vedação hermética.</li>
</ol>5. obtenção de medições de taxa (OCR) de consumo de oxigênio
<ol><li>Coloque a câmara no rack câmara dentro de um banho de água (pré-aquecido a 28 ° C).</li>
	<li>Coloque a sonda de2 O dentro da abertura da câmara.</li>
	<li>Monitorar os pontos de dados em tempo real sobre o programa de "Taxa de SensorTrace" e deixar a sonda estabilizar (~ 3 min depois a sonda é colocada na câmara).</li>
	<li>Clique em "Medida" para medir os níveis de2 O continuamente por 6 h com medições gravadas em intervalos de 2 s.</li>
	<li>Parar a medição e repita etapas 4.1 – 5.4 para cada amostra a ser analisada.</li>
	<li>Exportar os dados para o Microsoft Excel, clicando em "arquivo | Exportação | Salve como. xls".</li>
</ol>6. análise de dados
<ol><li>
Calcular o OCR
	<ol>
<li>No arquivo Excel exportado sob a aba "Within_Rates", grave a "taxa" para cada medição de câmara (nmol/h).</li>
		<li>Para cada amostra experimental, subtrair a "taxa" da câmara em branco da "Taxa" da câmara de amostra experimental para obter um valor corrigido do OCR e o valor absoluto desse número.</li>
		<li>Calcule o total OCR por mg de teliospores, dividindo o valor corrigido de OCR absoluto pelo celular usado em massa.</li>
		<li>Média replicar valores "OCR por mg de teliospores" para todas as estirpes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisar os dados usando o método estatístico apropriado (por exemplo., t do estudante-teste, análise de variância) usando o Microsoft Excel de outros softwares estatísticos.</li>
	<li>Para o gráfico de dados brutos, calcular a porcentagem de oxigênio restante para cada ponto de tempo que você deseja gráfico. Dividir a primeira leitura por si só e multiplique por 100 (100% de oxigênio restante), depois dividir cada leitura subsequente pela primeira leitura e multiplicar por 100 para obter a porcentagem de oxigênio restante na câmara.</li>
</ol>7. indução da germinação de Teliospore para isolar Teliospores em distintas fases de germinação
<ol><li>Prepare o PDB (24 g/L) suplementado com sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL) em um armário de biossegurança.</li>
	<li>Coloque aproximadamente 10 mg de teliospores U. maydis em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
	<li>Suspenda os teliospores em 500 µ l do PDB. Suavemente a pipeta para misturar até que haja sem grumos de teliospores no meio.</li>
	<li>Transferi a suspensão de teliospore para um Erlenmeyer de 250ml esterilizado contendo PDB suplementado com sulfato de estreptomicina.</li>
	<li>Incube o frasco durante a noite a 28 ° C, agitando a 90 rpm.</li>
</ol>8. preparação da placa de Petri e micromanipulador
<ol><li>
Prepare um prato de Petri (57 cm2) por linhas de pipetagem de gotículas para preparação da conta e coleta de amostra.
	<ol>
<li>Pipete 5 gotas de2O de dH µ l (x 4) na parte superior da caixa de Petri.</li>
		<li>Pipete 2 µ l (x3) de solução de estabilização de RNA sobre o prato de Petri deve ser usado para coleta de amostra.</li>
		<li>Pipete 5 µ l (x 30) as gotas de germinação teliospores sobre o prato de Petri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 15 mL de óleo mineral para o prato de petri. Certifique-se de que todas as gotas estão cobertas pelo óleo antes de prosseguir.</li>
	<li>Prepare uma conta com um 15 µm de diâmetro interno, flange de 1 mm, 55 mm de comprimento e um ângulo de ponta de 20°, colocando-o no suporte de conta e submergindo no óleo mineral onde ação capilar permitirá que o óleo mineral entrar a conta. Libera a pressão na conta antes de trazê-lo para a gota de água. Aspirado para preparar a conta de água.</li>
</ol>9. isolamento de estágio específico germinação Teliospores
<ol><li>Usando os controles do micromanipulador, mova a conta preparada para dentre as gotas de germinação. Penetrar o droplet, reduzir a conta e trazer a boca da conta até um teliospore de germinação na fase de germinação de interesse.</li>
	<li>Lentamente, Aspire para capturar o teliospore de germinação. Pare por aspiração, uma vez que o teliospore entrou a conta. Repita até há cerca de cinco teliospores na conta.</li>
	<li>Criar a conta com o micromanipulador e trazê-lo para a gota de coleção de solução de estabilização de RNA. Penetrar a gota e injetar os teliospores da gota.</li>
	<li>Repita as etapas de 8.1 a 8.3 até aproximadamente 1.000 teliospores foram capturados.</li>
</ol>10. recuperação de coleção da gota
<ol><li>Pipetar acima da gota de coleção e transferi-lo para a tampa de um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL RNase/DNase-livre. Remova cuidadosamente o óleo mineral com uma pipeta sem perturbar o droplet de coleção.</li>
	<li>Use os teliospores para aplicações a jusante, tais como a isolação do RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaville%2C+BJ+%22Meiosis+-+Molecular+Mechanisms+and+Cytogenetic+Diversity%22">Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity</a>. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).</li>
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</ol>

Os autores têm sem concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse a divulgar.

Patógenos de vegetais basidiomiceto biotrófica causam bilhões de dólares em perdas de safra anualmente. A grande maioria desses patógenos produzem teliospores que são parte integrantes de fungo dispersão e reprodução sexual. Ganhar o conhecimento do desenvolvimento e germinação de teliospores é fundamental para entender a propagação das doenças devastadoras causadas por estes fungos. A fim de identificar alterações moleculares em pontos chave controle criámos um método para identificar o momento de mudanças fisiológicas ...

Os fungos (Ustilaginales) consistem em mais de 1.600 espécies que infectam de gramíneas, incluindo as importante cereais de milho, cevada e trigo, causando bilhões de dólares em perdas de safra anualmente1. Estes fungos são caracterizados pela produção de teliospores, que tem sombriamente pigmentado paredes celulares e são os agentes de dispersão. Teliospores a função de proteger o material genético durante o stress da dispersão entre plantas hospedeiras e pode persistir em um estado dormente por anos2. Como tal, teliospores são um componente essencial da propagação da doença.
A fim de estudar Biologia teliospore, nosso laboratório utiliza o fungo de obscenidade modelo Ustilago maydis (U. maydis), que é o agente causal da doença 'ferrugem comum do milho'. Maduras U. maydis teliospores caracterizam-se pela detenção de crescimento, metabolismo celular reduzido e baixos níveis de respiração celular3. Em condições ambientais favoráveis (ex., a presença de açúcares específicos), U. maydis teliospores germinar e completar basidiósporos meiose, produzindo que podem iniciar novas rodadas de infecção. Germinação é caracterizada por aumento da respiração, a atividade de retorno para metabólica e a progressão por etapas morfológicas observáveis de germinação4.
A fase inicial de germinação inclui aumento da respiração e função metabólica, no entanto, não há morfológicos indícios de mudança. As originais de alteração respiratória em U. maydis foram efectuadas medições mais de 50 anos atrás, medição do consumo de oxigênio manometrically com um balão de Warburg aparelho5. Nós desenvolvemos um método de estudar alterações precisas na respiração durante a germinação de teliospore pela medição do consumo de oxigênio durante um tempo de germinação, usando um microrespirometer de Clark-tipo novo, simples. Anteriormente, usamos este método para estudar alterações na frequência respiratória entre o selvagem-tipo U. maydis células haploides e mutantes com mitocôndrias defeituosas6e adaptaram o protocolo aqui para estudar alterações na respiração teliospore durante germinação. Isso fornece um meio de identificar com precisão o momento da mudança de respiração para que nós pode direcionar teliospores no momento oportuno, após o início da germinação para investigar eventos moleculares precoce. A progressão de germinação pode ser seguida ao microscópio uma vez que o promycelia emerge o teliospore, mas a natureza assíncrona inibiu o isolamento de bastante teliospores em uma determinada fase para investigação. Desenvolvemos uma técnica de microdissection similar àqueles usados para fertilização in vitro para coletar fisicamente teliospores em distintas fases morfológicas da germinação.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>BioShop</td><td>STP101</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>BioShop</td><td>KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de batata dextrose</td><td>BD Difco</td><td>254920</td><td></td></tr><tr><td>1 L Waring Liquidificador de laboratório</td><td>Waring</td><td>7011S</td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td>VWR</td><td>470150-438</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador de polipropileno Nalgene com torneira</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5310-0250</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microrespiração Unisense</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sensor de microrespiração (O2)</td><td>Amplificador</td> de medidor MicroOptode Unisense <td>OX10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Unisense</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MR-Ch Small</td><td>Unisense</td><td>MR-Ch</td><td></td></tr><tr><td>SensorTrace Rate Software</td><td>Rack de</td> MicroRespiração Unisense <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de MicroRespiração</td><td>Unisense</td><td>MR2-Rack</td><td></td></tr> Sistema de Microdissecção <tr><td></td><td>Unisense</td><td>MR2-Co</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1 Microscópio de Luz Invertida</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulador Grosseiro</td><td>Narishige</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador hidráulico de óleo de joystick suspenso de três eixos</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor pneumático</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>TransferTip (ES)</td><td>Eppendorf</td><td>5175107004</td><td></td></tr></tbody></table>

investigando a germinação de teliospore usando a análise de microrespiration e microdissection

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Fungos são os agentes etiológicos de várias doenças agrícolas devastadores. Eles são caracterizados pela produção de teliospores, que são agentes de dispersão de paredes grossas. Teliospores podem permanecer dormentes por décadas. A dormência é caracterizada por baixas taxas metabólicas, pausado biossíntese macromolecular e reduzido os níveis de respiração. Ao receber sinais ambientais necessários, teliospores germinam para produzir células haploides, que podem iniciar novas rodadas de infecção. Germinação de teliospore caracteriza-se pela retomada de biossíntese macromolecular, aumento da respiração e dramáticas mudanças morfológicas. Para medir precisamente as alterações na respiração celular durante os estágios iniciais de germinação, nós desenvolvemos um protocolo simples, empregando um respirometer Clark-tipo. Os estagios de germinação são distinguidos por alterações morfológicas específicas, mas a germinação é assíncrona. Desenvolvemos uma técnica de microdissection que nos permitirá coletar teliospores em fases distintas de germinação.

Usando o método de Clark-tipo com base em microrespirometer de medir as mudanças na respiração durante a dormência teliospore e germinação, Confirmámos que dormente teliospores apresentam um baixo nível de respiração (~ 1.075 µmol/h/mg), comparado a germinação teliospores (~ 2.614 µmol/h/mg; Figura 1A). Isto representa uma mudança de ~2.4-fold em média taxa de respiração entre dormentes teliospores e teliospores que têm sido induzidos a germinar. Além disso, ...

Fungos causam muitas doenças agrícolas devastadores. Eles estão dispersos como teliospores latentes que germinam em resposta aos sinais ambientais. Nós esboçamos dois métodos para investigar mudanças moleculares durante a germinação: aumento da respiração para detectar ativação metabólica de medição e avaliar alterar eventos moleculares isolando teliospores em fases morfológicas distintas.

Investigando a germinação de Teliospore usando a análise de Microrespiration e Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

O objetivo geral dos procedimentos apresentados aqui é identificar estágios de germinação de esporos para que os níveis de transcrição gênica possam ser avaliados. A análise dessas mudanças fornecerá mais conhecimento de um estágio crítico na dispersão da doença. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre transições durante a germinação de teliósporos que estão ligadas a mudanças nos níveis de transcrição gênica e, portanto, refletem mudanças no controle da expressão gênica.As principais vantagens desta técnica são que ela identifica transições no nível de respiração que não correspondem a interruptores morfológicos visíveis e permite o isolamento físico de teliósporos em estágios distintos de germinação. Essa técnica tem implicações para o controle da disseminação do patógeno, pois permite identificar transições importantes na germinação de esporos, que, se alteradas, podem bloquear a disseminação da doença. Comece este procedimento com infecção por espiga de milho, colheita de teliósporos, bem como viabilidade de teliósporos e teste de germinação, conforme descrito no protocolo de texto.Para induzir a germinação, primeiro pese uma quantidade igual de teliósporos para cada experimento de respiração. Em um gabinete de biossegurança, adicione os teliósporos a uma câmara de respiração autoclavada. Encha a câmara com caldo de batata dextrose, suplementado com sulfato de estreptomicina e sulfato de canamicina.Pipete para cima e para baixo para criar uma suspensão de teliósporos. Coloque a tampa da câmara na câmara para criar uma vedação hermética. Para obter a medição de OCR, primeiro coloque a câmara no rack da câmara dentro de um banho-maria.Em seguida, coloque a sonda de oxigênio dentro da abertura da câmara. Monitore os pontos de dados que aparecem em tempo real no programa de taxa de rastreamento do sensor. Deixe a sonda estabilizar por aproximadamente três minutos após a sonda ser colocada na câmara.Clique em Medir para medir os níveis de oxigênio continuamente por seis horas com medições registradas em intervalos de dois segundos. Pare a medição e repita essas etapas para cada amostra a ser analisada antes de exportar os dados para o Microsoft Excel e executar a análise de dados conforme descrito no protocolo de texto. Coloque aproximadamente 10 miligramas de teliósporos umatus em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Suspenda os teliósporos em 500 microlitros de PDB suplementado com sulfato de estreptomicina. Pipete suavemente para misturar até que não haja aglomerados de teliósporos no meio. Transferir a suspensão de teliósporos para um balão Erlin Meyer de 250 mililitros autoclavado, contendo PDB, suplementado com sulfato de estreptomicina.Incubar o balão durante a noite a 28 graus Celsius, agitando a 90 RPM. Prepare uma placa de Petri pipetando quatro a cinco gotas de cinco microlitros de água destilada na parte superior da placa de Petri. Em seguida, pipetar três gotículas de dois microlitros de solução de estabilização de RNA na placa de Petri para serem usadas para coleta de amostras.Pipetar também 30 gotículas de cinco microlitros de teliósporos em germinação na placa de Petri. Adicione 15 mililitros de óleo mineral à placa de Petri. Certifique-se de que todas as gotículas estejam cobertas por óleo antes de prosseguir.Em seguida, prepare um microcapilar com um diâmetro intermediário de 15 mícrons, flange de um milímetro, comprimento de 55 mililitros e um ângulo de ponta de 20 graus. Coloque-o no suporte microcapilar e mergulhe-o no óleo mineral, onde a ação capilar permitirá que o óleo mineral entre no microcapilar. Libere a pressão no microcapilar antes de trazê-lo para a gota de água.Aspire para preparar o microcapilar com água. Usando os controles do micromanipulador, mova o microcapilar preparado para uma das gotículas de germinação e penetre na gota. Abaixe o microcapilar e traga a boca do microcapilar até um teliósporo em germinação no estágio de germinação de interesse.Aspire lentamente para capturar o teliósporo em germinação. Pare de aspirar assim que o teliósporo entrar no microcapilar. Repita até que haja aproximadamente cinco teliósporos no microcapilar.Eleve o microcapilar com o micromanipulador e leve-o para a gota de coleta da solução de estabilização de RNA. Penetre na gotícula e injete os teliósporos na gota. Repita essas etapas até que aproximadamente 1.000 teliósporos tenham sido capturados.Para recuperar a gota de coleta, pipete a gota de coleta e transfira-a para a tampa do tubo de microcentfuga livre de 2,0 mililitros do DNA de um RNA. Cuidadosamente o óleo mineral com a pipeta, sem perturbar a gota de coleta. Os teliósporos agora podem ser usados para aplicações a jusante, como isolamento de RNA.Este gráfico ilustra um resultado típico da avaliação das mudanças no nível de oxigênio em suspensões de teliósporos induzidos a germinar. Em relação aos teliósporos não induzidos, a separação que indica o início da respiração ocorre em cerca de 30 minutos. Considerando que leva cerca de 15 minutos para configurar e transportar a amostra para a sonda de oxigênio, esse tempo é na verdade de 45 minutos.Aqui são mostrados os cinco estágios da germinação dos teliósporos. No estágio um, os teliósporos são induzidos a germinar, mas não mostram sinais morfológicos de germinação. Os teliósporos do estágio dois mostram um promicélio emergido com um comprimento menor que o diâmetro do teliósporo.No estágio três, o comprimento do promicélio é maior que o diâmetro do teliósporo. O estágio quatro é caracterizado por promicélios com basidiósporos aderidos. E no estágio cinco, há basidiósporos brotando.Aqui, os teliósporos de germinação assíncrona são mostrados e o microcapilar é posicionado próximo a um teliósporo de estágio três. O teliósporo do estágio três é então aspirado para o microcapilar e transferido para uma gota de solução de coleta. Uma vez dominada, esta técnica de microdissecção pode ser usada para isolar 1.000 teliósporos específicos do estágio em seis a sete horas.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fazer pausas frequentes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar fisicamente os esporos em estágios morfologicamente distintos de germinação. E identifique o momento do início da respiração.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, devido à necessidade de manter a esterilidade. E a necessidade de paciência e isolamento de tipos de células por microdissecação. O desenvolvimento dessa técnica abre caminho para que os patologistas de plantas fúngicas explorem os aspectos morfológicos e moleculares da germinação em fungos devastadores de carvão e ferrugem que ameaçam a segurança alimentar global.Embora essa técnica se aplique a nós, ligomatistas, ela também pode ser usada em muitos outros patógenos agrícolas devastadores que resultam em bilhões de dólares em perdas anualmente. Após este procedimento, outros métodos, como o isolamento de RNA, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como, qual é o perfil e o momento da mudança no nível de transcrição?

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