Um método de preparação de amostra eficiente para melhorar os sinais de íon carboidrato em espectrometria de massa de ionização/dessorção de Matrix-assisted Laser

Um procedimento simples de preparação de amostras foi desenvolvido para melhorar o método convencional em espectrometria de massa de ionização por dessorção a laser assistida por matriz, reformando a morfologia simples durante o processo de secagem. A vantagem dessa técnica é que a intensidade do sinal das amostras de carboidratos preparadas por esse método otimizado pode ser efetivamente aprimorada. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a etapa de despressurização do metanol é muito crucial e precisa ser feita de uma só vez.

Qualquer hesitação diminuirá a qualidade dos dados. Para começar, usando luvas de nitrilo, use 100 mililitros de solução detergente para lavar à mão a placa de amostra. Use água destilada-deionizada, ou DD, para lavar o prato à mão.

Em seguida, com 30 mililitros de metanol, enxágue a superfície. Introduzir a placa de recolha num copo de 600 ml e enchê-la com água DD até que a placa esteja totalmente imersa. Em seguida, colocar o copo num banho ultra-sónico e sonicar a placa durante 15 minutos.

Remova a placa de amostra do béquer e use nitrogênio pressurizado para soprar as gotas de água. Em seguida, deposite 0,2 microlitros de metanol na placa de amostra para verificar se ele se espalha para outros pontos. Em caso afirmativo, repita a lavagem, a sonicação e o tratamento com nitrogênio conforme demonstrado.

Depois de preparar a câmara de secagem de acordo com o protocolo de texto, pré-misture 0,25 microlitros de solução de ácido 2, 5-dihidroxibenzóico e 0,25 microlitros de Sialyl-Lewis A, ou solução de maltoheptaose no tubo de microcentrífuga. Em seguida, vórtice o tubo por três segundos. Girar a solução misturada na minicentrífuga a 2000 vezes G durante dois segundos.

Em seguida, pipetar imediatamente 0,1 microlitro da solução pré-misturada para a placa de amostra. Quando a amostra secar, enquanto trabalha rapidamente para evitar a evaporação, pipete 0,2 microlitros de metanol diretamente no local da amostra. A amostra se dissolverá novamente e secará imediatamente.

A etapa de deposição de metanol é a etapa mais difícil que determina a qualidade e a reprodutibilidade dos dados. Para garantir o melhor desempenho, recomendamos que o usuário termine a deposição em três a cinco segundos para evitar perda significativa por evaporação do metanol. Use luvas de nitrilo e remova cuidadosamente a placa de amostra da câmara de secagem.

Em seguida, sob um microscópio, examine a amostra. Se as morfologias dos cristais não forem as esperadas, repita a mistura da amostra e a mancha na placa de amostra. Para garantir que os cristais da amostra tenham a morfologia ideal após a recristalização, sempre use um microscópio para examiná-los.

É difícil determinar a qualidade da morfologia do cristal corretamente a olho nu. Para analisar uma amostra de um microlitro, pré-misture 2,5 microlitros de solução de ácido 2, 5-dihidroxibenzóico e 2,5 microlitros de solução de Sialyl-Lewis A ou maltoheptaose em um tubo de microcentrífuga. Vortex a solução pré-misturada por cinco segundos.

Centrifugar a solução misturada a 2000 vezes G durante dois segundos e, em seguida, pipetar imediatamente um microlitro da solução pré-misturada para a placa de amostra. Depois que a amostra secar, pipete 1,5 microlitros de metanol diretamente no local da amostra seca. A amostra se dissolverá novamente e secará imediatamente.

Remova cuidadosamente a amostra da câmara de secagem. Examine a amostra ao microscópio. Se as morfologias dos cristais não forem as esperadas, repita a preparação da solução conforme demonstrado.

Para realizar a espectrometria de massa, abra o software de controle do espectrômetro de massa e insira a placa de amostra na máquina. Selecione o método de aquisição de dados pré-otimizado no software e, em seguida, usando o software de imagem, registre toda a região da amostra para espectrometria de massa de imagem. Inicie a aquisição de dados no modo de lote do software de controle.

Quando a aquisição de dados estiver concluída, use o software de imagem para plotar as imagens de íons e analisar os dados de acordo com o protocolo de texto. Imagens representativas de MEV de Sialyl-Lewis A misturado com ácido 2,5-dihidroxibenzóico preparadas usando gotículas secas e métodos de recristalização são mostradas aqui. Uma morfologia típica do ácido 2,5-dihidroxibenzóico são grandes cristais em forma de agulha na borda e estruturas cristalinas finas no centro dos pontos de amostra.

Após a recristalização por metanol, a amostra tem uma área maior coberta uniformemente com cristais finos semelhantes a flocos. Esta figura mostra os resultados da espectrometria de massa de imagem de Sialyl-Lewis A e maltoheptaose com e sem recristalização de metanol. Após a recristalização, a distribuição dos sinais de Sialyl-Lewis A e maltohepaose combina bem com as imagens de campo claro dos pontos da amostra.

As intensidades de sinal das amostras de carboidratos recristalizados também são aprimoradas em comparação com as amostras convencionais de gotículas secas. Este gráfico compara a intensidade do sinal dos carboidratos do modo iônico sodiado ou positivo e do modo iônico desprotonado ou negativo de amostras recristalizadas em relação à de amostras de gotículas secas. Em média, a recristalização das amostras de Sialyl-Lewis A e maltoheptaose aumentou os sinais sodiados por fatores de 3,9 e 3,3.

Os sinais de íons Sialyl-Lewis A desprotonados foram aumentados por um fator de 4,7 após a recristalização. Uma vez dominadas, as amostras podem ser preparadas em 10 minutos usando esta técnica, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante que a gota de metanol seja depositada imediata e precisamente no local da amostra.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como controlar efetivamente a morfologia do cristal de várias amostras para obter os melhores sinais de íons para análise de rotina.