Name: Self-standing eletroquímica set-up para enriquecer o ânodo-proliferação de bactérias no local (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Aprenda a enriquecer bactérias com transporte de elétrons extracelulares em campo sem fonte de energia externa. Este método eletroquímico facilita o isolamento prolongado de microrganismos de ambientes extremos e biomassa baixa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nós gostaríamos de reconhecer Roger Raiche e David McCrory nos permitir acesso aos cedros e consultoria sobre locais para a incubação de longo prazo. Agradecemos também a equipe de campo de cedros durante a temporada de 2013-2014: Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam e Matthew Schechter. Adicional graças a Shino Suzuki e Gijs Kuenen para investigação perspicaz e cultivo de apoio. Este trabalho foi financiado através de um subsídio para jovens cientistas, A e B da sociedade para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHI Grant Japão número 17H 04969 e 26810085, respectivamente e o Japão agência de pesquisa médica e desenvolvimento (17gm6010002h0002). EUA financiamento previstas por nos escritório da Global pesquisa Naval (N62909-17-1-2038) e o centro de investigações de Biosfera de energia escura (C-DEBI) (OCE0939564) e do Instituto de astrobiologia da NASA - vida subterrânea (NAI-LU) (NNA13AA92A). Parte deste trabalho foi realizado como parte de uma sociedade de Japão para a promoção das Ciências: a curto prazo bolsa pós-doutorado em Annette Rowe (PE15019) da Universidade de Tóquio, no laboratório de Kazuhito Hashimoto.

1. construção de um sistema de dois-eletrodo para incubação ambiental
<ol><li>
Preparação do material do ânodo e tratamento de carbono sentiram eletrodo (Figura 2).
	<ol>
<li>Corte o carbono sentiu igual dimensões dependendo do enriquecimento de biomassa desejado. Mergulhe cada eletrodo em etanol a 90% por 30 min e, em seguida, enxágue pelo menos 8 vezes com água desionizada, sonicating por 1 min depois de cada lavagem.</li>
		<li>Lave os eletrodos duas vezes em 1 M de HCl, mexendo durante um período mínimo de 12 h para cada lavagem.</li>
		<li>Seque os eléctrodos em forno quente (37 ° C) por 6-12 h ou até livre de líquido.</li>
		<li>Coloque eléctrodos ao fio de titânio, usando cola epoxy de grafite por protocolo do fabricante em um prato de politetrafluoroetileno (superfície non-stick). Nota: Usamos um fio de titânio devido à sua alta tolerância à corrosão aeróbia.</li>
		<li>Asse o eletrodo a 120 ° C, durante 6 h.</li>
		<li>Teste a resistência entre o fio de titânio e carbono de feltro com um ohmímetro e confirmar que a resistência entre o fio e eletrodos de feltro é inferior a 5 ohms.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroplation de platina sobre o carbono sentiu eletrodo para preparação do material do cátodo
	<ol>
<li>Mergulhe os elétrodos do carbono feltro, preparados na etapa 1.1, em M 2 KOH durante um período mínimo de 12 h em um recipiente de vidro.</li>
		<li>Para limpeza eletroquímica, coloque o eléctrodo como eletrodo (WE) a trabalhar em um reator de três-elétrodo, que também acomoda uma referência (RE) e o elétrodo contrário (CE). Conectar-se a nós, RE e CE para o potentiostat pelo jacaré. Confirme todas as conexões com um ohmímetro. Nota: Usamos uma Ag/AgCl (KCl saturado) arame eletrodo e um de platina como RE e CE, respectivamente.</li>
		<li>Poise o eletrodo no 1,0 V vs. Ag/AgCl para 600 s em solução eletrolítica contendo 2 M KOH (usando uma quantidade suficiente para submergir o eléctrodo inteiro). Retire o eletrodo do reator eletroquímico (que é feito de vidro). Enxague o eletrodo em água desionizada pelo menos 8 vezes, sonicating por 1 min depois de cada lavagem. Eletrodos de secos a 100 ° C, durante pelo menos 12 h.</li>
		<li>Para preparar a solução do chapeamento, adicione 100 g de ácido cítrico, 5 g de sulfato de sódio e 2 g de-hidrogenofosfato hexachloroplatinate (IV) hexa-hidratado para 1 L de ácido sulfúrico de 2m.</li>
		<li>Pesagem limpos secos eletrodos como preparado em etapas 1.2.1–1.2.2 e em seguida, cobrir o eletrodo em uma solução do chapeamento como preparado na etapa 1.2.3. Proceda à sonicação o eletrodo na solução do chapeamento três vezes para 30 s cada.</li>
		<li>Galvanizar os eléctrodos por equilibrar o potencial de eletrodo no-0.2 V vs Ag/AgCl para 460 s no chapeamento de solução. Lave os eletrodos duas vezes em água desionizada e descartar os resíduos de platina.</li>
		<li>Lave os eléctrodos em água desionizada pelo menos 3 vezes, sonicating por 20 s após cada lavagem. Enxaguar sem sonication pelo menos três vezes mais.</li>
		<li>Eletrodos a 100 ° C, durante pelo menos 12 h. eletrodo de pesagem para quantificar a platina eletrodepositada sobre o eletrodo de carbono sentiu a seco.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. construção e instalação do sistema dois-eletrodo
<ol><li>
Investigação do local de instalação para cada eletrodo no ambiente natural.
	<ol>
<li>Determine a concentração de oxigênio usando uma sonda de oxigênio dissolvido (DO).</li>
		<li>Verificar o perfil de profundidade de fazer no site. Nota: As condições ambientais desejadas para o ânodo são anóxia e hidratação consistente. Se desejado, remova a influência da fotossíntese oxygenic protegendo o ânodo de luz. As condições ideais para a colocação do cátodo são consistentemente hidratadas e perto de superfície águas fossem oxic. Se necessário, fixe flutuadores para manter contato de superfície no cátodo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Construção do sistema de incubação de 2-eletrodo de tipo de célula de combustível
	<ol>
<li>Conecte o fio isolado de comprimento desejado e uma pista de fio de titânio de eletrodos (um ânodo e um cátodo chapeado platina) rodando as duas linhas. Cobrir as conexões com cera resistente à água e proteger ainda mais usando tubos de encolher calor marinho da classe.</li>
		<li>Conecte dois cabos com um cátodo e um ânodo por um resistor de resistência conhecida. Nota: Para sistemas biológicos, resistores de baixas (10 a 1.000 Ω) resultam em atividade biológica mais consistente. Se desejado, um resistor de resistência elevada impedirá atividade biológica, como controlo negativo. Para evitar a corrosão de qualquer conexão entre o resistor e pistas, protegemos com tubos de psiquiatra do calor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medição de tensão e registro de temperatura ao longo do tempo.
	<ol>
<li>Verificar a tensão entre as extremidades do resistor para estimar a produção atual da reação da célula de combustível.</li>
		<li>Medir a diferença de tensão ao longo do tempo usando um voltímetro de log de dados com as conexões apropriadas, levando para o ânodo e o cátodo (Veja o protocolo do fabricante). Nota: O registo de dados de temperatura simultânea é opcional, mas esta informação pode ajudar a relacionar as alterações no atual para abióticos em oposição a flutuações biológicas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proteção de registrador de dados e conexões elétricas
	<ol>
<li>Use um saco estacionário e/ou plástico para proteger o agente de log e todas as conexões elétricas de chuva.</li>
		<li>Fixe os cabos firmemente para proteger do vento forte e um saco de plástico. Um exemplo é mostrado na Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coleta da amostra do eletrodo de meio ambiente
<ol><li>Para impedir que a qualidade da amostra ânodo sendo danificado devido a contaminação, colete o eletrodo sob condições anaeróbicas.</li>
	<li>Pelo menos 30 min antes da coleta da amostra de eletrodo, colocar um tubo de ensaio em uma localização anaeróbica. Por exemplo, colocar o tubo de ensaio e tampa separadamente na parte inferior da lagoa para fazer a garrafa dentro anaeróbica.</li>
	<li>Cortar a ponta do elétrodo com um cortador de fio de titânio, delicadamente coletar a amostra de eletrodo para o tubo de ensaio e selá-lo na zona anaeróbica água. Para manter a amostra fresca, armazene a amostra a 4 ° C imediatamente após a coleta de amostra. Nota: Como alternativa, eletrodos podem ser transferidos diretamente para anóxica (N2 purgado) médio. Usamos um meio de cedros (descrito por Suzuki et al . 11) que foi concebido a partir da geoquímica aquosa medido no local e alterado para fornecer nutrientes suficientes para o crescimento microbiano. Essa mídia foi modificada para experimentos de laboratório diferente.</li>
</ol>4. laboratório confirmação para a atual produção e análise de DNA
<ol><li>
Eletroquímica confirmação para a atual capacidade de produção de consórcios microbianos anexar para o eletrodo.
	<ol>
<li>Construir um reator eletroquímico de14,15 com uma Ag/AgCl (KCl saturado), um fio de platina e o eletrodo amostrado eletrodo como nós, CE e ré, respectivamente, em uma câmara anaeróbica. Encha o reator eletroquímico com meio de cedros contendo doadores de elétron de carboidratos solúveis.</li>
		<li>Equilíbrio do potencial de eletrodo no + 0,2 V vs Ag/AgCl e a medida da produção atual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extração de DNA da amostra eletrodo usando um DNA microbiano kit (veja a tabela de materiais).
	<ol>
<li>Limpar o interior do anaeróbico luvas com 70% de etanol e colocar um prato esterilizado em papel alumínio. Nota: Câmara anaeróbica mantém a concentração de oxigênio a menos de 1 ppm por manter uma atmosfera de hidrogênio em torno de ~ 2-3% para eliminar o oxigênio na presença de um catalisador de paládio.</li>
		<li>Abra o reator eletroquímico no porta luvas, colocar o eletrodo de amostra sobre o prato e cortar para um tamanho para caber o tubo utilizado no kit de DNA. Prossiga com o protocolo do fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nealson, K. H., Saffarini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+manganese+in+anaerobic+respiration%3A+environmental+significance%2C+physiology%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology, and regulation.</a> Annual Reviews of Microbiology. 48, 311-343 (1994).</li>
<li>Lovley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bug+juice%3A+harvesting+electricity+with+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bug juice: harvesting electricity with microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 4 (7), 497-508 (2006).</li>
<li>Rabaey, K., Rozendal, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+electrosynthesis+-+revisiting+the+electrical+route+for+microbial+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (10), 706-716 (2010).</li>
<li>Lovley, D. R., Coates, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioremediation+of+metal+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioremediation of metal contamination.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (3), 285-289 (1997).</li>
<li>Dinh, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+corrosion+by+novel+anaerobic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms.</a> Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).</li>
<li>Myers, C. R., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+manganese+reduction+and+growth+with+manganese+oxide+as+the+sole+electron+acceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor.</a> Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).</li>
<li>Lovley, D. R., Phillips, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mode+of+microbial+energy+metabolism%3A+organic+carbon+oxidation+coupled+to+dissimilatory+reduction+of+iron+or+manganese%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese.</a> Applied and Environmental Microbiology. 54 (6), 1472-1480 (1988).</li>
<li>Arnold, R. G., DiChristina, T. J., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+dissolution+of+Fe%28III%29+oxides+by+Pseudomonas+sp+200%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Reductive dissolution of Fe(III) oxides by Pseudomonas sp 200.</a> Biotechnology and Bioengineering. 32 (9), 1081-1096 (1988).</li>
<li>Rowe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electrochemical+enrichment+and+isolation+of+a+magnetite-reducing+bacterium+from+a+high+pH+serpentinizing+spring%5BTitle%5D)+AND+%22Environmentakl+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In situ electrochemical enrichment and isolation of a magnetite-reducing bacterium from a high pH serpentinizing spring.</a> Environmentakl Microbiology. 19 (6), 2272-2285 (2017).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+diversity+in+The+Cedars%2C+an+ultrabasic%2C+ultrareducing%2C+and+low+salinity+serpentinizing+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity serpentinizing ecosystem.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (38), 15336-15341 (2013).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+genomic+features+of+highly+alkaliphilic+hydrogen-utilizing+Betaproteobacteria+from+a+continental+serpentinizing+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Physiological and genomic features of highly alkaliphilic hydrogen-utilizing Betaproteobacteria from a continental serpentinizing site.</a> Nature Communications. 5, 3900(2014).</li>
<li>McCollom, T. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703716300941">Temperature trends for reaction rates, hydrogen generation, and partitioning of iron during experimental serpentinization of olivine.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 181, 175-200 (2016).</li>
<li>Morrill, P. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703713000768">Geochemistry and geobiology of a present-day serpentinization site in California: The Cedars.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 109, 222-240 (2013).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468611004543">In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes.</a> Electrochimica Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nakamura, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOkamoto%2C+A+%22Spectroelectrochemical+Investigation+on+Biological+Electron+Transfer+Associated+with+Anode+Performance+in+Microbial+Fuel+Cells%22">Spectroelectrochemical Investigation on Biological Electron Transfer Associated with Anode Performance in Microbial Fuel Cells</a>. , InTech. 207-222 (2012).</li>
<li>Deng, X., Nakamura, R., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/electrochemistry/83/7/83_15-E00044/_article">Electron from an Extracellular Electrode by Desulfovibrio ferrophilus Strain IS5 Without Using Hydrogen as an Electron Carrier.</a> Electrochemistry. 83 (7), 529-531 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O estudo descrito, vamos mostrar o enriquecimento de um consórcio microbiano, ligado com a produção atual em situ . Dimensiona os padrões observados no atual apoio atividade microbiana neste sistema ao longo do tempo curto e longo. O passo fundamental para a construção de um sistema funcional dois elétrodos (tipo de célula de combustível) está identificando e utilizando um local com um estábulo nível de água e concentração de oxigênio no ambiente. O cátodo é exposto ao oxigênio na interface água ar, enquanto o â...

Vários minerais-reduzindo micróbios foram mostrados para utilizar minerais de fase sólida como aceitadores de electrões terminal, por processos de transporte de elétrons extracelular (EET) que conduzir elétrons para o exterior da célula através de de enzimas redox1. EET é fundamental, não apenas para processos de micróbio-mineral mas também energia aplicada e tecnologias ambientais, tais como células de combustível microbianas2, síntese de eletrodo3e biorremediação4. Nova bactéria capaz de EET é muito procuradas e têm sido muito estudadas a partir de uma perspectiva fundamental ou aplicada5. No entanto, temos apenas limitado insight sobre a importância ecológica ou biogeoquímico destas bactérias. A maioria dos micróbios capazes de EET foram isolada após enriquecimento do aqua, sedimentos ou Digestores anaeróbicos usando aceitadores de electrões sólido como MnO2, Fe2O3 ou eletrodos preparados no laboratório6, 7 , 8. no entanto, esses métodos produzem frequentemente similares consórcios e potencialmente perder os táxons mais sensíveis que podem dominar a baixa energia ou sistemas de biomassa baixa, a capacidade destes micróbios para adaptar-se ao laboratório ou ambiente de cultura axénica9 de polarização . Geralmente para ambientes de baixa biomassa, grandes quantidades de água de um site são filtradas para concentrar as células bacterianas. No entanto, bactérias capazes de EET, muitas vezes, apresentam metabolismo anaeróbico e, portanto, exposição de oxigênio ainda mais pode inibir ou impedir o seu cultivo. Metodologias no local alternativas para concentrar as células sem expô-los ao oxigênio poderiam facilitar o isolamento de bactérias capazes de EET. Aqui, nós relatamos detalhes de configuração para uma técnica eletroquímica no local enriquecer o micróbio capaz de EET durante um longo período de tempo sem a necessidade de uma fonte de energia externa.
Usando nossos experimentos de electrocultivation de uma fonte altamente alcalina no norte da Califórnia, os cedros10, descrevemos esta técnica eletroquímica no local. A geoquímica das molas nos cedros são impactados por serpentinization no subsolo. As molas são altamente redutoras, com concentrações de oxigênio abaixo do limite de detecção sob a interface ar água, destacando o potencial para a produção de energia microbiana através de EET neste ambiente anóxico funcionalmente11. No entanto, não há provas para apoiar a micróbios EET-capaz de cedros (em 16S rRNA ou análise de Metagenomic). Mesmo que este ambiente tem sido caracterizado como aceitador de electrões limitado, o potencial para o uso de minerais insolúveis como aceitadores de electrões terminal, incluindo minerais tais como o ferro descobrindo minerais que resultam de serpentinization (i.e., magnetita), não tem sido extensivamente investigada12. Nós, portanto, implantado o nosso sistema eletroquímico no parque de campismo da Primavera, uma mola de pH elevado em cedros, enriquecer para EET-capaz de micróbios (Figura1)13.

<table><tbody><tr><td>Folha de feltro de carbono</td><td>n / a</td><td>n / a</td><td>Usado para ânodo e cátodo</td></tr><tr><td>Fio de titânio</td><td>A Nilaco Cooporation</td><td>TI-451485</td><td>Usado para construir sistema de célula de combustível</td></tr><tr><td>Epóxi de grafite</td><td>Electrolytica lnc.</td><td>n/a</td><td>Usado para conectar os eletrodos e o fio de Ti</td></tr><tr><td>Forno de secagem</td><td>Yamato</td><td>DY300</td><td>assar o eletrodo para solidificar epóxi grafite condutor</td></tr><tr><td>Multímetro digital</td><td>Fluke</td><td>616-1454</td><td>para verificar o valor ôhmico de resistência Sonda de</td></tr><tr><td>oxigênio dissolvido</td><td>Sper Science</td><td>#&nbsp; 850045</td><td>para verificar a concentração de oxigênio no ambientes</td></tr><tr><td>Resistor</td><td>Sodial</td><td></td><td>Usado para construir sistema de célula de combustível </td></tr><tr><td>Fio condutor</td><td>Pico</td><td>81141s</td><td>Usado para construir sistema de célula de combustível </td></tr><tr><td>Voltímetro e registrador de dados</td><td>T& D corporation</td><td>VR-71</td><td>Usado para gravação de dados</td></tr><tr><td>Hexacloroplatinato de hidrogênio (IV) Hexahidratado</td><td>wako</td><td>18497-13-7</td><td>Usado para eletropolação</td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Wako</td><td>038-06925</td><td>Usado para eletropolação</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Wako</td><td>192-04696</td><td>Usado para eletropolação</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Wako</td><td>083-01095</td><td>Usado para lavagem de eletrodos</td></tr><tr><td>Cilindro de vidro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Feito sob medida, usado como reator eletroquímico</td></tr><tr><td>Tampa e base de PTFE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Feito sob medida, usado como cobertura e fundação do reator eletroquímico</td></tr><tr><td>Borracha butílica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Feito sob medida, inserido entre cada componente do reator eletroquímico</td></tr><tr><td>Septa</td><td>GL Science</td><td>3007-16101</td><td>Usado como uma porta de injeção do reator eletroquímico</td></tr><tr><td>Eletrodo de óxido dopado com estanho de índio (ITO)</td><td>GEOMATEC</td><td>No.0001</td><td>Usado como um eletrodo de trabalho, eletrodo saturado de 5&Omega;/sq</td></tr><tr><td>Ag/AgCl KCl</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>Usado como um eletrodo de referência, &Phi; fio da platina de 0.30mm</td></tr><tr><td></td><td>O Nilaco Cooporation</td><td>PT-351325</td><td>usado como um elétrodo contrário</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>usado para os meios dos cedros (CMS)</td></tr> <tr><td>CaCO3</td><td>Wako</td><td>030-00385</td><td>usado para o CMS</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>usado para o CMS</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp; &touro; 6H2O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>Usado para CMS</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td>Usado para CMS</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Wako</td><td>194-03355</td><td>Usado para CMS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td>Usado para</td></tr><tr><td>CMS CABS</td><td>SANTA CRUZ</td><td>SC-285279</td><td>Usado para incubadora</td></tr><tr><td></td><td>CMS TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>Usado para máquina de autoclave de pré-cultivo</td></tr><tr><td></td><td>TOMY SEIKO CO., LTD.</td><td>LSX-500</td><td>Usado para esterilização do reator eletroquímico e do meio</td></tr><tr><td>Bancada limpa</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>Usado para evitar a contaminação do reator eletroquímico e do meio com outros micróbios</td></tr><tr><td>Separador de centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>Velocidade de rotação de até 6000&times; g é necessário</td></tr><tr><td>Gerador de gás nitrogênio</td><td>Puequ CO. LTD.</td><td>PNTN-2</td><td>O cilindro de gás nitrogênio também pode ser usado em vez do gerador de gás</td></tr><tr><td>Espectrômetro UV-vis</td><td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>Usado para otimização da densidade celular</td></tr><tr><td>Potenciostato</td><td>BioLogic</td><td>VMP3</td><td>Usado para formação de biofilme e experimentos de efeito de isótopos cinéticos</td></tr><tr><td>Circulador de água térmica</td><td>COMO UM</td><td>TR-1A</td><td>Usado para manutenção da temperatura do reator eletroquímico</td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>Usado para experimentos eletroquímicos</td></tr> Câmara <tr><td>anaeróbica</td><td>COY</td><td>TypeB (Vinil)</td><td>TO realizar experimentos sob condição anaeróbica</td></tr><tr><td>Ultraclean DNA Extraction kit</td><td>MoBio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

self-standing eletroquímica set-up para enriquecer o ânodo-proliferação de bactérias no local

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

Respiração anaeróbica, juntamente com o transporte de elétrons para minerais insolúveis (referido como o transporte de elétrons extracelular [EET]) é pensada para ser crítico para a produção de energia microbiana e persistência em muitos ambientes de subsuperfície, especialmente aqueles falta de aceitadores de electrões terminal solúvel. Enquanto micróbios capazes de EET foram isolados com sucesso de vários ambientes, a diversidade de bactérias capazes de EET é ainda mal compreendida, especialmente em difícil-para-amostra, baixa energia ou ambientes extremos, como muitos subsuperficial ecossistemas. Aqui, descrevemos um sistema eletroquímico no local para enriquecer bactérias EET-capaz usando um ânodo como um aceptor de elétron terminal respiratória. Este ânodo está ligado a um cátodo capaz de catalisar a redução de oxigênio abióticos. Comparar esta abordagem com electrocultivation métodos que usam um potentiostat para equilibrar o potencial de eletrodo, o sistema de dois-eletrodo não requer uma fonte de energia externa. Nós apresentamos um exemplo de nosso enriquecimento no local utilizado em um lago alcalino, cedros, um site serpentinization terrestres no norte da Califórnia. Tentativas anteriores para cultivar bactérias redutoras minerais foram infrutíferas, que é provavelmente devido a natureza de baixa biomassa deste site e/ou a baixa abundância relativa de metal reduzindo os micróbios. Antes de implementar nosso enriquecimento de dois elétrodos, medimos o perfil vertical da concentração de oxigénio dissolvido. Isso nos permitiu colocar o carbono de feltro ânodo e platina-galvanizado carbono feltro cátodo em profundidades que apoiaria aeróbias e anaeróbias processa, respectivamente. Após incubação no local, estamos ainda mais enriquecido o elétrodo anódico em laboratório e confirmou uma comunidade microbiana distinta em comparação com a superfície-anexado ou comunidades de biofilme normalmente observadas nos Cedros. Este enriquecimento que posteriormente levado ao isolamento do primeiro micróbio electrogenic de cedros. Este método de enriquecimento microbiano no local tem o potencial para aumentar consideravelmente o isolamento de bactérias EET-capaz de baixa biomassa ou difícil a habitats de amostra.

Produção atual foi medida com êxito durante cerca de 3 meses usando um registrador de dados de tensão conforme mostrado na Figura 3. Desta vez foi escolhida como era o mais longo período de incubação estável para a primavera, devido à forte queda de chuvas que afetam a primavera. Um período mais curto pode ser suficiente, apesar de um período mais longo poderia fornecer mais forte enriquecimento da biomassa. Nós confirmou a conexão do sistema de dois-eletrodo...

Técnicas de cultivo microbianas no local da enriquecimento ou em situ podem facilitar o isolamento dos táxons de difícil-para-cultura microbianos, especialmente de ambientes de baixa biomassa ou geoquímica extremas. Aqui, descrevemos um set-up eletroquímico sem usar uma fonte de alimentação externa para enriquecer cepas microbianas capazes de transporte de elétrons extracelular (EET).

Self-standing eletroquímica set-up para enriquecer o ânodo-proliferação de bactérias no local

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da microbiologia ambiental sobre a onipresença de micróbios capazes de EET, especialmente em condições de baixa biomassa ou geoquimicamente extremas. A principal vantagem do nosso enriquecimento microbiológico no local é que ele não requer uma fonte de energia que facilite o período de isolamento de meses para a captura de táxons difíceis de cultivar. De um modo geral, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a fabricação do sistema eletroquímico contém várias etapas que exigem uma implementação precisa.Para construir o sistema de incubação de eletrodos de célula de combustível tipo II, torça um fio isolado do comprimento experimental apropriado junto com um fio de fio de titânio dos eletrodos e cubra as conexões com cera resistente à água. Em seguida, proteja ainda mais os cabos com tubos termorretráteis de grau marítimo e conecte os dois fios com um cátodo e um ânodo por um resistor de resistência conhecida. Para medir o registro de temperatura de tensão ao longo do tempo, verifique a tensão entre as extremidades do resistor para permitir a estimativa da produção de corrente a partir da reação da célula de combustível.E use um voltímetro de registro de dados com a conexão apropriada que leva ao ânodo e ao cátodo para medir a diferença de tensão ao longo do tempo, de acordo com as especificações do fabricante. Para proteger o registrador de dados e as conexões elétricas, coloque um saco plástico ao redor do registrador e de todas as conexões elétricas e prenda bem o saco e os cabos para proteger os materiais de ventos fortes. Para coletar uma amostra de eletrodo do ambiente natural, pelo menos 30 minutos antes da coleta, coloque um tubo de ensaio de vidro sem tampa e a tampa do tubo de ensaio em um local anaeróbico.Depois de colocar a garrafa no local de coleta, certifique-se de que todas as bolhas de ar foram removidas de dentro da garrafa. No final do período de cultivo, use um alicate para cortar o chumbo de titânio do eletrodo. E colete suavemente a amostra do eletrodo no tubo de ensaio.Tampe o tubo de ensaio dentro da zona de água anaeróbica e armazene imediatamente a amostra a quatro graus Celsius. Para confirmar a produção atual, use o eletrodo amostrado, fio de platina e eletrodo de prata/cloreto de prata para construir um reator eletroquímico em uma câmara anaeróbica. Encha a célula eletroquímica com meio Cedars suplementado com doadores de elétrons de carboidratos solúveis.Equilibre o potencial do eletrodo em 0,2 volts positivos versus prata/cloreto de prata, eletrodo de referência saturado de cloreto de potássio. Em seguida, meça a produção de corrente e remova o eletrodo da célula do eletrodo para análise de RNA ribossômico 16S. Ao analisar a produção atual, é essencial evitar contaminar a amostra com bactérias do laboratório, especialmente dentro da câmara anaeróbica das luvas.Usando um registrador de dados de tensão, conforme demonstrado, a produção de corrente foi medida com sucesso por aproximadamente três meses. Uma alta corrente é normalmente observada neste sistema de dois eletrodos. Visto aqui é a resistência de 1.000 ohms em comparação com a resistência de controle negativo de 100 kiloohms.Neste experimento representativo, um aumento gradual da produção de corrente foi observado no primeiro mês em nossa localização em Cedars, sugerindo o crescimento, acúmulo ou acomodação de micróbios na superfície do eletrodo, que foi seguido por uma produção de corrente estável pelos próximos dois meses. Curiosamente, a produção atual geralmente oscila em um ciclo de aproximadamente 24 horas durante todo o período do enriquecimento eletroquímico. Dentro das comunidades microbianas observadas, diferenças distintas podem ser vistas na estrutura abrangente entre os filos associados a eletrodos e não eletrodos.Por exemplo, neste experimento, a comunidade microbiana associada ao eletrodo foi altamente enriquecida com bactérias de linhagens não cultiváveis, bem como linhagens de bacilos Firmicute. Uma mudança na composição das proteobactérias também foi observada nesta pesquisa, onde as proteobactérias beta dominaram as amostras associadas à calcita ambiental e ao plânctonico e, por outro lado, as proteobactérias gama dominaram as amostras associadas ao eletrodo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que fatores ambientais podem afetar a produção atual no local.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de microbiologia ambiental isolarem bactérias capazes de EET de vários ambientes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como conduzir o enriquecimento no local de bactérias com capacidade para EET sem a necessidade de uma fonte de energia.

self-standing-electrochemical-set-up-to-enrich-anode-respiring

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Fonte: Okamoto, A., et al. Instalação eletroquímica autoportante para enriquecer bactérias respiradoras de ânodos no local. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o uso de um sistema eletroquímico no local para enriquecer bactérias que respiram ânodos (ARB) a partir de reservatórios naturais. Um gradiente redox é estabelecido ao colocar o ânodo em águas profundas sem oxigênio e o cátodo em águas superficiais ricas em oxigênio. Os ARB formam biofilmes e transferem elétrons para o ânodo, que...

Enriquecimento de Bactérias Respiradoras de Ânodo Usando um Sistema Eletroquímico no Local

Fonte: Tokunou, Y. et al., Detecção Eletroquímica do Efeito Cinético de Isótopos de Deutério no Transporte Extracelular de Elétrons em Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a montagem e operação de um modelo de reator eletroquímico projetado para simular a formação de biofilmes em superfícies de eletrodos. A estimulação eletroquímica controlada promove a adesão microbiana, levando ao desenvolvimento gradual de um biofilme bacteriano monocamada.

Desenvolvendo um biofilme monocamada bacteriano usando um reator eletroquímico

O crescimento cronoamperométrico de biofilmes microbianos eletroativos anódicos em um reator de batelada alimentada usando uma configuração de três eletrodos, controlado por um potenciostato, é demonstrado. A transferência extracelular de elétrons é caracterizada por voltametria cíclica na presença do doador de elétrons e na ausência do doador de elétrons. A análise fundamental dos dados é demonstrada.

Biofilmes Microativos Eletroativos Derivados de Águas Residuais: Crescimento, Manutenção e Caracterização Básica

Demonstramos a extração de amônio de um fluxo rico em amônio usando um sistema eletroquímico e um bioeletroquímico. A configuração, operação e análise de dados do reator são discutidas.

Recuperação de Amónio Eletroquimicamente e Bioelectrochemically Induzida

A redução de sulfato microbiano é um processo de grande importância na biotecnologia ambiental. O sucesso dos reatores sulfidogênicos depende, entre outros fatores, da composição microbiana do lodo. Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver lodo sulfidogênico a partir de sedimentos de fontes hidrotermais em um reator UASB para fins de decloração redutiva.

Desenvolvimento de sulfidogenico Sludge de sedimentos marinhos e Redução Trichloroethylene em um Reator Anaeróbio de Manta de Lodo

É apresentado um protocolo para medir a condutividade elétrica de biofilmes microbianos de vivos sob condições fisiologicamente relevantes.

Caracterizando o transporte de elétrons através de biofilmes vivos

Aqui nós apresentamos um protocolo de toda a célula eletroquímicos experimentos para estudar a contribuição do transporte de protões para a taxa de transporte de elétrons extracelular através do membrana externa citocromos complexos em Shewanella oneidensis MR-1.

Eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1

Aqui apresentamos um protocolo para caracterizar a transferência de elétrons extracelular mediada (EET) em bactérias do ácido lático usando um sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras. Ilustramos este método com Lactiplantibacillus plantarum e o mediador redox ácido 1,4-dihidroxi-2-naftóico e fornecemos uma descrição completa das técnicas eletroquímicas usadas para avaliar o EET mediado.

Caracterização da transferência de elétrons extracelular mediada em bactérias do ácido lático com um sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras

Doença casca Beech é iniciada através da alimentação atividades do inseto escala de faia que criar pontos de entrada de fungos na casca. Árvores que são resistentes ao inseto escala também são resistentes às doenças. Aqui apresentamos o protocolo que temos desenvolvido para a tela faias individuais de resistência à escala de faia.

Uma técnica para Screen americana Beech para Resistência ao Beech Scale Insect (<em&gt; Cryptococcus fagisuga</em&gt; Lind.)

Nós simulamos um sistema de ressurgência marinha ferruginoso Precambrian em uma coluna de fluxo vertical-escala de laboratório. O objetivo foi compreender perfis como geoquímicas de O2 e Fe (II) evoluir como cianobactérias produzem O 2. Os resultados mostram a criação de um chemocline devido a Fe (II) oxidação pelo fotossinteticamente O produziu 2.

Laboratório de Simulação de um ferro (II) rico em Precambrian Marinha Ressurgência do sistema para explorar o crescimento de bactérias fotossintéticas

Aprenda a enriquecer bactérias com transporte de elétrons extracelulares em campo sem fonte de energia externa. Este método eletroquímico facilita o isolamento prolongado de microrganismos de ambientes extremos e biomassa baixa.

Self-standing eletroquímica set-up para enriquecer o ânodo-proliferação de bactérias no local

Explorar mais vídeos