Name: Immunostimulatory agente avaliação: Linfoide em injeção e extração de tecido ativação rota dependente de célula dendrítica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a isolar linfonodos mediastínicos em camundongos após injeção de nanomaterial imunoestimulante. Esta técnica permite avaliar a ativação de células dendríticas linfoides em respostas imunológicas.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de descoberta de materiais criativo através da nacional pesquisa Fundação da Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, TIC e futuro planejamento (NRF-2017M3D1A1039421) e pelo programa de biotecnologia Marinha financiado pelo Ministério dos oceanos e das pescas, República da Coreia e uma concessão (20150220).

Todos os procedimentos experimentais, incluindo o isolamento de manipulação, sacrifício e órgãos animal foram realizados em estrita conformidade com as regras do Comité de uso no centro clínico de saúde pública de Shanghai e Asan Medical Center e cuidado do Animal Internacional. O protocolo de estudo foi aprovado pelas respectivas comissões sobre a ética de experimentos Animal no centro clínico de saúde pública de Shanghai (Mouse protocolo número: SYXK-2010-0098) e Asan Medical Center (2016-02-168).
1. preparação do Material
Nota: Um nano-adjuvante, INP, composto por uma transportadora de lipídios-DNA Self montado, ou seja U4T, e contendo oligonucleotide de CpG-motivo, eCpG, foi empregado no atual estudo para testar a rota de injeção apropriado para vacinação e imunoterapia em camundongos2 . Importante, outras moléculas terapêuticas potenciais como antígenos, anticorpos e agentes adjuvante podem ser substituídas pelo INP e testaram utilizando a mesma metodologia descrita abaixo.
<ol><li>INP formulação2,4,7<ol>
<li>Recoze a U4T (160 µM, transportadora) com eCpG (80 µM, contendo uma sequência de agonista TLR9) na presença de 1x tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) e MgCl2 (2 mM). O volume padrão para recozimento é entre 50 e 110 µ l em um tubo PCR. Aquecer a mistura a 95 ° C por 10 min e em seguida, refresque lentamente (1 ° C/16 min) a 25 ° C, usando um thermocycler. O protocolo de recozimento requer aproximadamente 2 h. Cuidado: O líquido contendo U4T é muito espumoso e deve ser manuseado com cuidado.</li>
		<li>Fazer 50 alíquotas µ l da preparação INP; Use 50 µ l do material para cada injeção. Nota: No caso de 100 µ l por injecção, repita a etapa 1.1 com cálculo adequado dos ingredientes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. general Animal procedimentos
Nota: Os métodos alternativos para lidar com os ratos podem ser usados dependendo dos requisitos de laboratório e protocolos aprovados animal8. O tipo de ratos usado é camundongos C57BL/6 e fêmeas de 6 semanas de idade.
<ol><li>Lista de materiais<ol>
<li>Preparar o líquido anestésico (isoflurano), máquina anestésica, câmara de inalação de dióxido de carbono (CO2), gaze esterilizada, fórceps, retenção de rato, luvas, enganchado fórceps, tesoura de dissecação de 1 polegada, tesoura dissecação de 2 polegadas, álcool para esterilização e seringa de insulina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anestesia inalantes Nota: A anestesia é obrigatória para intranasal, subcutânea, Whitney e injeções intravenosas de ratos9. Uma câmara de indução com um tanque de máquina e oxigênio vaporizador ligado é usada para este procedimento.<ol>
<li>Colocar o animal na câmara de indução e certifique-se de fechar bem a tampa.</li>
		<li>O oxigênio a 1 L/min de fluxo e definir a configuração de vaporizador com um nível de indução de 4% de isoflurano.</li>
		<li>Variar o tempo de exposição de animais na câmara, dependendo do peso do animal; no entanto, mais de 10 s de exposição e de acompanhamento a cada 5 min é necessário para anestesia10. Nota: Sem pedal reflexo indica sucesso anestesia.</li>
		<li>Desligue o indutor de isoflurano e fluxo de 1 L/min de oxigênio para evitar a exposição pessoal ao gás de isoflurano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sacrifício<ol>
<li>Preparar uma câmara para CO2 inalação de sacrifício em conformidade com o NIH "orientações para a eutanásia de roedores usando dióxido de carbono"11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resposta de mordaça de teste para confirmar que o animal é totalmente sacrificado.<ol>
<li>Verifique se que o mouse é sacrificado beliscando a ponta do seu pé e confirmando sem resposta de mordaça. Se houver uma resposta, repita o passo 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desinfecção<ol>
<li>Desinfecte todas as áreas de superfície usadas para injeções ou dissecções com spray de álcool e gaze esterilizada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Armazenamento de órgão<ol>
<li>Use a pinça para remover toda a gordura e sangue que rodeiam os órgãos. Guarde estes tecidos colhidos individualmente em uma placa de Petri preenchida com 3 mL de PBS. O recipiente e a mídia pode ser diferentes dependendo dos requisitos do procedimento subsequente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. injeção rotas
<ol><li>Use os métodos de injeção de seis para investigar respostas imunes de injeção-dependente: oral, intranasal, subcutânea, Whitney, intraperitoneal e intravenosa8,12,13.</li>
</ol>4. isolamento de linfonodos e baço
Nota: Usar ratos magros jovens e saudáveis (6 semanas de idade) para esses procedimentos, porque as gorduras que se acumulam tipicamente em torno de gânglios linfáticos em ratos mais velhos são difíceis de remover e pode impedir a visualização adequada do órgão.
<ol><li>Etapas pré-colheita Nota: Esta seção descreve a pós-injeção de colheita do iLN, baço e mLN de ratos para a análise de estimulação imune. Consulte os passos de 2.3-2.5 para sacrifício, amordaçar a resposta e métodos de desinfecção.<ol>
<li>PIN dos membros do rato para a placa de espuma cirúrgica e esterilizar o lado ventral do mouse com etanol a 70%.</li>
		<li>Escolha um local 2 cm acima da área genital e uso viciado fórceps para puxar para cima a tampa exterior da pele, como uma tenda. Fazer um corte de aproximadamente 1 cm neste local e deslize a tesoura (2 polegadas) debaixo da pele, tornando ainda mais cortes de dissecação.</li>
		<li>Para o tegumento, corte verticalmente através da pele exterior com ambos os braços da tesoura (2 polegadas). Expor os órgãos internos cobertos com peritônio.</li>
		<li>Pino, a camada exterior da pele.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento do linfonodo inguinal (iLN)
	<ol>
<li>Localize a iLN no lado esquerdo da perna seguindo a conjunção da embarcação de sangue descendo a perna esquerda, que aparece como uma letra inclinada 'Y'. Nota: Para os ratos injetados por via subcutânea, escolha uma iLN do mesmo lado do local da injeção.</li>
		<li>Descobri a camada com duas pinças para arrancar a camada lipídica coberto e colher a iLN amarela pálida (forma de feijão, 2 mm). Para posterior tratamento e armazenamento do tecido, consulte Etapa 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento do baço 14<ol>
<li>Faça uma tenda no centro do peritônio, usando viciado fórceps em uma mão e usar pequenas fina tesoura (1 polegada) na outra mão para cortar o peritônio.</li>
		<li>Pinça de uso viciado na mão esquerda para agarrar o intestino e vire-a para localizar o baço como feijão vermelho (comprimento de cerca de 14 mm) anexado ao lado superior esquerdo do abdômen do mouse.</li>
		<li>Puxe delicadamente o baço com outro conjunto de pinça na mão direita enquanto desanexando outros órgãos com a pinça de viciado. Siga o passo 2.6 para armazenar o baço. Nota: Cuidado é necessário ao colher o baço, como é um órgão macio facilmente danificado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento do linfonodo mediastinal (mLN) Nota: O mLN está localizado a aproximadamente 1 cm abaixo das costelas e é coberto por outros órgãos como o coração e os pulmões. Devido à sua localização e tamanho pequeno, é importante expor cuidadosamente a área circundante, usando pinças e tesouras (1 polegada).<ol>
<li>Corte o diafragma e destacá-lo partir as costelas. Segure o corpo das costelas com fórceps e em seguida, corte o lado esquerdo e direito das costelas com tesouras (1 polegada). Coloque as costelas corte por cima do ombro do rato o direito de expor o coração e os pulmões. Nota: tenha cuidado para não cortar qualquer um dos vasos sanguíneos ao redor do coração e pulmões, como vazando sangue torna difícil localizar o minúsculo mLN translúcido. Se qualquer os vasos sanguíneos são cortados, suavemente, absorva o sangue na área com gaze.</li>
		<li>Usando fórceps viciado na mão direita, vire o coração e os pulmões suavemente para a direita até a espinha dorsal é exposta. Use um par de pinças regulares na mão esquerda para remover a iLN com a pinça viciada na mão direita para ajudar com esta colheita.</li>
		<li>Pegue os pulmões e lançá-los até a espinha dorsal é amplamente exposta. O mLN (uma translúcido em forma de feijão estrutura de aproximadamente 2 mm em tamanho) está localizado entre os pulmões e a coluna vertebral.</li>
		<li>Utilize o fórceps enganchadas para expor a área em torno do mLN e a outra pinça para extrair o tecido. Nota: O mLN está rodeado por inúmeros outros tecidos que devem ser cuidadosamente removidos com pinça antes da colheita.</li>
		<li>Consulte a etapa 2.7 para instruções em armazenar o mLN colhido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. preparação das amostras para citometria de fluxo
Nota: Para ensaiar a ativação das DCs no iLN colhida e baço, mLN, suspensões de célula única desses tecidos estão manchadas com anticorpos conjugados a fluorescência como DC específicos marcadores moléculas coestimulatórias e histocompatibilidade complexas moléculas e analisadas por citometria de fluxo.
<ol><li>
Preparação de suspensões de célula única: baço
	<ol>
<li>Adicionar 5 mL de meio de cultura fresco (CM) num prato de 6mm cultura e colocar as amostras no gelo.</li>
		<li>Remover os tecidos circundantes, sangue e gordura e coloque o tecido na tampa do prato a cultura.</li>
		<li>Corte os tecidos em pequenos fragmentos (< 1 mm) com uma tesoura curva. Suspender os fragmentos em PBS, seguido por girando para baixo o tecido usando uma centrífuga a 646 × g por 5 min e retirar o sobrenadante.</li>
		<li>Suspender as amostras novamente em 3 mL de CM e digerir os fragmentos com 200 µ l de solução de 2% fetal de soro bovino (FBS) suplementado com colagenase IV por 20 min.</li>
		<li>Homogeneizar e incubar a amostra a 37 ° C por 1 h. filtrar os tecidos digeridos através de malha de nylon (100 nm) e girá-los para baixo. Lavar as células únicas em 5 mL de PBS e remover o sobrenadante por centrifugação.</li>
		<li>Ressuspender as células em 5 mL de solução de isolamento de célula. Carrega novamente outra camada de 5 mL da solução de isolamento de células claras para formar uma pilha de camada por camada aquosa.</li>
		<li>Centrifugue a preparação da célula em 2012 × g por 10 min. obter o sobrenadante, que é a fração de densidade mais leve (< 1,077 g/cm3), para análise de citometria de fluxo subsequente.</li>
		<li>Conte o número de células com um hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de suspensões de célula única: linfonodo
	<ol>
<li>Siga o passo 5.1.1-5.1.2.</li>
		<li>Adicione 5 mL de CM, usando uma pipeta de 10 mL para suspender as células pipetando 3 - 4 vezes. Após a suspensão completamente as células, usar o engranzamento de nylon estéril para filtrar as células para coleção em um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Girar as células para baixo a 646 ×g por 7 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione um adicional 5 mL de CM em pipeta de 10 mL para melhor suspender as células pipetando.</li>
		<li>Lave com PBS e contar o número de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de citometria de fluxo
	<ol>
<li>Alíquota de 0.5-1 × 106 células para cada célula de fluorescência-ativado classificação tubo (FACS).</li>
		<li>Centrifugar a 646 × g a 4 ° C por 5 min e aspirar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 5 µ l de cada diluição fluorescência-conjugado anticorpo preparação para as células para re-suspender o centrifugado e vortex. Nota: É importante proteger o centrifugado de exposição à luz, tanto quanto possível, porque os anticorpos fluorescente etiquetados são sensíveis à luz. Gerar uma mistura de mestre do anticorpo e sempre adicionar bloco Fc.</li>
		<li>Prepare o buffer de FACS usando 100 µ l de PBS, 1% de FBS regular inactivadas pelo calor e 0,1% de azida de sódio.</li>
		<li>Coloque a amostra no tubo a 4 ° C por 30 min. enxaguar as células com 2-4 mL de FACS buffer e centrifugar a amostra a 1700 rpm para 7 min a 4 ° C.</li>
		<li>Ressuspender as células em 500 µ l de tampão de FACS no escuro. Analise as células por citometria de fluxo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Park, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Preparation+of+dodecynyl+modified+DNA+nanoparticles+with+unmethylated+CpG+adjuvant+and+ovalbumin+for+immunostimulation%22">Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation</a>. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).</li>
<li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li>
<li>Pal, I., Ramsey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+lymphatic+system+in+vaccine+trafficking+and+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).</li>
<li>Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsbiomaterials.7b00440">Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo.</a> ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).</li>
<li>Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+migration+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell migration in health and disease.</a> Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).</li>
<li>Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+lymph-borne+dendritic+cells+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).</li>
<li>Desormeaux, A., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="https://staff.unimelb.edu.au/__data/assets/pdf_file/0009/1974339/STANDARD-Anaesthesia-for-mice-and-rats-FINAL.pdf">General anesthesia of mice and rats</a>. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22">Guidelines for the Euthanasia of Animals</a>. , Veterinary Record. (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10215/compound-administration-iii">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nri1669">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Muitos avanços em nanotecnologia e Imunologia foram obtidos através de pesquisas terapêuticas de entrega da droga e imunoestimulação. A seleção cuidadosa do método de injeção é conhecida por ser importante para imunoestimulação, que foi o foco do presente estudo.
Rotas de injeção diferentes foram avaliadas para um naturalmente atóxico e biodegradável baseado em DNA material, INP (immunostimulatory nanopartículas), para determinar qual rota rendeu o melhor resultado. Essa abordagem também é rel...

Avanços em imunologia e nanomateriais têm levado a uma abundância de potenciais novas estratégias terapêuticas para aplicações em biomedicina, incluindo imunoestimulação e entrega da droga. Otimização da rota de administração é um aspecto vital que afectam a eficácia dos agentes immunostimulatory. Uma nanopartícula immunostimulatory (INP) que consiste de DNA é um adjuvante de nano-imune recém-desenvolvido Self montado por microfases separação devido à estrutura anfifílica de lipídios-DNA1. Portanto, os protocolos para INP envolvendo a administração do material1 no vivo através de diferentes rotas e três procedimentos para colheita de tecidos apropriados como o linfonodo inguinal (iLN), mediastinal LN (mLN) e baço, são descrito. Finalmente, estes tecidos foram analisados para a ativação de células dendríticas (DC), as células apresentadoras mais poderosas no sistema imunológico. Este protocolo também pode ser aplicado para a avaliação de antígenos, anticorpos ou outro adjuvantes imunes2.
Nós testamos a formulação do INP, porque é um agente que tem mostrado grande promessa. INP é um receptor Toll-like 9 (TLR9) material adjuvante que contém ácidos nucleicos, para qual avaliação de imunoestimulação eficácia é necessária para teste de injeção diferentes métodos3. Neste contexto, a estimulação de DCs é um ponto de extremidade potente para avaliação na vivo . Depois de moléculas do antígeno ou immunostimulatory são fagocitadas por DCs no sangue ou tecidos periféricos, essas células migram para órgãos linfoides como o baço e o LNs4,5. Assim, ativação de DC foi analisada no baço, mLN dos animais injetados e iLN. Corretamente colheita desses tecidos, portanto, é também crucial para avaliar a resposta imune para um romance de adjuvante ou patógenos5. Essa colheita de tecido também é importante para o desenvolvimento de uma metodologia imunológica romance como uma terapia de câncer. Além disso, este protocolo pode ser usado para verificar a eficiência de outras drogas, tais como vírus de imunodeficiência humana terapêutica6.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tampão fosfato solução salina</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td>Órgãos de lavagem</td></tr><tr><td>(PBS, pH 7.4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>solução de isoflurano&nbsp;</td><td>Aesica Queenborough limited</td><td>26675-46-7</td><td>Processo de anestesia</td></tr><tr><td>Tuberculina seringa 1mL -</td><td>Junglim</td><td>N/A</td><td>Injeção</td></tr><tr><td>50 mL tubo cônico&nbsp;</td><td>Processo de anestesia</td> <td>S.P.L</td><td>50050</td></tr><tr><td>1mL Seringa de insulina&nbsp;</td><td>(BD Ultra-FineTM&shy;II)_short agulha</td><td>324826</td><td>Injeção Intramuscular</td></tr><tr><td>DMEM Hiclona de Alta Glicose</td><td></td><td>SH30081.01</td><td>Armazenamento de órgãos</td></tr><tr><td>Histopaco</td><td>&nbsp; Análise FACS Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico anidro 99,5 %&nbsp;</td><td>Daejung</td><td>4022-4110</td><td>Desinfetante</td></tr><tr><td><forte>Equipamentos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FineCycler C100 (Termociclador)</td><td>Ssufine-Anealing</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>FACS tubo&nbsp;</td><td>Análise FALCON</td><td>2052</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo automatizado de alto desempenho</td><td>BD (EUA), análise FACSVerse-FACS</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunostimulatory agente avaliação: linfoide em injeção e extração de tecido ativação rota dependente de célula dendrítica

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Para a avaliação de um novo agente terapêutico para imunoterapia ou vacinação, análise de ativação de células imunes nos tecidos linfáticos é essencial. Aqui, nós investigamos os efeitos imunológicos de um imunoestimulante romance lipídios-DNA em forma de nanopartículas de rotas diferentes de administração no mouse: oral, intranasal, subcutânea, Whitney, intraperitoneal e intravenosa. Essas injeções influenciará diretamente a resposta imune e colheita de tecidos linfáticos e análise de ativação de células dendríticas (DC) nos tecidos são partes cruciais dessas avaliações. A extração dos linfonodos mediastinais (mLNs) é importante mas bastante complexo devido ao tamanho e localização deste órgão. É descrito um procedimento gradual para colheita do baço, mLN e linfonodo inguinal (iLN) e análise de ativação de DC por citometria de fluxo.

Para avaliar rotas de injeção apropriado do INP para ativação de tecido linfático DC, a população de DC como linhagem foi definida como –CD11c+ células no baço, iLN e mLN e analisados os níveis de expressão de moléculas coestimulatórias. Tratamento de INP por subcutânea (s.c.) e injeção intravenosa (i.v.) promoveu um aumento substancial na expressão CD40, CD80 e CD86 no baço e iLN DCs (Figura 2B e 2C). ...

Procedimentos experimentais para a extração subsequente dos tecidos linfáticos para testar a ativação de células dendríticas linfoides são descritos após o tratamento de um nanomaterial imunoestimulante.

Immunostimulatory agente avaliação: Linfoide em injeção e extração de tecido ativação rota dependente de célula dendrítica

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

O objetivo geral deste procedimento é familiarizar a técnica única necessária na isolação do linfonodo mediastinal de camundongos. A operação foi realizada após a injeção de material imunoestimulante em seis rotas diferentes em camundongos. Neste estudo, utilizamos uma nova classe de material formando estruturas nano-dimensionadas.Os surfactantes consistem em grupo chefe hidrofílico e cauda hidrofóbica. Esses formam micela esférica ou outra estrutura secundária devido à separação de microfagos. Nós usamos esta propriedade para uma bio macromolécula que é DNA.Anfífilos de DNA, mostrados aqui, como nucleotídeos regulares como A, C, G, T, tem blocos hidrofílicos, enquanto as nucleobases neurocelulares modificadas lipídicas atuam como unidades hidrofóbicas. O oligo modificado foi sintetizado pelo sintetizador de DNA em octogramas em larga escala. Na mídia, os DNAs lipífilis anfílicos formam espontaneamente micelas esféricas nano-dimensionadas.Quando a micela é formada, o DNA permanece sozinho como um portador vazio com cerca de 10 nanômetros de diâmetro. Para equipar o portador com estimulante imunológico, é simples a questão de estender a sequência de DNA com receptor de pedágio nove adjuvantes ou seja, eCpG. DNA lipídido e base eCpG aqui, portanto, a superfície externa da micela é degradada com sequência cpg.Então nomeamos essa partícula nano estimulante imunológica como o INP. Para determinar a maneira adequada dos INPs para resposta imune, injetamos INPs em camundongos em 64 rotas de injeção e, consequentemente, um tecido linfático adequado foi analisado. Para instruções de injeção mais detalhadas, encontre um artigo JOB publicado por Charles River em 2012.A principal vantagem deste vídeo é mostrar visualmente como obter linfonodos mediastinal. O vídeo mostra explicitamente a localização do linfonodo mediastinal que muitas pessoas encontram dificuldade em isolar os órgãos. Todos os experimentos foram realizados sob as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Centro Clínico de Saúde Pública de Xangai, ou Faculdade de Medicina da Universidade de Ulsan.Esta parte mostrará a localização específica de órgãos ou tecidos, que são cruciais para a análise imunológica. Baço e dois linfonodos serão isolados. Em primeiro lugar, os camundongos foram sacrificados pela eutanásia de inalação de dióxido de carbono e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento seguindo a orientação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso animal.De agora em diante vamos encontrar os órgãos e isolá-los. Primeiro, conserte corretamente o mouse na mesa de operação com quatro pinos na palma do mouse. Esterilize a área de dissecção com álcool.Dissecar a tampa externa da parte inferior do abdômen do rato com uma tesoura de grande porte. Use fórceps para abrir os dois lados do acessório e fixá-lo com pinos na mesa de operação. A localização do linfonodo inguinal é exposta ao encontrar a conjunção da embarcação descendo em direção à perna esquerda.A forma do vaso parece a letra do alfabeto inclinado Y.Descubra a camada com as fórceps e puxe-a da pele. Corte o peritônio com uma tesoura menor para expor órgãos internos. Mova o intestino para a direita usando fórceps e, em seguida, enrole em baço em forma, que mostram no lado esquerdo, superior esquerdo do abdômen.É necessária atenção adicional durante o procedimento, uma vez que o baço é fácil de interromper. Finalmente, o ponto chave deste vídeo:coleta de linfonodo mediastinal. Está localizado sob a parte superior do pulmão, que é difícil de ver devido ao seu pequeno tamanho e localização um pouco escondida.Exponha cuidadosamente a área usando pequenas tesouras e fórceps. Corte os dois lados das costelas e o diafragma também. Corte as costelas acima do peito.Durante o procedimento evite danificar o coração e os vasos sanguíneos, pois pode cegar o local, encontrando o linfonodo mediastinal translúcido. Se por acidente o vaso sanguíneo estourou, limpe suavemente o sangue com gaze. Pegue o lado esquerdo do pulmão e vire-o suavemente para o outro lado para ver debaixo do pulmão.Puxe o linfonodo mediastinal usando fórceps. Depois de colher o linfonodo mediastinal, certifique-se de remover perfeitamente toda a gordura e sangue ao redor do linfonodo, uma vez que o tecido indesejado pode influenciar a análise. Finalmente, todos os órgãos isolados em uma placa de petri cheia de mídia.Foram analisadas 0,1 vezes 10 para a sexta célula nesta citometria de fluxo. Com base na população de leucócitos de getter de força e tamanho foi fechada e que as células foram excluídas pela coloração escura. 24 horas após a injeção inp por 64 rotas de injeção, baço, linfonodo inguinal e linfonodo mediastinal foram colhidos e analisados ativação dc por citometria de fluxo.Com base na estratégia da população de citometria de fluxo DC foi definida como células negativas cd11C positivas e de linhagem no leucócito vivo. Notavelmente, a injeção intranasal do INP promoveu aumentos significativos na expressão CD40, 80, 86 no linfonodo mediastinal em comparação com a PBS para o controle. Portanto, esses dados sugeriram que a injeção intranasal de INP pode ser usada como adjuvante mucosa para o aprimoramento da imunidade no pulmão.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um método de conversão de células dendríticas (DCs) em DCs tolerogênicas (TolDCs) usando um agente farmacológico imunomodulador. Essa conversão é confirmada pela avaliação da função TolDC por meio de seu efeito imunossupressor nas células T CD4+.

Efeito de um agente farmacológico imunomodulador na interação entre células dendríticas e células T CD4+

O método mais vulgarmente usado para a geração de grandes números de células dendríticas autólogas (DCs), para uso na imunoterapia de tumores é descrita. O método utiliza a IL-4 e GM-CSF a partir de monócitos diferenciam DCs. As DC imaturas são estimuladas a maduro e, em seguida, carregado com os antigénios, antes de serem injectadas de novo no paciente.

Preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia

Vacinação profilática e terapêutica, muitas vezes não estimulam fortes respostas imunes, devido à semana de drenagem da vacina para os gânglios linfáticos e, consequentemente, fraco envolvimento das células do sistema imunológico. Por injecção directa de vacina para os nódulos linfáticos, assim chamada injecção intralinfática, a eficácia da vacina pode ser fortemente melhorada e as doses de vacina podem ser reduzidos.

Intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos

As células dendríticas imaturas podem ser diferenciadas seletivamente em células dendríticas tolerogênicas ou maduras para regular o equilíbrio entre imunidade e tolerância. Este trabalho apresenta um meio de gerar a partir de células dendríticas derivadas de monócitos imaturos (moDCs), moDCs tolerogênicas in vitro e maduras que diferem em fenótipos metabólicos.

Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Apresentamos aqui um pedido de uma norma técnica imunológica (CFSE manchado OT-eu proliferação) destinados a monitorar rapidamente mediada por adjuvante T linfócitos citotóxicos (CTL) geração in vivo. Esta estimativa rápida das capacidades CTL é útil para o desenvolvimento de vacinas profiláticas contra patógenos intracelulares, bem como as vacinas terapêuticas do câncer.

Rápida na Vivo avaliação dos recursos de geração de linfócitos de T citotóxicos do adjuvante para desenvolvimento de vacinas

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação na vivo da ativação de células (células T) de T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pela medula óssea de GM-CSF (BM)-derivado de células dendríticas (DCs). Além disso, este protocolo descreve isolamento BM e células T, geração de DC e DC e células T transferência adotiva.

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

O dispositivo de transimmunização (TI) ou a placa e os protocolos relacionados foram desenvolvidos para replicar as principais características da fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), em um ambiente experimental, permitindo a produção de células dendríticas ativadas fisiologicamente, células (DCs) para a imunoterapia do cancro.

Novo protocolo para a geração de células dendríticas imunogênicas fisiológicas

A metodologia descreve a geração de células dendríticas derivadas de monócitos bovinos (MoDCs) e sua aplicação na avaliação in vitro de candidatos antigênicos durante o desenvolvimento de potenciais vacinas veterinárias em bovinos.

Determinação da imunogenicidade vacinal utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos

Descrevemos um procedimento para avaliar a capacidade de agentes farmacológicos gerarem células dendríticas tolerogênicas a partir de células dendríticas derivadas de monócitos virgens in vitro e validar sua potência por geração autóloga de células T reguladoras.

Um método simples e eficiente para testar agentes imunomoduladores para geração de células dendríticas tolerogênicas a partir de monócitos CD14+ humanos

Aprenda a isolar linfonodos mediastínicos em camundongos após injeção de nanomaterial imunoestimulante. Esta técnica permite avaliar a ativação de células dendríticas linfoides em respostas imunológicas.

Immunostimulatory agente avaliação: Linfoide em injeção e extração de tecido ativação rota dependente de célula dendrítica

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