Name: Intracraniana optou rota de infecção para investigar papéis de biofilmes de Streptococcus suis em meningite em um modelo de infecção do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda a investigar o papel dos biofilmes de Streptococcus suis na meningite bacteriana usando um modelo de infecção intracraniana subaracnoidea em camundongos. Este método permite estudar respostas imunes diretamente no cérebro.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China [2017YFD0500102]; a Fundação Nacional de ciências naturais da China [31572544]; o laboratório estadual chave de veterinária etiológico biologia [SKLVEB2016KFKT005]; a agricultura de Shanghai aplicada tecnologia desenvolvimento programa, China [G2016060201].

Os experimentos de infecção do mouse foram aprovados pelo laboratório Animal monitoramento Comité da província de Jiangsu, China e interpretados no laboratório Animal centro de Nanjing Agricultural University (de licença: SYXK (Su) 2017-0007).
1. preparação de bactérias
Nota: Cepa virulenta de S. suis sorotipo 2 P1/7 foi isolada de um porco doente com meningite19. Estirpe P1/7 foi cultivado em caldo Todd-Hewitt (THB, fórmula por litro de THB: infusão de coração, 3,1 g neopeptone, 20,0 g de dextrose, 2,0 g; cloreto de sódio, 2,0 g; fosfato dissódico, 0,4 g;, 2,5 g de carbonato de sódio) e chapeado em ágar de Todd-Hewitt (THA, fórmula por litro de THA: Infusão de coração, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g; dextrose, 2,0 g; cloreto de sódio, 2,0 g; fosfato dissódico, 0,4 g; carbonato de sódio, 2,5 g; ágar-ágar, 15,0 g) a 37 ° C e 5% de CO2.
<ol><li>Coleção de estirpe células planctônicas P1/7<ol>
<li>Coletar 5 mL de células planctônicas de cultura fase log de mid (OD600= 0,6), centrifugar durante 3 min a 8000 × g e em seguida lavar 3 vezes com PBS.</li>
		<li>Ressuspender as células com 5 mL de glicerol de 25% no THB, alíquota para 5 tubos e em seguida, armazenar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coleção de estirpe P1/7 células de estado de biofilme<ol>
<li>Recolher 20 mL de uma cultura da noite e adicionar a 180 mL de THB fresco; dividir a cultura diluída em 10 placas de cultura redondo e em seguida, colocar as placas na incubadora a 37 ° C em 5% de CO2 por 24 h.</li>
		<li>Após a incubação, agitar a placa suavemente para Ressuspender as bactérias que não aderiram à placa e em seguida, descartar o sobrenadante por aspiração. Nota: Agitar a placa com cuidado e evite resuspending do sedimento.</li>
		<li>Adicione 5 mL de PBS para colher células-estado biofilme, Ressuspender o sedimento completamente e em seguida, transferir a amostra para um tubo novo.</li>
		<li>Proceda à sonicação células biofilme estado da última etapa com os seguintes parâmetros: 60 W, 4 ciclos, 5 s s no e 10 fora.</li>
		<li>Centrifugar por 3 min em 8000 × g e armazenar o sobrenadante a-80 ° C. Nota: O sobrenadante pode conter componentes de biofilme e pode ser usada para Ressuspender as bactérias do biofilme antes da infecção, conforme descrito nas experiências com animais (etapa 3).</li>
		<li>Ressuspender o sedimento com 10 mL 25% glicerol no THB e armazenar as células de estado de biofilme a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de digitalização
<ol><li>Corrigir o biofilme coletadas células de estado e células planctônicas usando paraformaldeído 4% para 12-24 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar as amostras rapidamente com água destilada e desidratar as amostras sequencialmente com uma crescente concentração de etanol (25%, 50%, 70%, 90% e 100%) por 30 min em cada solução.</li>
	<li>Aderir as amostras secas para titulares com fita dupla-face de metal e, finalmente, revesti-los em um evaporador com ouro e paládio.</li>
	<li>Observar as amostras por um microscópio eletrônico de varredura usando os seguintes parâmetros: EHT (Extra alta tensão) = 10 kV; WD (distância de trabalho) = 7.0 ou 8.0 mm; Ampliação = 5000 ×; A um sinal = SE1.</li>
</ol>3. animal experimentos
<ol><li>Usar o SPF 6 semanas camundongos BALB/c fêmeas neste estudo. Infectar todos os mouses através da rota intracraniana optou de infecção cujo local de injeção é localizada 3,5 mm rostral do bregma. As coordenadas estereotáxicos do local da injeção foram claramente descritas por Chiavolini et al.17.<ol>
<li>Para a análise histopatológica, dois grupos de ratos (5 ratos por grupo) de infectar células de estado usando células planctônicas ou biofilme na dose de 3 × 107 formadoras unidades (CFU), e outro 5 ratos foram injetados com PBS como um controle.</li>
		<li>Para a deteção de expressão de RNAm de TLR2 e citocinas no cérebro, infectar dois grupos adicionais de ratos (6 ratos por grupo) usando células planctônicas ou biofilme estado células na dose de 3 × 107 UFC.</li>
		<li>Determine o número de bactérias viáveis por chapeamento diluições em série para THA.</li>
		<li>Eutanásia em todos os ratos a pós-infecção de 12 h para futuras pesquisas. Nota: O glicerol em meio de estoque deve ser removido antes da infecção. Ambas as células planctônicas e células de estado de biofilme recuperadas de-80 ° C são lavadas 3 vezes com PBS. Em seguida, células planctônicas são resuspended com PBS e diluídas para a dose adequada para a infecção; biofilme estado células são resuspended com o sobrenadante armazenado (da etapa 1.2.5) e diluídas para a dose adequada para a infecção. O volume de infecção não deve ser mais de 50 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detectando a expressão de RNAm de TLR2 e citocinas no tecido cerebral<ol>
<li>Extrai o RNA total do tecido cerebral usando um kit de extração de RNA.<ol>
<li>Para cada rato, use tecido de cérebro inteiro para extração de RNA. Divida o tecido de cérebro inteiro em 5 tubos. Ocupam de tecido cerebral de 100mg e adicionar 1 mL de solução de Lise para cada tubo que contém a matriz lysing fornecida pelo kit.</li>
			<li>Processar o tubo em um homogeneizador para 40 s em uma configuração de 6.0 e em seguida centrifugar o tubo a 12000 × g e 4 ° C por 5 min.</li>
			<li>Após a centrifugação, transferi a fase superior para um novo tubo de microcentrifugadora.</li>
			<li>Incubar a amostra transferida durante 5 min à temperatura ambiente; Adicionar 300 µ l de clorofórmio, vórtice para 10 s e então incubar durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
			<li>Centrifugar o tubo a 12000 × g e 4 ° C por 5 min. transferir a fase superior para um novo tubo.</li>
			<li>Adicionar 500 µ l de etanol absoluto frio para o tubo, antes invertendo por 5 vezes e em seguida armazenar a amostra a-20 ° C durante pelo menos 1 h.</li>
			<li>Centrifugar o tubo a 12000 × g e 4 ° C por 15 min e retirar o sobrenadante. Lave o pellet com 500 µ l de etanol frio de 75% em livre de RNase H2O.</li>
			<li>Remover o etanol, o ar seco a pelota durante 5 min à temperatura ambiente e ressuspender o RNA em 100 µ l de RNase-livre H2O.</li>
			<li>Incubar o RNA durante 5 min à temperatura ambiente e determinar a concentração de RNA usando um bioanalyzer RNA.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realize a síntese do cDNA, incluindo eliminação de DNA genômico (gDNA), usando um thermocycler com um kit de reagente de transcrição reversa (RT).<ol>
<li>Adicionar 1 µ g de RNA para um 2 µ l contendo de tubo de buffer de eliminação de x gDNA 5, 1 µ l de enzima de eliminação gDNA e livre de RNase H2O, até que o volume atinge 10 µ l. incube durante 2 min a 42 ° C.</li>
			<li>Adicionar 10 µ l de mistura de mestre (1 µ l da enzima RT Mix I, 1 µ l do Mix de Primer RT, 4 µ l de 5x Buffer 2 e 4 µ l de RNase-livre H2O) para a solução de reação da última etapa e, em seguida, misture delicadamente. Proceder imediatamente com a reação de RT: 37 ° C por 15 min e, em seguida, 85 ° C por 5 s.</li>
			<li>Realizar a análise quantitativa de PCR (RT-qPCR) em tempo real usando uma máquina de PCR em tempo real com um kit SYBR RT-qPCR. Adicione 10 µ l de 2 x enzima, 0,8 µ l de cartilha para a frente, 0,8 µ l de primer reverso, 0,4 µ l de 50 x ROX referência tintura II, 2 µ l de modelo do cDNA e livre de RNase H2O, até um volume total de 20 µ l.</li>
			<li>Executar cada amostra em triplicata, utilizando os seguintes parâmetros térmicos: 30 s a 94 ° C, seguida de 40 ciclos de 5 s a 95 ° C e 34 s a 60 ° C, com uma fase final de 15 s a 1 min a 60 ° C, 95 ° C e 15 s a 95 ° C. Primers para RT-qPCR estão listados na tabela 1. Genes de limpeza B2m e 18s rRNA foram usados como controles internos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcule a variação da dobra relativo baseada no método 2-ΔΔCt .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observação de cortes histológicos
	<ol>
<li>Após a fixação de 24 h com formol a 10%, reconstrua o tecido cerebral fixa em tamanhos adequados de pedaços de tecido em 2-3 mm.</li>
		<li>Coloque os pedaços de tecido em uma gaveta de encastre e mergulhe em uma nova solução fixador para desidratação com um desidratador de vácuo automático.</li>
		<li>Retire o tecido fixo e desidratá-lo sequencialmente em concentrações crescentes de etanol (70%, 80%, 95%, 95% e 100%) por 30 min em cada solução.</li>
		<li>Transparentize a amostra com xilol durante 15 min, mergulhá-lo em parafina líquida a 60 ° C por 90 min e em seguida incorporar usando uma máquina de encastre.</li>
		<li>Corte o tecido de bloco incorporado de parafina em fatias de 3 µm, telha a fatia na água a 45 ° C e em seguida secá-lo no ar.</li>
		<li>Incubar a seção para 3h a 60 ° C, manchá-la usando a hematoxilina e eosina (HE) método e selá-lo com a goma neutra.</li>
		<li>Observe as alterações histopatológicas do cérebro com microscópio óptico. Um sistema de classificação de quatro pontos foi usado para avaliar as alterações histológicas. Utilize um teste pareado t para análise estatística. Congestão/hemorragia: ausente, Pontuação 0; pequena área de congestão/hemorragia focal, escore 1; grande área de congestão/hemorragia focal, ou vários locais de pequena área de congestão/hemorragia focal, pontuação 2; até três sites grandes congestionamentos focal/hemorragia, marcar 3; difusa de congestionamento/hemorragia, marcar 4. Necrose: ausente, Pontuação 0; necrose focal, escore 1; difundir a ocorrência de 1-10 células necróticas, pontuação 2; focos de necrose confluente, pontuação de 3; extensa necrose confluente, marcar 4. Infiltração de células inflamatórias: ausente, Pontuação 0; focais e algumas infiltrações, escore 1; infiltração multifocal ou infiltrações com formação de agregados, pontuação 2; até três agregados, marcar 3; e mais de quatro agregados, marcar 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%3A+a+new+emerging+or+an+old+neglected+zoonotic+pathogen%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?</a> Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).</li>
<li>Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%2C+an+important+pig+pathogen+and+emerging+zoonotic+agent-an+update+on+the+worldwide+distribution+based+on+serotyping+and+sequence+typing%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing.</a> Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45(2014).</li>
<li>Kerdsin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Streptococcus+suis+serotype+9+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).</li>
<li>Hatrongjit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+case+report+of+sepsis+due+to+infection+with+Streptococcus+suis+serotype+31+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Diseases%22%5BJournal%5D)">First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand.</a> BMC Infect Diseases. 15, 392(2015).</li>
<li>Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+involved+in+the+pathogenesis+of+the+infection+caused+by+the+swine+pathogen+and+zoonotic+agent+Streptococcus+suis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis.</a> Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA%3A+a+major+proinflammatory+component+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).</li>
<li>Isiaku, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+is+associated+with+chronic+streptococcal+meningoencephalitis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish.</a> Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).</li>
<li>Oggioni, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+from+planktonic+to+sessile+life%3A+a+major+event+in+pneumococcal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis.</a> Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).</li>
<li>Xiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+small+RNA+rss04+contributes+to+the+induction+of+meningitis+by+regulating+capsule+synthesis+and+by+inducing+biofilm+formation+in+a+mouse+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model.</a> Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+serotype+2%2C+an+important+swine+and+human+pathogen%2C+induces+strong+systemic+and+cerebral+inflammatory+responses+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).</li>
<li>Seitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+intranasal+mouse+model+for+mucosal+colonization+by+Streptococcus+suis+serotype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2.</a> Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).</li>
<li>Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+of+pigs+against+Streptococcus+suis+serotype+2+infection+using+a+live+avirulent+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain.</a> Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).</li>
<li>Williams, A. E., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+Streptococcal+meningitis+following+intravenous+intracisternal+and+natural+routes+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+cochlear+inflammation+and+vestibular+syndrome+in+an+experimental+model+of+Streptococcus+suis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).</li>
<li>Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+Studies+of+Different+Sequence+Types+and+Geographical+Origins+of+Streptococcus+suis+Serotype+2+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection.</a> Pathogens. 5 (3), (2016).</li>
<li>Chiavolini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+inducing+experimental+pneumococcal+meningitis+in+outbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice.</a> BMC Microbiology. 4, 36(2004).</li>
<li>Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otitis+interna+is+a+frequent+sequela+to+Streptococcus+suis+meningitis+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs.</a> Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).</li>
<li>Holden, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+virulence+and+drug+resistance+in+the+emerging+zoonotic+pathogen+Streptococcus+suis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis.</a> PLoS One. 4 (7), e6072(2009).</li>
<li>Dominguez-Punaro Mde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+the+microglial+inflammatory+response+to+Streptococcus+suis%2C+an+important+emerging+zoonotic+agent+of+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis.</a> Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).</li>
<li>Hassan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+detection+methods+of+biofilm+formation+in+the+clinical+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates.</a> Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).</li>
<li>Vanier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+putative+virulence+factors+of+Streptococcus+suis+involved+in+invasion+of+porcine+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells.</a> Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).</li>
<li>Takeuchi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+suilysin+to+the+pathogenesis+of+Streptococcus+suis+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis.</a> Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).</li>
<li>Tenenbaum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A rota intracraniana optou de infecção descrita aqui tem óbvias vantagens sobre outras vias de infecção. Ele permite que os investigadores a estudar a interação hospedeiro-bactéria e o efeito de componentes bacterianas em respostas imunes host diretamente no cérebro, que imitam a entrada de bactérias no sistema nervoso central. Assim, esta via de infecção pode ser estendida para investigar os mecanismos de meningite causada por outras bactérias. Além disso, ele também pode ser usado para testar a eficácia das drogas cont...

Streptococcus suis (S. suis) é um importante patógeno bacteriano de suínos no mundo, causando doenças graves, incluindo meningite, pneumonia, septicemia, endocardite e artrite1. É também um agente zoonótico emergente. Até agora, tem sido relatado que nove sorotipos podem causar infecção nos seres humanos, incluindo os sorotipos 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 e 31,2,3,4. Em humanos e suínos, a meningite é um dos principais sinais clínicos de S. suis infecções. No Vietnã e Tailândia, o S. suis é a principal causa de meningite em adultos5. Biofilmes microbianos são microorganismos que aderem-se uns aos outros e se concentram em uma interface; Eles são essenciais para a virulência bacteriana, sobrevivência em diversos ambientes e a resistência aos antibióticos5. Biofilmes são tipicamente rodeados por uma matriz extracelular que geralmente contém polissacarídeos, proteínas e DNA6. O último é capaz de eliciar respostas inflamatórias do hospedeiro e a produção de citocinas7. Formação de biofilme foi relatada para ser envolvido em meningite estreptocócica em estudos anteriores. Biofilmes contribuam para meningite Streptococcus agalactiae em um modelo de peixe tilápia e formação de biofilmes foi revelada dentro de tecidos do cérebro e ao redor meníngea superfícies na vivo através de de inoculação intra-abdominal8. Durante a meningite, Streptococcus pneumoniae está em um estado de biofilme e bactérias em um biofilme estado foram mais eficazes na indução de meningite em um rato infecção modelo9. Além disso, no nosso anterior estudo, o estado de biofilme associado S. suis em cérebro de rato contribui para a virulência bacteriana por sobrevivência análise10. No entanto, a evidência direta para envolvimento de biofilme em S. suis meningite requer mais investigação.
Foram desenvolvidos modelos animais de infecção de S. suis em ratos usando o intraperitoneal (i.p.)11, intranasal (óssea)12, intravenosa (i.v.)13e as intracisternal (i.c.) rotas de infecção14, 15 , 16. no entanto, os i.p., óssea e i.v. rotas de infecção não são adequadas para estudar as funções dos componentes de superfície S. suis em meningite diretamente no cérebro. Estes incluem matriz extracelular de biofilmes. Mas a inoculação de i.c. foi usada para infecção de S. suis , o site precisa de injeção não foi descrito os jornais. Em contraste, as coordenadas estereotáxicos do local da injeção para inoculação intracraniana optou claramente tem sido descrita em um anterior estudo17. Isto permitiu o fácil reconhecimento do ponto de inoculação e mais simplista protocolo experimental. Além disso, na rota de infecção intracraniana optou imita a entrada de bactérias no sistema nervoso central dos seios do face ou do ouvido médio,17e a relação entre o ouvido médio e a meningite causada por S. suis tem sido demonstrado por Madsen et al.18. Além disso, aplicando-se a rota intracraniana optou de infecção em camundongos, demonstrámos que o S. suis pequeno RNA rss04 contribui para meningite em nosso anterior de estudo10.
No presente estudo, na rota de infecção intracraniana optou foi usada em ratos para investigar os papéis de biofilmes em meningite S. suis . Camundongos foram infectados com células planctônicas ou biofilme estado de S. suis por esta via de infecção. A análise histopatológica e aumento da expressão do mRNA de TLR2 e citocinas do tecido de cérebro de ratos injetados com células de biofilme estado claramente indicaram que o S. suis biofilme contribui para a meningite.

<table><tbody><tr><td>Caldo Todd Hewitt (THB)</td> <td>Becton, Dickinson and Company</td><td>DF0492078</td><td>Dissolva 30 g do pó em 1 L de água purificada. Autoclave a 121&deg; por 15 min.</td></tr><tr><td>Ágar</td><td>DSBIO</td><td>16C0050</td><td>Dissolver 15 g do pó em 1 L de THB. Autoclave a 121&deg; por 15 min.</td></tr><tr><td>Sistema de purificação de água de referência Milli-Q</td><td>Merck KGaA</td><td>Z00QSVCUS</td><td>sem Dnase/Rnase</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>Dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g KCl, 1,42 g Na2HPO3, 0,27 g KH2PO4 em 1 L de água purificada. Autoclave a 121&deg; por 15 min. Use KOH para ajustar o pH para 7,4.</td></tr><tr><td>Na2HPO3</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009012-01-09</td><td>Dissolva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 em 1 L de água purificada. Autoclave a 121&deg; por 15 min. Use KOH para ajustar o pH para 7,4.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009017-01-09</td><td>Dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 em 1 L de água purificada. Autoclave a 121&deg; por 15 min. Use KOH para ajustar o pH para 7,4.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009019-01-09</td><td>Dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 em 1 L de água purificada. Autoclave a 121&deg; por 15 min. Use KOH para ajustar o pH para 7,4.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009014-01-09</td><td>Dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 em 1 L de água purificada. Autoclave a 121&deg; por 15 min. Use KOH para ajustar o pH para 7,4.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Diluído com volume igual de água purificada, autoclave a 121&deg; por 15 min</td></tr><tr><td>4% de paraformaldeído</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80096675</td><td></td></tr><tr><td>25% de Glutaraldeído</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>30092436</td><td>10 vezes diluído com água purificada para fixação.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Spctrophotometer</td><td>DeNovix Inc.</td><td>Triturador de células DS-11 +</td><td></td></tr> <tr><td>ultrassom</td><td>NingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd</td><td>JY96-IIN</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Hitachi Koki Co., Ltd</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>Geladeira</td><td>Aucma Co., Ltd</td><td>DW-86L500</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de varredura</td><td>Zeiss</td><td>EVO-LS10</td><td></td></tr><tr><td>FastRNA Pro Green Kit</td><td>MP Biomedicals</td> <td># 6045-050</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento FastPrep-24</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento para PCR</td><td>SensoQuest GmbH</td><td>1124310110</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485689</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reagentes PrimeScript RT com borracha de</td> <td>gDNATakara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>Processador de tecidos totalmente fechado</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ASP200S</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de incorporação de parafina aquecida</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo rotativo semiautomatizado</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria para seções de parafina</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer XL</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ST5010</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr></tbody></table>

intracraniana optou rota de infecção para investigar papéis de biofilmes de streptococcus suis em meningite em um modelo de infecção do rato

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Streptococcus suis é não só um importante patógeno bacteriano de suínos no mundo, mas também um agente zoonótico emergente. Em humanos e suínos, a meningite é uma grande manifestação de S. suis infecções. Um modelo apropriado de infecção é uma ferramenta essencial para compreender os mecanismos das doenças causadas por agentes patogénicos. Várias rotas de infecção em camundongos foram desenvolvidas para estudar a patogênese da infecção por S. suis . No entanto, as rotas intraperitoneal, intranasais e intravenosa de infecção não são adequadas para estudar as funções dos componentes de superfície S. suis em meningite diretamente no cérebro, tais como a matriz extracelular de biofilmes. Embora intracisternal inoculação tem sido usada para infecção de S. suis , o site precisa de injeção não foi descrito. Aqui, na rota de infecção intracraniana optou foi descrita em um modelo do rato para investigar os papéis de biofilmes em S. suis meningite. S. suis planctônicos nas células ou biofilme estado foram diretamente injetado no espaço subaracnoide dos ratos através do site de injeção localizado 3,5 mm rostral do bregma. A análise histopatológica e aumento da expressão do mRNA de TLR2 e citocinas do tecido cerebral dos ratos injetados com células de biofilme estado claramente indicaram que o S. suis biofilme tem um papel definitivo na meningite S. suis . Esta rota de infecção tem óbvias vantagens sobre outras vias de infecção, permitindo o estudo da interação hospedeiro-bactéria. Além disso, ele permite que o efeito de componentes bacterianas no anfitrião respostas imunes diretamente no cérebro para ser avaliado e imita a entrada de bactérias no sistema nervoso central. Esta via de infecção pode ser estendida para investigar os mecanismos de meningite causada por outras bactérias. Além disso, ele também pode ser usado para testar a eficácia das drogas contra meningite bacteriana.

SEM análise foi realizada para examinar a formação de biofilmes nas condições experimentais. Como mostrado na Figura 1, há uma diferença significativa na formação de biofilme entre células planctônicas (Figura 1A) e células de estado de biofilme (Figura 1B). SEM a análise mostrou que as bactérias do biofilme foram aos montes e múltiplas camadas e eles foram encerrado...

Aqui, descrevemos a rota intracraniana optou de infecção em camundongos para estudar funções de biofilmes de Streptococcus suis meningite. Este modelo de infecção também é adequado para estudar a patogênese das outra meningite bacteriana e a eficácia de novas drogas contra meningite bacteriana.

Intracraniana optou rota de infecção para investigar papéis de biofilmes de Streptococcus suis em meningite em um modelo de infecção do rato

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre os papéis dos componentes do streptococcus suis em muitos locais, como a matriz extracelular de seus biofilmes. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite investigações de componentes bacterianos que afetam a forma como as respostas imunes diretamente em um cérebro e imitam a entrada de bactérias no sistema nervoso central. Demonstrando o procedimento estará o Sr. Shouming Zhang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para coletar células planctônicas da cepa P1 / 7, primeiro colete cinco mililitros das células da cultura da fase intermediária. Centrifugue por três minutos a 8000 vezes G antes de lavar as células três vezes em PBS. Ressuspenda as células com cinco mililitros de glicerol a 25% em THB e alíquota em cinco tubos.Alternativamente, para coletar células do estado de biofilme da cepa P1 / 7, pegue 20 mililitros de uma cultura durante a noite e adicione 180 mililitros de THB fresco. Divida igualmente a cultura diluída em 10 placas de cultura redondas e, em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após a incubação, agite a placa suavemente para ressusp

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Zhang, S., et al. Rota Subaracnoidal Intracraniana de Infecção para Investigar Papéis de Streptococcus suis Biofilms em Meningite em um Modelo de Infecção de Camundongo. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra a detecção da expressão gênica alvo em um cérebro de camundongo infectado por bactérias. O RNA é extraído, tratado com uma enzima degradante do DNA e transcrito reversamente em cDNA. O cDNA é amplificado por ciclo térmico com primers específicos de cada gene, enquanto um corante...

Detecção da expressão do gene alvo em um cérebro de camundongo infectado por bactérias

Fonte: Lenhard, A. et al. Um modelo camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença agravada pela idade. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um modelo de co-infecção em camundongos no qual o vírus da gripe desencadeia a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno. Ele descreve as etapas envolvidas na colonização bacteriana, infecção viral e progressão da doença.

Um modelo de camundongo para estudar a transição patogênica de Streptococcus pneumoniae após coinfecção viral

Neste vídeo, demonstramos a entrega intracisternal de Neisseria meningitidis em um modelo de camundongo para gerar infecção por meningite.

Entrega intracisternal de meningococos em modelos de camundongos para induzir meningite meningocócica

Neisseria meningitidis é um patógeno específico humano que infecta os vasos sanguíneos. Neste protocolo microvasos humanos são introduzidos em um rato por enxertia de pele humana em ratos imunocomprometidos. As bactérias aderem extensivamente para os vasos humanos, levando a danos vasculares e desenvolvimento da erupção purpúrica normalmente observada em casos em humanos.

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Os modelos animais provaram ser ferramentas valiosas para a definição de acolhimento e de patógenos mecanismos específicos que contribuem para o desenvolvimento da inflamação crônica. Aqui nós descrevemos um modelo do rato de infecção oral com o patógeno humano Porphyromonas gingivalis e metodologias detalhe para avaliar a progressão da inflamação em sites locais e sistêmicos.

Um modelo de rato para induzida por patógeno inflamação crônica no local e sistêmica Sites

Aqui, é descrito um procedimento para o estabelecimento de uma infecção sistémica no rato neonatal com culturas de Escherichia coli K1. Este procedimento não-invasivo permite a colonização do tracto gastrointestinal, a translocação do agente patogénico para a circulação sistémica, e invasão do sistema nervoso central no plexo coróide.

Modelo não-invasiva da neuropatogênicos Escherichia coli Infecção no Rato Neonatal

Streptococcus pneumoniae forma lesões microscópicas discretas e não purulentas no coração. Está delineado o protocolo para um modelo murino de formação de microlesões cardíacas. São fornecidas instruções sobre visualização de microlesões usando microscopia, discriminação entre microlesões precoces e tardias e métodos para detectar remodelação cardíaca em corações de animais convalescentes.

Visualização de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro Microle- cardíacas e remodelação cardíaca Subsequente

Aqui, descrevemos um método para induzir a meningite meningocócica através de uma via intracisternal de infecção em camundongos adultos. Apresentamos um protocolo passo a passo de infecção meningocócica desde a preparação do inóculo para a infecção intracisternal; registre então a sobrevivência animal e avalie as cargas bacterianas em tecidos do murine.

Indução meningocócica meningite sorogrupo C em camundongos via parto intracisternal

Este artigo descreve um novo modelo de camundongo para a transição de pneumococo de um colonizador assintomático para um patógeno causador de doença durante a infecção viral. Este modelo pode ser facilmente adaptado para estudar interações polimicrobianas e patógeno-hospedeiro durante as diferentes fases de progressão da doença e em vários hospedeiros.

Um modelo de camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade

O presente protocolo descreve um modelo de camundongo que emprega implante dorsal subcutâneo para investigar infecções associadas ao implante, permitindo uma investigação abrangente dos mecanismos fisiopatológicos e apoiando o desenvolvimento de critérios diagnósticos com estratégias terapêuticas direcionadas.

Modelo animal de infecções associadas a implantes em camundongos

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de imunossupressão de sepse em camundongos por meio da instilação intranasal de Klebsiella pneumoniae e validamos o modelo por meio de vários indicadores.

Estabelecimento de um modelo de imunossupressão induzida por sepse em camundongos por instilação intranasal de bactérias

Aprenda a investigar o papel dos biofilmes de Streptococcus suis na meningite bacteriana usando um modelo de infecção intracraniana subaracnoidea em camundongos. Este método permite estudar respostas imunes diretamente no cérebro.

Intracraniana optou rota de infecção para investigar papéis de biofilmes de Streptococcus suis em meningite em um modelo de infecção do rato (Vídeo) | JoVE Journal

Intracraniana optou rota de infecção para investigar papéis de biofilmes de Streptococcus suis em meningite em um modelo de infecção do rato

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