Isolamento de células-tronco intestinal e cultura em um modelo suíno de isquemia Intestinal pequena segmentar

O objetivo geral deste procedimento é avaliar os efeitos da isquemia intestinal nas células-tronco epiteliais intestinais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia das células-tronco, como como as células-tronco resistem a lesões e contribuem para o reparo após lesões isquêmicas. A principal vantagem desta técnica é que é um modelo animal de grande porte que pode ser usado para o estudo de doenças intestinais clínicas e reparo.

Demonstrando o procedimento estarão Amy Stieler Stewart, uma estudante de pós-graduação, e John Freund, um especialista em pesquisa do meu laboratório. Comece usando uma lâmina de bisturi para fazer uma incisão na linha média ventral de oito a 10 centímetros no abdômen centrada no umbigo de um porco mestiço de Yorkshire de oito a 10 semanas. Localize o jejuno, aproximadamente 40 centímetros oral à junção ileocecal.

Ligue circunferencialmente o intestino duas vezes para delinear alças de jejuno de 10 centímetros de comprimento com um centímetro entre cada ligadura. Crie dois loops por ponto de tempo de isquemia adjacentes um ao outro, um para isquemia e outro para isquemia com uma hora adicional de reperfusão. Para induzir isquemia completa reversível, use pinças vasculares bulldog ou hemostáticos para obstruir aproximadamente três vasos mesentéricos por pinça pelo período de tempo experimental apropriado.

Mantenha o abdômen coberto durante todo o período isquêmico. No final do experimento, use uma tesoura de Metzenbaum para coletar primeiro uma peça de controle do jejuno normal pelo menos cinco a 10 centímetros proximal à última alça isquêmica, seguida pela coleta do restante das alças. Armazene os loops de cada ponto de tempo de lesão em pequenos recipientes de PBS gelado até o isolamento da cripta.

Para isolar as células-tronco da cripta, use um fio de calibre 20 e uma pinça de tecido para inverter cada alça do intestino delgado de modo que a superfície da mucosa fique exposta. Suture a parte superior e inferior de cada laço firmemente ao fio e enxágue cada laço invertido em PBS gelado. Quando todos os detritos luminais tiverem sido removidos, coloque imediatamente as amostras em tubos cônicos individuais de 50 mililitros contendo 30 mililitros do reagente de dissociação número um no gelo por 30 minutos com agitação e inversão a cada cinco minutos.

No final do período de incubação, transferir as amostras para os tubos correspondentes de 50 mililitros contendo 30 mililitros do reagente de dissociação número dois e granular as amostras de alça isquémica de duas a quatro horas por centrifugação. Ressuspenda os pellets em cinco mililitros de PBS e use uma alíquota de 50 microlitros de cada amostra para verificar o grau de associação de criptas e a quantidade de detritos por microscopia de luz. Em seguida, coloque as amostras em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 minutos com agitação ou inversão a cada cinco minutos.

Em seguida, transfira as amostras diretamente para 25 mililitros de PBS gelado no gelo em um agitador orbital ajustado para 60 RPM por dois a cinco minutos de agitação com agitação manual adicional ou inversão a cada 30 segundos. No final da incubação agitada, verifique o grau de associação da cripta e a quantidade de detritos e transfira as amostras para novos tubos cônicos de 50 mililitros contendo 25 mililitros de PBS frio para agitar até que as criptas intactas sejam isoladas com o mínimo de detritos e vilosidades. Quando as alças estiverem totalmente dissociadas, remova o tecido restante, esfole as amostras por centrifugação e ressuspenda os grânulos de cripta restantes em cinco mililitros de PBS fresco.

Em seguida, alíquota de 150 criptas por tubo em tubos de microcentrífuga individuais e peletizar as criptas por microcentrifugação. Usando uma pipeta pré-resfriada, ressuspenda suavemente os pellets com 50 microlitros de master mix por poço, seguido de pipetagem rápida 15 vezes para misturar. Em seguida, dispense uma gota de cripta de 50 microlitros no centro de cada poço de uma placa de 24 poços pré-vermifugada e gradeada e coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius.

Após 30 minutos, cubra cada hambúrguer de matriz com 500 microlitros por poço de meio de células-tronco epiteliais intestinais, adicionando 500 microlitros de PBS estéril a quaisquer poços não utilizados para manter a umidade e contar o número de criptas do dia zero plaqueadas. Adicione fatores de crescimento a cada poço a cada 48 horas, substituindo o sobrenadante a cada 96 horas por 500 microlitros de meio suplementado com fator de crescimento fresco. A isquemia intestinal completa é criada nas alças do intestino delgado utilizando oclusão vascular com suturas ou pinças, conforme mostrado.

Se realizada corretamente, a lesão isquêmica começará na ponta das vilosidades intestinais e migrará para baixo dentro da cripta à medida que a duração da isquemia aumenta. Um erro comum com a técnica cirúrgica pode ocorrer quando os vasos sanguíneos não são ligados ou pinçados uniformemente, resultando em uma isquemia hemorrágica na qual a veia de paredes finas colapsa antes da artéria, permitindo que sangue adicional se infiltre nos tecidos. Após a remoção das alças intestinais isquêmicas, as criptas intestinais podem ser isoladas com sucesso seguindo o protocolo de dissociação, conforme demonstrado.

As criptas de pontos de tempo mais severamente danificados são frequentemente quebradas e contêm mais detritos celulares de fundo em comparação com aquelas que não sofrem danos ou danos leves. Quando criptas intestinais normais e levemente danificadas são plaqueadas em cultura, as enterosferas se formam dentro de 24 a 48 horas. Com danos isquêmicos graves, as criptas intestinais sobrevivem, mas são danificadas, resultando na formação de esferas muito menores inicialmente.

Por volta de 72 a 120 horas, os enteróides de todas as criptas tornam-se mais complexos com lúmens centrais óbvios e estruturas em brotamento, e com uma diminuição geral da eficiência de crescimento das criptas, bem como diminuição do tamanho dos enteróides derivados do tecido intestinal gravemente danificado. Uma vez dominados, os procedimentos de isolamento de cripta podem ser concluídos em cerca de duas a três horas se forem executados corretamente. É melhor que as criptas coletadas para plaqueamento sejam derivadas de lavagens e não de frações de dissociação devido ao aumento da probabilidade de contaminação da cultura na fração de dissociação.

Este método também pode ser usado para testar a eficácia de medicamentos no tratamento de lesões epiteliais resultantes de isquemia mais ou menos reperfusão. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia gastrointestinal explorarem o impacto da isquemia no epitélio especificamente nas células-tronco intestinais em um modelo animal de grande porte translacional e clinicamente relevante. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar isquemia intestinal com ou sem reperfusão, bem como isolar criptas intestinais para cultura 3D após lesão in vivo.