Name: Eficiente geração de pâncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ Posterior Foregut/pancreático progenitores de hPSCs em culturas de adesão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em progenitores pancreáticos PDX1+ usando cultura de adesão em monocamada. Este método garante populações homogêneas para estudos de biologia de células-tronco.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo financiamento da sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) através de Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 e 18 K 08510) T.T., e subsídio para JSPS bolsistas de pesquisa (número de concessão KAKENHI de JSPS 17J07622) AK, e a agência de Japão para pesquisa médica e desenvolvimento (AMED) através da sua pesquisa conceder "Núcleo centro para pesquisa de células, a rede de centro de pesquisa para realização de medicina regenerativa de iPS" a K.O. Os autores agradecer Dr. Peter Karagiannis por ler o manuscrito.

Experimentos utilizando hPSCs foram aprovados pelo Comitê de ética do departamento de medicina e pós-graduação faculdade de medicina, Universidade de Kyoto.
1. preparação de materiais
Nota: Prepare todas as mídias e os reagentes para cultura de células em um ambiente estéril. Aquecer a base de meios de cultura à temperatura ambiente (RT) antes do uso. Médio para diferenciação é usada dentro de 6 h em RT. detalhes dos reagentes estão listados na Tabela de materiais.
<ol><li>
Diferenciação (figura 1A)
	<ol>
<li>Médio de 1A fase: transferência de meio RPMI 1640 em um tubo com uma pipeta. Adicione o suplemento isento de soro, União A, CHIR99021 e Y-27632 a uma concentração de 1 x, 100 ng/mL, 3 μM e 10 μM, respectivamente.</li>
		<li>Médio de estágio 1B: transferir meio RPMI 1640 em um tubo com uma pipeta. Adicione o suplemento isento de soro, A de União e CHIR99021 a uma concentração de 1 x, 100 ng/mL, ≤ 1 μM, respectivamente. Nota: A concentração de CHIR99021 deve ser menor do que no meio da 1A fase e além disso não é necessário, mas aumenta o número de células.</li>
		<li>Médio de fase 2: meio de transferência melhorada MEM (iMEM) em um tubo com uma pipeta. Adicione o suplemento isento de soro e fator de crescimento de queratinócitos (KGF) a uma concentração de 0,5 x e 50 ng/mL, respectivamente.</li>
		<li>Médio de fase 3: transferência iMEM médio em um tubo com uma pipeta. Adicionar o suplemento isento de soro, KGF, NOGGIN, 3-ceto-N-aminoetil-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) e ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB), com uma pipeta para concentrações de 0,5 x 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM e 10 nM, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Citometria de fluxo (FCM)
	<ol>
<li>tampão de permeabilização/lavagem 1X: transferência de água em um tubo por uma pipeta. Adicione tampão de permeabilização/lavagem por uma pipeta para uma concentração de 1 x.</li>
		<li>FCM obstrui a solução: 1x tampão de permeabilização/lavagem de transferência em um tubo por uma pipeta. Adicione soro de burro por uma pipeta para uma concentração de 2% (vol/vol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining
	<ol>
<li>Solução de bloqueio: Phosphate-Buffered salina (DPBS de transferência Dulbecco) em um tubo por uma pipeta. Adicione soro de burro e Triton X com uma pipeta para concentrações de 5% (vol/vol) e 0,4% (vol/vol), respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hPSC diferenciação para Posterior Foregut pancreático/células progenitoras (PDX1 células de+ )
Nota: Realizar todos os procedimentos usando técnicas estéreis. hPSCs são mantidas em placas de 6-poços revestidas por um material sintético de superfície para hPSCs com o hPSC meio de manutenção de acordo com instruções17,26 as indicações do fabricante. Quando células alcançar confluência de 50 a 80% (fase 0) usá-los para diferenciação.
<ol><li>
Prepare a membrana basal placas revestidas de matriz.
	<ol>
<li>Transferência de 6 mL de RPMI 1640 (4 °C) em um tubo de refrigeração a 4 °C no gelo. Adicione 2 mg de matriz da membrana basal (4 °C) com pontas de pipeta-mL 1 refrigeração e misture bem pipetando suave para fazer matriz de membrana basal de 0,33 mg/mL.</li>
		<li>2 mL de matriz diluídos membrana basal de transferência a cada poço das placas de cultura de célula 6-poços por uma pipeta. Coloca as placas a 37 °C por 60-90 min em uma incubadora. Depois disso, mantenha as placas RT até uso (dentro de 3 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Semente do hPSCs e iniciar a diferenciação a endoderme definitivo (1A fase).
	<ol>
<li>Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de ácido etilenodiaminotetracético de 0,5 mM (EDTA) (RT) por alvéolo com uma pipeta para lavar o hPSCs cultivadas nas placas de 6-poços.</li>
		<li>Aspirar 0,5 mM EDTA e adicionar 2 mL de 0,5 mM EDTA por alvéolo com uma pipeta. Incube as placas a 37 °C por 5 min.</li>
		<li>Aspirar 0,5 mM EDTA e adicione 1 mL de meio de manutenção do hPSC no RT suplementado com 10 μM Y-27632 por bem com uma pipeta. Pipete suavemente, mas rapidamente para explodir fora anexadas células nas placas e para dissociar as células agrupadas em células únicas. Não bolhas a suspensão de eritrócitos durante a pipetagem.</li>
		<li>A suspensão de células em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 4 mL de meio de manutenção hPSC em RT suplementado com 10 μM de transferência Y-27632. Pipete suavemente a suspensão de eritrócitos.</li>
		<li>Conte o número de células na suspensão de célula usando o procedimento de exclusão de mancha azul Trypan.<ol>
<li>Mix 15 μL da suspensão de células e 15 μL de Trypan azul em um tubo.</li>
			<li>Transferência de 10 μL da suspensão celular diluída com Trypan azul para célula contando slides em duplicado por uma pipeta de 10 μL.</li>
			<li>Contar a célula número com um contador automático de células e calcular a densidade de células na suspensão de célula. Viabilidade é geralmente > 98%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Alíquota da suspensão de células em um tubo de centrífuga de 50 mL em 1-1.5 x 106 células por poço de placas boas 6 (1-1,5 x 105 células/cm2).</li>
		<li>Centrifugar o tubo de 50 mL a 200 x g em RT por 5 min.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender as células com 1 mL de meio de 1A fase (RT) por poço. Delicadamente, pipetar a suspensão de células e adicionar outro 1 mL de meio de 1A fase (total, 2 mL por bem).</li>
		<li>Aspire a matriz diluídos da membrana basal dos poços das placas de cultura de células preparadas na etapa 2.1.2 por uma pipeta μL 1.000. Imediatamente para a próxima etapa.</li>
		<li>Delicadamente, pipete a suspensão de eritrócitos na etapa 2.2.8 novamente. Imediatamente após a mistura, transferi a suspensão de eritrócitos (2 mL) em cada poço de uma placa de 6. Cubra o prato com uma folha de alumínio para proteger a placa de luz. Coloque a placa no banco limpo no RT para 10-15 min. Nota: Não mova a placa após a semeadura.</li>
		<li>Delicadamente, coloque a placa em 37 °C, 5% CO2 incubadora (ambiente umidificado) e cultura por 24 h. Nota: Não agite a placa após a semeadura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induzi a diferenciação em definitivo endoderme (estágio 1B).
	<ol>
<li>Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS nos poços com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez. Nota: Para remover as células mortas a monocamada, agite suavemente a placa antes de cada aspiração.</li>
		<li>Aspirar o DPBS usado por uma pipeta e adicionar 4 mL de meio de fase 1B (37 °C) por poço. Delicadamente, coloque a placa na incubadora 37 °C (umidificada atmosfera de 5% CO2) e cultura por 48 h.</li>
		<li>Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez. Nota: Remova as células mortas a monocamada por agitação suave antes de cada aspiração.</li>
		<li>Aspirar o DPBS usado por pipeta e adicionar 4 mL de meio de fase 1B (37 °C) por poço. Delicadamente, coloque a placa na incubadora (37 °C, umidificada atmosfera de 5% CO2) e cultura por 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induzi a diferenciação dentro do tubo do intestino primitivo (fase 2).
	<ol>
<li>Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta. Nota: Remova as células mortas a monocamada por agitação suave antes de cada aspiração.</li>
		<li>Aspirar o DPBS usado por pipeta e adicionar 4 mL de meio de fase 2 (37 °C) por poço. Coloque a placa na incubadora (37 °C, umidificada atmosfera de 5% CO2) e cultura por 4 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induzir a diferenciação em PDX1+ células (fase 3).
	<ol>
<li>Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.</li>
		<li>Aspirar o DPBS usado por pipeta e adicionar 4 mL de meio de fase 3 (37 °C) por poço. Coloque a placa na incubadora (37 °C, umidificada atmosfera de 5% CO2) e cultura por 3 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induzi a diferenciação em células endócrinas no pâncreas.
	<ol>
<li>Realize a indução de célula NKX6.1+ (estágio 4, por 8 dias) seguida por indução de células endócrinas (estágio 5, por 12 dias) com protocolos descrito anteriormente3,16,26. Caracterizar e validar a diferenciação de células endócrinas por imunocoloração e análise de (qRT-PCR) reação em cadeia de polimerase transcrição reversa em tempo real quantitativa. Nota: Consulte Toyoda et al16 e Kimura et al26 para obter procedimentos detalhados experimentais. Consulte a tabela 1 para sequências da primeira demão, usadas para análise de qRT-PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fluxo Cytometry (FCM)
<ol><li>Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de 0.5 mM EDTA para o poço com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de 0,5 mM EDTA uma vez. Nota: Agite a placa suavemente para remover as células mortas das células monocamadas antes de cada aspiração.</li>
	<li>Para dissociar as células (aproximadamente 3-6 × 106 células por poço), adicionar 2 mL de 0,25% Trypsin contendo 0,5 mM EDTA por bem. Incube as placas a 37 °C por 5-10 min.</li>
	<li>Pipetar suavemente mas rapidamente para dissociar as células agrupadas em células únicas. Não bolhas a suspensão de eritrócitos durante a pipetagem.</li>
	<li>8-10 ml de meio base (RPMI 1640 ou iMEM, RT) contendo 0,5 x suplemento isento de soro e 10 μM Y-27632 por bem e misturar a suspensão de eritrócitos. Transferi a suspensão de células para um tubo de centrifugação.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 300 x g em RT por 5 min.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 2 mL de EDTA (RT) de 0,5 mM. Pipete suavemente a suspensão de eritrócitos.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 300 x g em RT por 5 min.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 100 μL de tampão de fixação e permeabilização por 106 células sob um capuz. Pipete suavemente a suspensão de células sob um capuz. Mantenha o tubo no RT por 30 min.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 400 x g em RT por 5 min.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante sob um capuz e ressuspender as células com solução de bloqueio FCM 500 μL por 106 células. Pipete suavemente a suspensão de eritrócitos. Mantenha o tubo no RT por 30 min.</li>
	<li>Transferi 50 µ l de suspensão de células para um tubo (aproximadamente 1 x 105 células). Centrifugar o tubo a 400 x g em RT 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 100 μL do anticorpo primário diluído (ver Tabela de materiais) na FCM obstrui a solução e incubar a 4 °C para > 16 h.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 400 x g em RT por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 180 μL de tampão de Perm/lavagem 1X.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 400 x g em RT 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 100 μL do anticorpo secundário diluído (ver Tabela de materiais) na FCM obstrui a solução. Incube as celulas em RT por 60 min ou a 4 °C para > 16 h com proteção da luz.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 400 x g em RT por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 180 μL de tampão de Perm/lavagem 1X.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 400 x g em RT 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 180 μL de 2% de soro de burro em DPBS.</li>
	<li>Filtre a suspensão celular transferindo um 5 ml redonda poliestireno tubo inferior com um filtro de célula (35 µm de malha de nylon) e manter a 4 °C com proteção de luz até a análise.</li>
	<li>Analise uma proporção de células coradas positivamente por um citômetro de fluxo27.</li>
</ol>4. imunocoloração
<ol><li>Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez. Nota: Agite suavemente a placa para remover as células mortas das células monocamadas antes de cada aspiração.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de paraformaldeído 4% (PFA) (4 °C) por alvéolo com uma pipeta sob um capuz. Manter a placa a 4 °C por 20 min.</li>
	<li>Remova o PFA com uma pipeta sob um capuz. Adicione 2 mL de DPBS no RT para o poço com uma pipeta sob um capuz. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.</li>
	<li>Adicionar 2 mL da solução de bloqueio por bem e manter a placa na RT por 30 min.</li>
	<li>Aspirar a solução usada e adicionar 1 mL de anticorpo primário (veja a Tabela de materiais) em solução por alvéolo de bloqueio. Incubar em RT por 60 min ou a 4 °C para > 16 h.</li>
	<li>Aspire da solução, adicione 2 mL de DPBS contendo 0,4% Triton X-100 e incubar a RT por 10 min. repetir a aspiração, a adição de solução e incubação de uma vez.</li>
	<li>Aspirar a solução usada e adicionar 1 mL de anticorpo secundário (consulte a Tabela de materiais) em solução por alvéolo de bloqueio. Incube a RT por 60 min com proteção da luz.</li>
	<li>Aspire da solução, adicione 2 mL de DPBS contendo 0,4% Triton X-100 (RT) e incube a RT por 5 min com proteção da luz. Repita a aspiração, a adição de solução e incubação duas vezes.</li>
	<li>Leve micrografias de examinar a eficácia de diferenciação sob um microscópio de fluorescência28.</li>
</ol>

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<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
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<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).</li>
<li>Hohwieler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+acinar%2Fductal+organoids+generate+human+pancreas+upon+orthotopic+transplantation+and+allow+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling.</a> Gut. 66 (3), 473-486 (2017).</li>
<li>Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endodermal+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+insulin-producing+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture.</a> Scientific Reports. 4, 4488(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A geração de PDX1+ células é composto de várias etapas; Portanto, é fundamental para tratar as células no momento oportuno. Entre as medidas, a eficiência de indução da endoderme definitivo em grande parte, afeta a eficiência de indução final, possivelmente por interferência de outras contaminantes linhagem células (ou seja, mesoderme e ectoderme), que podem proliferar e/ou secretam fatores que interromper a diferenciação específica. Se a proporção de SOX17+ células é inferior a 80% no dia 4 (fase 1...

O pâncreas é constituído principalmente por células endócrinas e exócrinas, e sua disfunção ou sobrecarga causa várias doenças, como a pancreatite, diabetes e câncer pancreático. Para elucidar a patogenia da pancreatopathy, é necessário analisar o processo de desenvolvimento e função das células do pâncreas. Além disso, um fornecimento estável de celular com qualidade robusta é necessária para estabelecer a terapia de suplementação de célula/tecido. Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-derivadas de células pancreáticas são uma promissora fonte de células para esses fins, e o protocolo de diferenciação para células pancreáticas tem sido intensamente estudado1,2,3, 4. Avanços recentes na geração in vitro de células β pancreáticas imitam a geração das células β adulto humano e estas células mostrar efeito terapêutico sobre implante em diabético modelo ratos2,3. Além disso, a análise das células β, gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) de saudável e tipo 1 diabetes pacientes doadores revelou sem diferenças funcionais, incluindo quando sob estresse5. Além disso, fenótipos de doença foram parcialmente reproduzidos em células pancreáticas induzidas com paciente-derivado iPSCs ou hPSCs, abrigando mutações genéticas no mesmo site que o pacientes6,7.
Para gerar células pancreáticas de hPSCs, é usada gradual diferenciação direcionada que recapitula a processos de desenvolvimento. O pâncreas é derivado da camada endoderme do embrião precoce, que expressa o sexo-determinando a região Y-caixa 17 (SOX17) e forkhead caixa A2 (FOXA2)8. Baseada em estudos de rato, a camada de endodermal forma tubo do intestino primitivo, que é marcado pela expressão do fator nuclear de hepatócito 1-beta (Hnf1β) e fator nuclear de hepatócito 4-alfa (Hnf4α). O tubo do intestino primitivo alonga e desenvolve-se o aparelho respiratório, aparelho digestivo e órgãos. Após o alongamento, a área posterior foregut torna-se região pancreática presuntiva, marcada pela expressão da proteína fator transcricional pâncreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)8,9,10. As partes dorsais e ventrais do PDX1+ intestino tubo engrossar para pancreático botões de formulário, que são marcados pela expressão co de pâncreas transcrição fator 1 subunidade alfa (PTF1A) e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Esta expressão marca o início morfológico de organogênese do pâncreas. As células da endoderme do pâncreas, que são componentes dos brotos pancreáticos, formar uma rede tubular ramificada de estruturas epiteliais12 e eventualmente se diferenciar em células endócrinas e exócrinas, incluindo β-células secretoras de insulina e α-células secretoras de glucagon. Expressão de PDX1 é detectado primeiro na região do pâncreas presuntiva, que então é observada ao longo de todo o desenvolvimento do pâncreas e mostra a localização de células β - e δ9,13,14. Embora o Pdx1+ área de células que expressam não Ptf1a ou Nkx6.1 diferencia em antro gástrico, duodeno, biliar extra-hepática e algumas células intestinais em meio à fase tardia do desenvolvimento em ratos9, PDX1+ as células são consideradas os progenitores do pâncreas a fase inicial do desenvolvimento em seres humanos.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar hPSCs em PDX1+ células para a geração de linhagens no pâncreas. A protocolo inicia diferenciação por semeadura dissociou células únicas15,16,17. Geralmente, hPSCs indiferenciadas são mantidas como colônias ou agregados de células em suspensão ou na adesão. Como resultado, a maioria dos protocolos iniciar a diferenciação logo após a passagem. No entanto, no estado de colônias ou agregados, as células são propensas a heterogeneidades espaciais e transcriptional18,19,20,21,22, que podem dificultar o primeiro passo de diferenciação para a endoderme definitivo seguido de diferenciação ineficiente para PDX1+ células. O presente protocolo pode oferecer fácil manuseio para melhorar e estabilizar a eficiência de diferenciação de algumas linhas de hPSC que anteriormente foram encontradas para diferenciar de forma ineficiente de endodermal linhagens e PDX1+ as células23, 24 , 25.

<table><tbody><tr><td>3-Keto-N-aminoetil-N&prime;-aminocaproyldihydrocinamoil cyclopamine</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>K171000</td><td>CYC</td></tr><tr><td>4- [(E) -2- (5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl] -benzoic acid</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-203303</td><td>TTNPB</td></tr><tr><td>50 mL Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropileno</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CDX2 [EPR2764Y]</td><td>Abcam</td><td>Ab76541</td><td>Anti-CDX2, &times; diluição de 1/1000</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50 &times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>Suplemento sem soro</td></tr><tr><td>BD FACSAria II Classificador de Células</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Freezer biomédico</td><td>SANYO</td><td>MDF-U538</td><td>Para -30 &deg; C armazenando</td></tr><tr><td>lâminas de contagem de células para contador de células TC10 / TC20,</td><td></td><td>vidro de lâmina de contagem</td><td>de 1450011 BIO-RAD</td> de câmara dupla</tr><tr><td>PLACA MULTIPOÇOS DE CULTURA DE CÉLULAS, 6 POÇOS, PS,</td> transparente <td>Greiner BIO-ONE</td><td>657165</td><td>Para cultura de diferenciação/placa de 6 poços</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>TOMY</td><td>AX-310</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>TOMY</td><td>MX-305</td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axônio Medchem</td><td>Axônio 1386</td><td></td></tr><tr><td>BANCO LIMPO</td><td>SHOWA KAGAKU&nbsp;</td><td>S-1601PRV</td><td>Bancada limpa</td></tr><tr><td>Corning CellBIND Placa de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Para cultura sem alimentador de hPSCs/placa de 6 poços</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced Corning</td><td></td><td>354230</td><td>Basement membrane matrix</td></tr><tr><td>Corning Synthemax II-SC Substrate</td><td>Corning</td><td>3535</td><td>Para cultura sem alimentador de hPSCs/material de superfície sintética para hPSCs</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>Leica CM1510 S</td><td>Para imunocoloração de agregados.</td></tr><tr><td>Kit Cytofix/Cytoperm</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td>O tampão Perm/Wash é&nbsp; Tampão de permeabilização/lavagem. O tampão Cytofix/Cytoperm é um tampão de fixação e permeabilização.</td></tr><tr><td>Caneta Dako</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Para imunocoloração de agregados</td></tr><tr><td>mistura dNTP (10 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427-088</td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-cabra IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Anticorpo secundário, &vezes; diluição de 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-rato IgG (H+L) Altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td>Anticorpo secundário, &vezes; diluição de 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário altamente adsorvido anti-coelho IgG (H+L) de burro, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td>Anticorpo secundário, &vezes; diluição de 1/500</td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td>Soro de burro</td></tr><tr><td>D-PBS(-) sem Ca ou Mg</td><td>Nacalai tesque</td><td>14249-95</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Para cultura sem alimentador de hPSCs/hPSC meio de manutenção</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Tubo de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo, com Tampa de Pressão do Filtro</td><td>de Células Corning</td><td>352235 Tubo</td><td>de poliestireno de fundo redondo de 5 mL com filtro de célula</td></tr><tr><td>Ponta de filtro, 1.000 &micro; L</td><td>Watoson</td><td>124-1000S</td><td>Use junto com pipetas</td></tr><tr><td>Ponta do Filtro, 20 &micro; L</td><td>Watoson</td><td>124-P20S</td><td>Use junto com pipetas</td></tr><tr><td>Ponta de filtro, 200 &micro; L</td><td>Watoson</td><td>124-P200S</td><td>Use em conjunto com pipetas</td></tr><tr><td>Microscópio de Fluorescência</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td>Para imunocoloração</td></tr><tr><td>Incubadora Forma Steri-Cycle CO2 Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>370A</td><td></td></tr><tr><td>HNF-1&beta; Anticorpo (C-20)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7411</td><td>Anti-HNF1&beta;, &times; diluição de 1/200</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha; Anticorpo (H-171)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8987</td><td>Anti-HNF4&alpha;, &times; diluição de 1/200</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Para coloração de núcleo, &times; diluição de 1/200</td></tr> de <tr><td>RNA total do pâncreas humano</td><td>Ambion</td><td>AM7954</td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Anticorpo humano PDX-1/IPF1</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>Anti-PDX1, IgG de cabra, & vezes; 1/200 de diluição</td></tr><tr><td>de SOX17 humano</td><td>Anticorpo R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>Anti-SOX17, &times; diluição de 1/200</td></tr><tr><td>Meio de opção de zinco MEM melhorado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10373-017</td><td>iMEM</td></tr><tr><td>Câmara de incubação</td><td>Cosmo Bio</td><td>10DO</td><td>Para imunocoloração de agregados</td></tr><tr><td>Luvas de exame de látex</td><td>Adachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAS vidro de lâmina revestido</td><td>Matsunami Glass</td><td>83-1881</td><td>Para imunocoloração de agregados</td></tr><tr><td>MicroAmp Placa de reação rápida de 96 poços</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td>para microscópio RT-qPCR</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX41N-31PHP</td><td>Para cultura celular</td></tr><tr><td>Microtube</td><td>Watoson</td><td>131-515CS</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-&alpha;-Fetoprotein</td><td>SIGMA</td><td>A8452</td><td>Anti-AFP, &times; diluição de 1/200</td></tr><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>FASMAC</td><td>Custom made Oligo&nbsp;</td><td>Para RT-qPCR de sequência é "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"</td></tr><tr><td>Paraformaldeído, pó</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td>PFA, fixador, diluído em DPBS</td></tr><tr><td>Refrigerador farmacêutico</td><td>SANYO</td><td>MPR-514</td><td>Para 4 &deg; C armazenando</td></tr><tr><td>PIPETMAN P&nbsp;</td><td>Pipeta</td> <td>GILSON</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Humana KGF/FGF-7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG</td><td>KGF</td></tr><tr><td>Cabeça Humana Recombinante</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td>NOGGIN</td></tr><tr><td>Recombinante Humano/Rato/Rato Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td>Activin A</td></tr><tr><td>ReverTra Ace (100 U/&mu; L)</td> <td>TOYOBO</td><td>TRT-101</td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Conjunto DNase livre de RNase (50)</td> <td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 com L-Gln</td><td>Nacalai tesque</td><td>30264-85</td><td>RPMI 1640</td></tr><tr><td>Filme de vedação para tempo real</td><td>Takara</td><td>NJ500</td> Para pipetas sorológicas <td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4488</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas 25 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4489</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas 5 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4487</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td><td>Sinalização celular</td><td>3579S</td><td>Anti-SOX2, &times; diluição de 1/200</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Sucarose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td>Para imunocoloração de agregados</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II&nbsp;</td><td>Takara</td><td>RR820B</td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>TC20 Contador de Células Automatizado</td><td>BIO-RAD</td><td>1450101J1</td><td>Contador de Células</td></tr><tr><td>Automático Composto OCT Tissue-Tek 4583&nbsp;</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td>Para imunocoloração de agregados</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Moldes/Adaptadores</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4566</td><td>Para imunocoloração de agregados</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>BIO-RAD</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Freezer ultrafrio</td><td>SANYO</td><td>MDF-U33V</td><td>Para -80 &deg; C que armazena</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>Dilua com DPBS para preparar 0,5 mM EDTA</td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>251-00514</td><td></td></tr></tbody></table>

eficiente geração de pâncreas/duodeno homeobox proteína 1+ posterior foregut/pancreático progenitores de hpscs em culturas de adesão

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-derivadas de células pancreáticas são uma fonte promissora de célula para medicina regenerativa e uma plataforma para estudar processos de desenvolvimento humanos. Dirigido por diferenciação que recapitula a processos de desenvolvimento é uma das principais maneiras de gerar células pancreáticas, incluindo a proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células progenitoras pancreáticas. Protocolos convencionais iniciem a diferenciação com pequenas colônias logo após a passagem. No entanto, no estado de colônias ou agregados, as células são propensas a heterogeneidades, que podem dificultar a diferenciação para PDX1+ células. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar hPSCs em PDX1+ células. O protocolo consiste em quatro etapas e inicia a diferenciação por semeadura de células únicas dissociadas. A indução de SOX17+ células da endoderme definitivo foi seguido pela expressão de marcadores de tubo dois instintos primitivos, HNF1β e HNF4α e eventual diferenciação em PDX1+ células. O presente protocolo proporciona fácil manuseio e pode melhorar e estabilizar a eficiência de diferenciação de algumas linhas de hPSC que anteriormente foram encontrados para diferenciar de forma ineficiente em linhagens endodermal ou PDX1+ células.

HiPSCs propagação (585A129,30) são condensados e formar uma monocamada homogênea (figura 1B) que é adequada para diferenciação. HiPSCs indiferenciados (fase 0) são dissociadas e re-semeados como células únicas, a densidade celular baixa (1-1,5 x 105 células/cm2). Dentro de 1 h, as células estão conectadas à placa e começarem a mostrar a protrusão. No dia 1, as células são proliferaram e bem distribuídas para cob...

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células para a geração de linhagens pancreáticas baseiam no crescimento não-colônia tipo monocamada de dissociou células únicas. Este método é adequado para produzir células hPSC-derivado homogêneas, a manipulação genética e rastreio.

Eficiente geração de pâncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ Posterior Foregut/pancreático progenitores de hPSCs em culturas de adesão

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

A principal vantagem dessa técnica é que antes da estimulação, as células são dispersas uniformemente e depois estimuladas uniformemente na adesão celular em conjunto. Demonstrando o procedimento será Azuma Kimura, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, transfira seis mililitros de RPMI 1640 em um tubo resfriado a quatro graus Celsius no gelo.Usando pontas de pipeta de um mililitro resfriado, adicione dois miligramas de matriz de membrana do porão. Misture bem por tubulação suave para torná-lo uma matriz de membrana de porão com uma concentração de 0,33 miligramas por mililitro. Em seguida, use uma pipeta para transferir dois mililitros da matriz de membrana diluída do porão em cada poço de uma placa de cultura celular de seis poços.Incubar a placa a 37 graus Celsius por 60 a 90 minutos. Depois disso, mantenha a placa em temperatura ambiente por até três horas, até estar pronta para uso. Primeiro, aspire o meio usado e use uma pipeta para adicionar dois mililitros de 0,5 mililitros EDTA a cada poço para lavar o hPCSs cultivado na placa de seis poços.Em seguida, aspire o EDTA dos poços e adicione dois mililitros de 0,5 mililitros frescos

efficient-generation-pancreasduodenum-homeobox-protein-1-posterior

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui, nós descrevemos um método para a cultura de isolamento e manipulação de pâncreas de rato embrionário. Isto representa uma...

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

O método de cultura tridimensional descrito neste protocolo recapitula o desenvolvimento do pâncreas dispersos progenitores rato pâncreas embrionárias, incluindo a sua expansão substancial, a diferenciação ea morfogênese em um órgão ramificada. Este método é passível de imagiologia, interferência funcional e a manipulação do nicho.

In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores

Aqui nós descrevemos um protocolo de 4 estágios para diferenciar as células-tronco embrionárias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de linhas de células estaminais pluripotentes humanas.

Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Protocolos para gerar linhagens mutantes HPSC usando a plataforma iCRISPR e diferenciar hPSCs em células ß-like glicose-responsivos são descritos. Combinando tecnologia de edição de genoma com a diferenciação HPSC-dirigida fornece uma plataforma poderosa para a análise sistemática do papel das determinantes da linhagem no desenvolvimento humano e progressão da doença.

Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar insulina expressando 3D pancreatoids murino de progenitores pancreático flutuantes e10.5 dissociada e a mesênquima associada.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

Este protocolo apresenta uma comparação entre dois protocolos de indução diferentes para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em relação a linhagens pancreáticas in vitro: o protocolo integrativo e o protocolo não integrativo. O protocolo integrativo gera mais células produtoras de insulina (IPCs).

In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

O presente protocolo descreve um método aprimorado para aumentar a co-expressão dos fatores de transcrição PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em monocamadas planares. Isto é conseguido reabastecendo a matriz fresca, manipulando a densidade celular e dissociando as células endodérmicas.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em precursores de células beta pancreáticas em um sistema de cultura 2D

A diferenciação de células-tronco em ilhotas fornece uma solução alternativa ao tratamento convencional do diabetes e à modelagem da doença. Descrevemos um protocolo detalhado de cultura de células-tronco que combina um kit de diferenciação comercial com um método previamente validado para auxiliar na produção de ilhotas derivadas de células-tronco secretoras de insulina em um prato.

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina

Este artigo apresenta um protocolo para diferenciação dirigida e análise funcional de células semelhantes a células β. Descrevemos as condições e passagens ideais de cultura para células-tronco pluripotentes humanas antes de gerar células pancreáticas produtoras de insulina. A diferenciação em seis estágios progride desde a formação definitiva da endoderme até células funcionais semelhantes às células β que secretam insulina em resposta à glicose.

Protocolo Otimizado para Geração de Células Funcionais Secretoras de Insulina Pancreáticas a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

As células do epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células-tronco podem ser usadas para várias aplicações, incluindo terapias baseadas em células para degeneração da retina, modelagem de doenças e estudos de medicamentos. Aqui apresentamos um protocolo simples para derivar RPE de forma reprodutível de células-tronco.

Derivação eficiente do epitélio pigmentar da retina células de células-tronco

Aprenda a diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em progenitores pancreáticos PDX1+ usando cultura de adesão em monocamada. Este método garante populações homogêneas para estudos de biologia de células-tronco.

Eficiente geração de pâncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ Posterior Foregut/pancreático progenitores de hPSCs em culturas de adesão (Vídeo) | JoVE Journal

Eficiente geração de pâncreas/duodeno Homeobox proteína 1⁺ Posterior Foregut/pancreático progenitores de hPSCs em culturas de adesão

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