Name: Investigando a germinação de Teliospore usando a análise de Microrespiration e Microdissection (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a analisar a germinação de teliósporos em fungos causadores de doenças agrícolas usando microrespiração e microdissecção. Este método permite isolar estágios específicos e estudar mudanças metabólicas e de expressão gênica.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Paul Frost para uso de seu microrespirometer e Nicole Wagner e Alex Bell para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por uma bolsa NSERC para B.J.S.

1. infecção de espiga de milho
<ol><li>Crescer Zea mays (CV. Golden Bantam) até que as espigas são formadas e começaram a seda (aproximadamente 60 dias).</li>
	<li>Cultura haploides compatíveis U. maydis cepas usando protocolos padrão como anteriormente descrito7.</li>
	<li>Infectar as espigas de milho usando protocolos padrão, como descrito anteriormente,7.</li>
</ol>2. teliospore colheita
<ol><li>Equipamento de autoclave (funil de Büchner, frascos de Büchner, liquidificadores, garrafas de 250 mL centrífuga, espátulas planas e água) usando um padrão seco ciclo com pelo menos 30 min esterilização a 121 ° C (ciclo líquido padrão para água).</li>
	<li>Remova infectadas espigas de plantas (aproximadamente infecção de postagem de 28-35 dias) usando uma navalha e coloque as espigas em uma bandeja coberta de protetor de banco.</li>
	<li>Remover os tumores de espigas com uma lâmina de barbear e recolher num copo.</li>
	<li>Encher um copo de liquidificador de laboratório de 250 mL com tumores até aproximadamente 1/3 completo e adicionar autoclavado dH2O até o copo do liquidificador é de aproximadamente 3/4 completo. Perturbar os tumores por pulsando o misturador no ponto baixo, até homogeneizado.</li>
	<li>Conecte a bomba de vácuo para uma armadilha de água e em seguida para um balão de Büchner de 1 L.</li>
	<li>Inserir o balão grande funil de Büchner e forre o fundo do funil de Büchner com quatro camadas de gaze.</li>
	<li>Ligue a bomba de vácuo.</li>
	<li>Despeje uma porção dos tumores homogeneizadas através da gaze de algodão e raspar com uma espátula.</li>
	<li>Despeje algumas dH2O pano a fim de liberar os teliospores através de.</li>
	<li>Repita até o dH2O passando a gaze é claro.</li>
	<li>Torça o pano contendo o material homogeneizado tumor no filtro para garantir a recuperação máxima teliospore.</li>
	<li>Quando o balão de Büchner 1L está ficando perto de cheio, esvazie-a em um Erlenmeyer de grande e reserve.</li>
	<li>Colocar um novo pedaço de gaze no filtro e repita os passos (2.7-2.12) até que todos os tumores foram interrompidos e filtrados.</li>
	<li>Despeje os teliospores filtradas em frascos de 250ml autoclavado centrífuga e centrifugar a 1.000 x g por 5 min e decante o sobrenadante.</li>
	<li>Repita a etapa 2.14 até todos os teliospores filtrados são peletizados por centrifugação.</li>
	<li>Suspenda as bolinhas em uma pequena quantidade de água e transferir para tubos de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 1.000 x g por 5 min e decante o sobrenadante.</li>
	<li>Suspender o pellet em aproximadamente 50 mL de dH2O, centrifugar os tubos a 1.000 x g por 5 min e decante o sobrenadante. Delicadamente raspe a camada superior cinza com uma espátula e deposite. Repita até que já não há uma camada de cinza por cima.</li>
	<li>Seca as amostras durante a noite num exsicador de vácuo.</li>
	<li>Loja teliospores secas a 4 ° C até o uso.</li>
	<li>
Se desejado, trate as teliospores com sulfato de cobre8 antes de induzir a germinar. Se não for tratada, em seguida, execute minuciosa análise microscópica dos teliospores para confirmar a amostra representa teliospores puras e é desprovida de bactérias ou outras contaminações.
	<ol>
<li>Pese cerca de 50 mg de teliospores em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione cerca de 1,0 mL de 0,75% CuSO4 para o tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo os teliospores. Pipete para cima e para baixo suspender os teliospores da solução de CuSO4 seguido de agitar a amostra durante 3 h.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 2.500 x g por 5 min e retire o sobrenadante. Resuspenda o pellet de teliospore com água estéril, repetir a centrifugação e remover o sobrenadante.</li>
		<li>Repita a etapa 2.21.3 mais duas vezes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. teliospore viabilidade e teste de germinação
<ol><li>Pese cerca de 10 mg de teliospores U. maydis em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para avaliar sua viabilidade e o tempo de germinação.</li>
	<li>Em uma armário de biossegurança, prepare batata dextrose caldo de carne (PDB, 24 g/L) suplementado com sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL).</li>
	<li>Suspenda os teliospores em 500 µ l do PDB. Delicadamente, pipete para misturar e quebrar todos os grupos de teliospores.</li>
	<li>Transferi a suspensão de teliospore para um esterilizada 250ml balão de Erlenmeyer contendo 10 mL de APO.</li>
	<li>Incube o frasco a 28 ° C, agitando a 90 rpm para 12-16 h.</li>
	<li>Em uma armário de biossegurança, retire uma amostra de 20 µ l dos teliospores induzido a germinar e preparar uma lâmina de microscópio.</li>
	<li>
Usando um microscópio, visualmente avalie estágios de germinação que estão presentes e a presença de contaminação bacteriana.
	<ol>
<li>Contar o número de teliospores em encena através de V usando um hemocytometer e determinar a porcentagem que tem germinado.</li>
		<li>Se única fase I teliospores estão presentes, continuar a incubar o frasco para um total de 24 h antes de avaliar a germinação de teliospore. Continue a incubação por um período máximo de 48 h antes de considerar a amostra inviáveis.</li>
		<li>Se houver contaminação bacteriana, completar o PDB com sulfato de canamicina (50 µ g/mL) bem como sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL) e em seguida, repita as etapas de 3.1 a 3.7. Se persistir de contaminação bacteriana, tratar teliospores com sulfato de cobre e repita as etapas de 3.1 a 3.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. indução da germinação para monitorização da respiração
<ol><li>Pesar a quantidade igual (ex., 50 mg) de teliospores para cada experiência de respiração.</li>
	<li>Em uma armário de biossegurança, adicione teliospores para uma câmara de respiração autoclavados.</li>
	<li>Encher a câmara com PDB (24 g/L) suplementado com sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL) e sulfato de canamicina (50 µ g/mL).</li>
	<li>Pipete para cima e para baixo para criar uma suspensão de teliospore.</li>
	<li>Coloque a tampa de câmara na câmara para criar vedação hermética.</li>
</ol>5. obtenção de medições de taxa (OCR) de consumo de oxigênio
<ol><li>Coloque a câmara no rack câmara dentro de um banho de água (pré-aquecido a 28 ° C).</li>
	<li>Coloque a sonda de2 O dentro da abertura da câmara.</li>
	<li>Monitorar os pontos de dados em tempo real sobre o programa de "Taxa de SensorTrace" e deixar a sonda estabilizar (~ 3 min depois a sonda é colocada na câmara).</li>
	<li>Clique em "Medida" para medir os níveis de2 O continuamente por 6 h com medições gravadas em intervalos de 2 s.</li>
	<li>Parar a medição e repita etapas 4.1 – 5.4 para cada amostra a ser analisada.</li>
	<li>Exportar os dados para o Microsoft Excel, clicando em "arquivo | Exportação | Salve como. xls".</li>
</ol>6. análise de dados
<ol><li>
Calcular o OCR
	<ol>
<li>No arquivo Excel exportado sob a aba "Within_Rates", grave a "taxa" para cada medição de câmara (nmol/h).</li>
		<li>Para cada amostra experimental, subtrair a "taxa" da câmara em branco da "Taxa" da câmara de amostra experimental para obter um valor corrigido do OCR e o valor absoluto desse número.</li>
		<li>Calcule o total OCR por mg de teliospores, dividindo o valor corrigido de OCR absoluto pelo celular usado em massa.</li>
		<li>Média replicar valores "OCR por mg de teliospores" para todas as estirpes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisar os dados usando o método estatístico apropriado (por exemplo., t do estudante-teste, análise de variância) usando o Microsoft Excel de outros softwares estatísticos.</li>
	<li>Para o gráfico de dados brutos, calcular a porcentagem de oxigênio restante para cada ponto de tempo que você deseja gráfico. Dividir a primeira leitura por si só e multiplique por 100 (100% de oxigênio restante), depois dividir cada leitura subsequente pela primeira leitura e multiplicar por 100 para obter a porcentagem de oxigênio restante na câmara.</li>
</ol>7. indução da germinação de Teliospore para isolar Teliospores em distintas fases de germinação
<ol><li>Prepare o PDB (24 g/L) suplementado com sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL) em um armário de biossegurança.</li>
	<li>Coloque aproximadamente 10 mg de teliospores U. maydis em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
	<li>Suspenda os teliospores em 500 µ l do PDB. Suavemente a pipeta para misturar até que haja sem grumos de teliospores no meio.</li>
	<li>Transferi a suspensão de teliospore para um Erlenmeyer de 250ml esterilizado contendo PDB suplementado com sulfato de estreptomicina.</li>
	<li>Incube o frasco durante a noite a 28 ° C, agitando a 90 rpm.</li>
</ol>8. preparação da placa de Petri e micromanipulador
<ol><li>
Prepare um prato de Petri (57 cm2) por linhas de pipetagem de gotículas para preparação da conta e coleta de amostra.
	<ol>
<li>Pipete 5 gotas de2O de dH µ l (x 4) na parte superior da caixa de Petri.</li>
		<li>Pipete 2 µ l (x3) de solução de estabilização de RNA sobre o prato de Petri deve ser usado para coleta de amostra.</li>
		<li>Pipete 5 µ l (x 30) as gotas de germinação teliospores sobre o prato de Petri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 15 mL de óleo mineral para o prato de petri. Certifique-se de que todas as gotas estão cobertas pelo óleo antes de prosseguir.</li>
	<li>Prepare uma conta com um 15 µm de diâmetro interno, flange de 1 mm, 55 mm de comprimento e um ângulo de ponta de 20°, colocando-o no suporte de conta e submergindo no óleo mineral onde ação capilar permitirá que o óleo mineral entrar a conta. Libera a pressão na conta antes de trazê-lo para a gota de água. Aspirado para preparar a conta de água.</li>
</ol>9. isolamento de estágio específico germinação Teliospores
<ol><li>Usando os controles do micromanipulador, mova a conta preparada para dentre as gotas de germinação. Penetrar o droplet, reduzir a conta e trazer a boca da conta até um teliospore de germinação na fase de germinação de interesse.</li>
	<li>Lentamente, Aspire para capturar o teliospore de germinação. Pare por aspiração, uma vez que o teliospore entrou a conta. Repita até há cerca de cinco teliospores na conta.</li>
	<li>Criar a conta com o micromanipulador e trazê-lo para a gota de coleção de solução de estabilização de RNA. Penetrar a gota e injetar os teliospores da gota.</li>
	<li>Repita as etapas de 8.1 a 8.3 até aproximadamente 1.000 teliospores foram capturados.</li>
</ol>10. recuperação de coleção da gota
<ol><li>Pipetar acima da gota de coleção e transferi-lo para a tampa de um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL RNase/DNase-livre. Remova cuidadosamente o óleo mineral com uma pipeta sem perturbar o droplet de coleção.</li>
	<li>Use os teliospores para aplicações a jusante, tais como a isolação do RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaville%2C+BJ+%22Meiosis+-+Molecular+Mechanisms+and+Cytogenetic+Diversity%22">Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity</a>. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).</li>
<li>Christensen, J. J. <a target="_blank" href="https://trove.nla.gov.au/work/14819898">Monograph Number 2</a>. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).</li>
<li>Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).</li>
<li>Allen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.py.03.090165.001525">Metabolic aspects of spore germination in fungi.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).</li>
<li>Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).</li>
<li>Ostrowski, L. A., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+antisense+transcripts+are+linked+to+the+modulation+of+mitochondrial+function+and+teliospore+dormancy+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis.</a> Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).</li>
<li>Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/07060661.2012.697077">Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes.</a> Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).</li>
<li>Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unh1%2C+an+Ustilago+maydis+Ndt80-like+protein%2C+controls+completion+of+tumor+maturation%2C+teliospore+development%2C+and+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis.</a> Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).</li>
<li>Stade, S., Brambl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biogenesis+during+fungal+spore+germination%3A+respiration+and+cytochrome+c+oxidase+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa.</a> J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).</li>
<li>Brambl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+developing+mitochondrial+genetic+and+respiratory+functions+in+germinating+fungal+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores.</a> Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).</li>
<li>Sacadura, N. T., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+EST+analyses+of+Ustilago+maydis+germinating+teliospores%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores.</a> Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).</li>
<li>Hilderbrand, E. M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4353196">Techniques for the isolation of single microorganisms.</a> Botanical Review. 4 (12), 38(1938).</li>
<li>Seto, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Analysis+of+gene+transcripts+during+Ustilago+maydis+teliospore+dormancy+and+germination%22">Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination</a>. , Trent University. M.Sc. thesis (2013).</li>
<li>Fröhlich, J., König, H. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783540281801">Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates</a>. König, H., Varma, A. , Springer. 425-437 (2006).</li>
<li>Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/cca7/01a80499de99d3bb5f3bbf4ead24b6bf3d5d.pdf">Single spore isolation of fungi.</a> Fungal Diversity. 3, 11(1999).</li>
<li>Sherman, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S007668790250954X">Getting started with yeast.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).</li>
<li>Chen, Y., Seguin-Swartz, G. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/07060660309507000">A rapid method for assessing the viability of fungal spores.</a> Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).</li>
</ol>

Os autores têm sem concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse a divulgar.

Patógenos de vegetais basidiomiceto biotrófica causam bilhões de dólares em perdas de safra anualmente. A grande maioria desses patógenos produzem teliospores que são parte integrantes de fungo dispersão e reprodução sexual. Ganhar o conhecimento do desenvolvimento e germinação de teliospores é fundamental para entender a propagação das doenças devastadoras causadas por estes fungos. A fim de identificar alterações moleculares em pontos chave controle criámos um método para identificar o momento de mudanças fisiológicas ...

Os fungos (Ustilaginales) consistem em mais de 1.600 espécies que infectam de gramíneas, incluindo as importante cereais de milho, cevada e trigo, causando bilhões de dólares em perdas de safra anualmente1. Estes fungos são caracterizados pela produção de teliospores, que tem sombriamente pigmentado paredes celulares e são os agentes de dispersão. Teliospores a função de proteger o material genético durante o stress da dispersão entre plantas hospedeiras e pode persistir em um estado dormente por anos2. Como tal, teliospores são um componente essencial da propagação da doença.
A fim de estudar Biologia teliospore, nosso laboratório utiliza o fungo de obscenidade modelo Ustilago maydis (U. maydis), que é o agente causal da doença 'ferrugem comum do milho'. Maduras U. maydis teliospores caracterizam-se pela detenção de crescimento, metabolismo celular reduzido e baixos níveis de respiração celular3. Em condições ambientais favoráveis (ex., a presença de açúcares específicos), U. maydis teliospores germinar e completar basidiósporos meiose, produzindo que podem iniciar novas rodadas de infecção. Germinação é caracterizada por aumento da respiração, a atividade de retorno para metabólica e a progressão por etapas morfológicas observáveis de germinação4.
A fase inicial de germinação inclui aumento da respiração e função metabólica, no entanto, não há morfológicos indícios de mudança. As originais de alteração respiratória em U. maydis foram efectuadas medições mais de 50 anos atrás, medição do consumo de oxigênio manometrically com um balão de Warburg aparelho5. Nós desenvolvemos um método de estudar alterações precisas na respiração durante a germinação de teliospore pela medição do consumo de oxigênio durante um tempo de germinação, usando um microrespirometer de Clark-tipo novo, simples. Anteriormente, usamos este método para estudar alterações na frequência respiratória entre o selvagem-tipo U. maydis células haploides e mutantes com mitocôndrias defeituosas6e adaptaram o protocolo aqui para estudar alterações na respiração teliospore durante germinação. Isso fornece um meio de identificar com precisão o momento da mudança de respiração para que nós pode direcionar teliospores no momento oportuno, após o início da germinação para investigar eventos moleculares precoce. A progressão de germinação pode ser seguida ao microscópio uma vez que o promycelia emerge o teliospore, mas a natureza assíncrona inibiu o isolamento de bastante teliospores em uma determinada fase para investigação. Desenvolvemos uma técnica de microdissection similar àqueles usados para fertilização in vitro para coletar fisicamente teliospores em distintas fases morfológicas da germinação.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>BioShop</td><td>STP101</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>BioShop</td><td>KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de batata dextrose</td><td>BD Difco</td><td>254920</td><td></td></tr><tr><td>1 L Waring Liquidificador de laboratório</td><td>Waring</td><td>7011S</td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td>VWR</td><td>470150-438</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador de polipropileno Nalgene com torneira</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5310-0250</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microrespiração Unisense</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sensor de microrespiração (O2)</td><td>Amplificador</td> de medidor MicroOptode Unisense <td>OX10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Unisense</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MR-Ch Small</td><td>Unisense</td><td>MR-Ch</td><td></td></tr><tr><td>SensorTrace Rate Software</td><td>Rack de</td> MicroRespiração Unisense <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de MicroRespiração</td><td>Unisense</td><td>MR2-Rack</td><td></td></tr> Sistema de Microdissecção <tr><td></td><td>Unisense</td><td>MR2-Co</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1 Microscópio de Luz Invertida</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulador Grosseiro</td><td>Narishige</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador hidráulico de óleo de joystick suspenso de três eixos</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor pneumático</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>TransferTip (ES)</td><td>Eppendorf</td><td>5175107004</td><td></td></tr></tbody></table>

investigando a germinação de teliospore usando a análise de microrespiration e microdissection

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Fungos são os agentes etiológicos de várias doenças agrícolas devastadores. Eles são caracterizados pela produção de teliospores, que são agentes de dispersão de paredes grossas. Teliospores podem permanecer dormentes por décadas. A dormência é caracterizada por baixas taxas metabólicas, pausado biossíntese macromolecular e reduzido os níveis de respiração. Ao receber sinais ambientais necessários, teliospores germinam para produzir células haploides, que podem iniciar novas rodadas de infecção. Germinação de teliospore caracteriza-se pela retomada de biossíntese macromolecular, aumento da respiração e dramáticas mudanças morfológicas. Para medir precisamente as alterações na respiração celular durante os estágios iniciais de germinação, nós desenvolvemos um protocolo simples, empregando um respirometer Clark-tipo. Os estagios de germinação são distinguidos por alterações morfológicas específicas, mas a germinação é assíncrona. Desenvolvemos uma técnica de microdissection que nos permitirá coletar teliospores em fases distintas de germinação.

Usando o método de Clark-tipo com base em microrespirometer de medir as mudanças na respiração durante a dormência teliospore e germinação, Confirmámos que dormente teliospores apresentam um baixo nível de respiração (~ 1.075 µmol/h/mg), comparado a germinação teliospores (~ 2.614 µmol/h/mg; Figura 1A). Isto representa uma mudança de ~2.4-fold em média taxa de respiração entre dormentes teliospores e teliospores que têm sido induzidos a germinar. Além disso, ...

Fungos causam muitas doenças agrícolas devastadores. Eles estão dispersos como teliospores latentes que germinam em resposta aos sinais ambientais. Nós esboçamos dois métodos para investigar mudanças moleculares durante a germinação: aumento da respiração para detectar ativação metabólica de medição e avaliar alterar eventos moleculares isolando teliospores em fases morfológicas distintas.

Investigando a germinação de Teliospore usando a análise de Microrespiration e Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

O objetivo geral dos procedimentos apresentados aqui é identificar estágios de germinação de esporos para que os níveis de transcrição gênica possam ser avaliados. A análise dessas mudanças fornecerá mais conhecimento de um estágio crítico na dispersão da doença. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre transições durante a germinação de teliósporos que estão ligadas a mudanças nos níveis de transcrição gênica e, portanto, refletem mudanças no controle da expressão gênica.As principais vantagens desta técnica são que ela identifica transições no nível de respiração que não correspondem a interruptores morfológicos visíveis e permite o isolamento físico de teliósporos em estágios distintos de germinação. Essa técnica tem implicações para o controle da disseminação do patógeno, pois permite identificar transições importantes na germinação de esporos, que, se alteradas, podem bloquear a disseminação da doença. Comece este procedimento com infecção por espiga de milho, colheita de teliósporos, bem como viabilidade de teliósporos e teste de germinação, conforme descrito no protocolo de texto.Para induzir a germinação, primeiro pese uma quantidade igual de teliósporos

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Micromanipulação de células de levedura é necessária para a análise genética meiótica ou para selecionar zigotos diplóides. Estes micromanipulations são realizadas com a microneedle de um microscópio de dissecação. O microagulhas é usado para deslocar as células e é controlado por um micromanipulador, que estão disponíveis com vários graus de automação.

Dissecção da Saccharomyces cerevisiae Asci

GFP-fusão proteínas são amplamente utilizados para visualizar organelas por microscopia confocal. No entanto, a triagem para mutações que afetam a morfologia das organelas geralmente requer mutagênese individual e é demorado. Aqui, nós demonstramos um método para incorporar simultaneamente organela-GFP marcadores em quase 5.000 genes não-essenciais no fermento.

Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

A base molecular do espaço-respostas específicas fitocromo está sendo investigado o uso de plantas transgênicas que apresentam tecidos e órgãos específicos deficiências fitocromo. O isolamento de células específicas exibindo esgotamento cromóforo fitocromo induzida por fluorescência-Activated Celular classificação seguido por análises de microarray está sendo utilizada para identificar genes envolvidos em respostas espaciais específicos fitocromo.

Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana</em

Fonte: Wen, J., Pasman, et. al., Visualização de germinossomos e membrana interna em esporos de Bacillus subtilis . J. Vis. (2019)Este vídeo demonstra o uso de microscopia de iluminação estruturada para adquirir imagens de fluorescência tridimensionais que revelam a organização das proteínas de germinação dentro do esporo bacteriano.

Visualização de proteínas de germinação na membrana interna de esporos bacterianos

Aqui, descrevemos um ensaio colorimétrico para detectar a presença de açúcares redutores durante a germinação de esporos bacterianos.

Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos

Este protocolo ilustra as etapas consecutivas importantes, necessárias para avaliar a pertinência de monitoramento parâmetro de vitalidade e os processos de reparação do DNA em reviving esporos de Bacillus subtilis após o tratamento com plasma de baixa pressão de tracking proteínas através do tempo-resolvido microscopia confocal e microscopia eletrônica de reparo de DNA marcado com fluorescência.

Investigando os prejudiciais efeitos de baixa pressão Plasma esterilização na sobrevivência de esporos de Bacillus subtilis usando Live celular microscopia

Nós descrevemos um método para investigar a capacidade de crescimento dica células de vegetais, incluindo tubos de pólen, pelos radiculares e musgo protonemata, para alongar através de aberturas muito estreitas (~ 1 µm) em um dispositivo microfluidic.

Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos

Aqui nós apresentamos protocolos para iniciante pesquisadores para iniciar fenotipagem para farmacologicamente importante bacteriana gênero Streptomyces.

Avaliação visual e microscópica de Streptomyces mutantes do desenvolvimento

Cluster de proteínas do receptor germinant em 'germinosomes' na membrana interna dos esporos de Bacillus subtilis . Descreveremos um protocolo usando proteínas de repórter de microscopia e fluorescente super resolução para visualizar germinosomes. O protocolo também identifica domínios de membrana interna de esporo que preferencialmente são corados com o corante de membrana FM4-64.

Visualização do Germinosomes e a membrana interna em esporos de Bacillus subtilis

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Este protocolo descreve a preparação de amostras intactas da camada de células do endosperma em sementes de Arabidopsis thaliana . O método requer apenas equipamentos de laboratório comuns, como agulha de injeção e pinça de precisão, e permite imagens fluorescentes de células vivas de alta resolução de células do endosperma em sementes em desenvolvimento e maduras.

Preparação de tecido intacto para análise microscópica da camada de células do endosperma em sementes de Arabidopsis em desenvolvimento e maduras

Aprenda a analisar a germinação de teliósporos em fungos causadores de doenças agrícolas usando microrespiração e microdissecção. Este método permite isolar estágios específicos e estudar mudanças metabólicas e de expressão gênica.

Investigando a germinação de Teliospore usando a análise de Microrespiration e Microdissection

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