Name: Fabricação de gradiente Nanopattern pela técnica de Nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprenda a fabricar placas com nanopadrões gradiente por nanoimpressão térmica e analise a resposta de células progenitoras endoteliais humanas. Este método permite investigar mecanismos celulares por estímulos físicos.

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Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da educação, ciência e tecnologia (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] e Bio & desenvolvimento de tecnologia médica Programa da NRF financiado pelo Ministério da ciência, TIC & futuro planejamento [NRF-2017M3A9C6029563].

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Os autores não têm nada para divulgar.

Fabricação de um AAO frequentemente sofre de defeitos tais como fissuras, formas irregulares de poros e queimando. A principal razão para esses defeitos é chamada uma repartição eletrolítica, que é fortemente afetada pela natureza das substratos metálicos sendo anodizado e a resistividade do eletrólito21. Desde que a resistividade do eletrólito varia de acordo com sua temperatura, eliminar o calor continuamente de eletrodos é o ponto crítico para manter a temperatura locacionais do eletrólito como...

Recentemente, a resposta das células por estimulação física de topografia da superfície tem sido em destaque no campo da célula engenharia1,2,3,4. Portanto, mais atenção tem sido focada em nanoestruturas tridimensionais no celular acessório superfície5. Tem sido relatado que a integrina, que é o dispositivo de reconhecimento de superfície da célula, transmite o estímulo físico conduzido pelas estruturas micro-nano de ECM a transdução mechano6. Esta estimulação mecânica regula o comportamento da célula através de de orientação contato7 e induz a reorganização do citoesqueleto para mudar de forma, além de aderências focais e rigidez de células8.
Células progenitoras endoteliais humanas (hEPCs) no corpo interagem estreitamente com o microambiente do ECM circundante9. Isso indica que o estado físico de ECM atua como um parâmetro importante para a formação de complexos adesão célula-matriz específica como tensão de cisalhamento derivado de fluxo de sangue10. É relatado que nanotopography superfície aumenta a formação de redes de tubo capilar extensa de hEPCs11 em vitro e que um fator solúvel ECM/bio combinado sistema permite hEPCs reconhecer substratos disfuncionais e promove ferida cura12,13. No entanto, a relação entre ECM e hEPCs não é claramente entendida.
Embora muitos pesquisadores tentaram esclarecer a relação entre as respostas de célula e sinais físicos de diferentes substratos14,15,16, estes estudos usado apenas o tamanho fixo de um nanostructure ou nanopatterns com arranjos irregulares que possuem uma limitação para elucidar a relação entre o tamanho do comportamento nanostructure e celular. O problema é a falta de instrumentos adequados para a seleção de respostas celulares que podem substituir as abordagens existentes tediosas e iterativas para encontrar o tamanho ideal do nanostructure. Portanto, uma técnica simples é necessária para reações de célula em estímulos físicos sem repetição de triagem.
Aqui, descrevemos um método usado em nossos anteriores relatórios17,18,19 , para produzir um gradiente nanopattern em que o diâmetro da nanopillars arranjado aumenta gradualmente. Além disso, também descrevemos como cultivar e analisar o comportamento de hECFCs em placas de gradiente nanopattern para determinar o efeito de estímulos físicos sobre as células. Um suave anodização, gravura gradual e método de revestimento de camada decolagem foram usados para fabricar o molde AAO gradiente. Adotando uma térmica impressão técnica de litografia, nanopatterns gradientes poliestireno idênticos foram produzidas de forma econômica e fácil. Usando gradiente nanopatterns, é possível determinar qual o tamanho de nanostructure tem um grande efeito sobre o comportamento da célula em um conjunto de experiência. Esperamos que este gradiente nanopattern será útil na compreensão dos mecanismos de interação entre hECFC derivados de sangue ou outras células e vários tamanhos de nanoestruturas.

<table><tbody><tr><td>Ácido perclórico 60%</td> <td>Daejung Chemicals & Metais</td><td>6512-4100</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico, absoluto 99,9%</td> <td>Daejung Chemicals & Metais</td><td>4118-4100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico 85%</td> <td>Daejung Chemicals & Metais</td><td>6532-4400</td><td></td></tr><tr><td>Álcool metílico 99,5%</td> <td>Daejung Produtos químicos & Metais</td><td>5558-4400</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de cromo (VI)</td><td>Daejung Chemicals & Metais</td><td>2558-4400</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico 95%</td> <td>Daejung Chemicals & Metais</td><td>7781-4100</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio 30%</td> <td>Daejung Chemicals & Metais</td><td>4104-4400</td><td></td></tr><tr><td>n-hexano 95%</td> <td>Daejung Chemicals & Metais</td><td>4081-4400</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno 99,5%</td> <td>Daejung Produtos Químicos & Metais</td><td>8541-4400</td><td></td></tr> <tr><td>(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahidrodecil) dimetilclorosilano</td><td>Gelest</td><td>SIH5840.4</td><td>Umidade sensível</td></tr><tr><td>Methoxynonafluorobutane 99%</td> <td>Sigma aldrich</td><td>464309</td><td></td></tr><tr><td>Solução de colágeno</td><td>Stemcell</td><td>#4902</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1890</td><td>Solução</td></tr> <tr><td>de revestimento de proteínaFicoll-Paque</td><td>GE Heathcare</td><td>17-1440-03</td><td>Solução de polissacarídeo hidrofílico</td></tr><tr><td>EGM-2MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>Meio de expansão de células endoteliais</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Sigma aldrich</td><td>G5882-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio</td><td>Sigma aldrich</td><td>201030-1G</td><td></td></tr><tr><td>Hexametildisilazane</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Octilfenol etoxilato&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo primário anti-vinculina humana&nbsp;</td><td>Sonda F-actin Sigma</td><td>aldrich V9131</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sondas Moleculares</td><td>A12379</td><td>Faloidina conjugada com fluorescência</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugada anti-mouse&nbsp; Anticorpo IgG</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td>Anticorpo secundário conjugado com fluorescência&nbsp;</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol&nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primário anti-vWF humano&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano&nbsp; Anticorpo primário CD144</td><td>BD Biosciences</td><td>#555661</td><td></td></tr><tr><td>Eponate 12&trade; Kit de incorporação, com BDMA</td><td>Ted Pella</td><td>18012</td><td>Resina epóxi</td></tr><tr><td>Acetato de uranila, 25g</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de chumbo, trihidratado, 10g</td><td>Ted Pella</td><td>19312</td><td></td></tr><tr><td>Placa de alumínio ultra puro</td><td>Goodfellow</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Folha de poliestireno</td><td>Goodfellow</td><td>ST313120</td><td></td></tr><tr><td>8.0" wafer de silício</td><td>Siltron</td><td>29-01024-03</td><td>Lado único polido, 725 &micro; m de espessura</td></tr><tr><td>Dessecador a vácuo, 4,4 L</td><td>Kartell</td><td>KA.230</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo</td><td>Vacuumer</td><td>V3. VOP100</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>Unicorntech</td><td>UDP-3003</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>Daihan scientific</td><td>SL. </td><td></td>SMS03022</tr><tr><td>Agitador suspenso</td><td>Daihan scientific</td><td>HT120DX</td><td></td></tr><tr><td>Circulador</td><td>Daihan scientific</td><td>WCR-P12</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de mudança linear</td><td>Zaber</td><td>A-LSQ300A-E01-KT07</td><td></td></tr><tr><td>Suporte angular, 90 graus</td><td>Zaber</td><td>AB90M</td><td>Acessório da pinça PMP de platina móvel linear</td></tr><tr><td>, 145 mm</td><td>Vitlab</td><td>67995</td><td>Pinça não metálica</td></tr><tr><td>Béquer PTFE, 250 mL</td><td>Cowie</td><td>CW007.25</td><td></td></tr><tr><td>Limpador ultrassônico</td><td>Branson</td><td>B2510MTH</td><td></td></tr><tr><td>cortador de PCB</td><td>Hozan Tool Industrial</td><td>K-110</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de nanoimpressão</td><td>Nanonex</td><td>NX-2000</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de plasma de oxigênio</td><td>Femto Science</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de baixa temperatura</td> Incubadora de cristal <td>lowtem</td><td>50</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de varredura a laser Confoal</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de varredura</td><td>JEOL</td><td>JSM6701</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td><td>Hitachi</td><td>H-7500</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de gradiente nanopattern pela técnica de nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography pode ser encontrado em várias matrizes extracelulares (ECMs) em torno do corpo e é conhecido por ter importantes acções regulamentares sobre reações celulares. No entanto, é difícil determinar a relação entre o tamanho de um nanostructure e as respostas das células devido à falta de ferramentas de triagem adequada. Aqui, nós mostramos o desenvolvimento de placas de nanopattern gradiente reprodutível e de baixo custo para a manipulação de respostas celulares. Usando o óxido de alumínio anódico (AAO) como um molde mestre, placas de gradiente nanopattern com nanopillars de intervalos de diâmetro crescente [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) e 280-360 nm (GP 280/360)] foram fabricados por uma térmica impressão técnica. Estas placas de gradiente nanopattern foram projetadas para imitar os vários tamanhos de nanotopography em ECM e foram usadas para a tela de respostas do humanas formadoras células endoteliais (hECFCs). Neste protocolo, descrevemos o procedimento passo a passo de fabricação de placas de gradiente nanopattern para celular, técnicas de cultivo hECFCs de sangue periférico humano e cultivo hECFCs em placas de nanopattern de engenharia.

A Figura 1 mostra SEM imagens dos moldes AAO gradientes fabricados de acordo com seu tipo e posição. A Figura 2 mostra SEM imagens das placas de gradiente nanopattern com nanopillars regular-arredondado, e a Figura 3 é dados de quantificação do diâmetro nanopillar. A tabela 1 lista as características da nanopillars fabricados.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

Aqui, apresentamos um protocolo para a fabricação de placas de gradiente nanopattern através de nanoimprinting térmica e o método de triagem respostas de células progenitoras endoteliais humanas para as nanoestruturas. Usando a tecnologia descrita, é possível produzir um andaime que pode manipular o comportamento de célula por estímulos físicos.

Fabricação de gradiente Nanopattern pela técnica de Nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

A principal vantagem desta técnica é que ela pode produzir padrões de gradiente com alta reprodutibilidade e permitiu a triagem da resposta celular às estruturas observacionais dos parasitas. A resposta observada à estimulação física ainda não foi totalmente descoberta. Acreditamos que nosso método será uma ferramenta essencial para descobrir esses mecanismos desconhecidos.Para começar, conecte um béquer de camisa dupla contendo a solução de eletropolimento a um circulador e ajuste a temperatura em sete graus Celsius. Deixe a solução mexendo por pelo menos 30 minutos até que a temperatura caia para sete graus Celsius. Mergulhe a placa de alumínio ultrapuro e o contra-eletrodo de carbono na solução de eletropolimento usando clipes de crocodilo e fio de cobre.Ajuste a posição da placa de alumínio no contra-eletrodo de carbono para ficar de frente um para o outro. Conecte a placa de alumínio ao terminal positivo e conecte o contra-eletrodo de carbono ao terminal negativo de uma fonte de alimentação de corrente contínua. Depois de aplicar uma tensão de 20 volts, a placa de alumínio deixa de ter uma superfície áspera e sem brilho para ter uma superfície espelhada de cor prata.Para reali

fabrication-gradient-nanopattern-thermal-nanoimprinting-technique

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós descrevemos um protocolo para a microfabricação do dispositivo de geração de gradiente microfluídicos que pode gerar gradientes espaciais e temporais bem definidos em microambiente. Nesta abordagem, o dispositivo de geração de gradiente microfluídicos pode ser usado para estudar a migração celular dirigido, a embriogênese, cicatrização de feridas, e metástase de câncer.

Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular

Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Neste protocolo, demonstramos a fabricação de substratos biomiméticos de cultura de células cardíacas feitos de dois materiais poliméricos distintos usando litografia de força capilar.  Os métodos descritos fornecem uma técnica escalável e econômica para projetar a estrutura e a função dos tecidos cardíacos macroscópicos para aplicações in vitro e in vivo.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Um método para a montagem de gradientes de adesivo e solúvel em uma câmara de microscopia para estudos de migração de células vivas é descrito. O ambiente artificial combina superfícies antivegetativas e faixas adesivas com gradientes de solução e, portanto, permite que se determine a importância relativa das pistas de orientação.

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Nós relatamos em técnicas para micropattern nanoporous filmes finos de ouro através de impressão stencil e fotolitografia, bem como métodos para cultura de células sobre os padrões microfabricados. Além disso, descrevemos métodos de análise de imagem para caracterizar a morfologia do material e as células cultivadas utilizando electrónica de varrimento e técnicas de microscopia de fluorescência.

Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

Descrevemos um protocolo para modificar a afinidade celular de uma superfície de andaime em ambiente aquoso. O método aproveita a fotocatálise de dióxido de titânio para decompor o filme orgânico na região foto-irradiada. Mostramos que ele pode ser usado para criar microdomínios de proteínas de andaimes, tanto ex situ quanto in situ.

Photopatterning proteínas e células em Aqueous Ambiente Usando TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Photocatalysis

Este artigo apresenta uma abordagem simples para fornecer não-contínuo gradientes cepas estáticas em um hidrogel de célula-carregado concêntrico para regular o alinhamento da célula para a engenharia de tecidos.

Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

Um protocolo para produzir uma grande área de substrato nanopadronizado a partir de pequenos moldes nanopadronizados para estudo da modulação nanotopográfica do comportamento celular é apresentado.

Expansão Nanopatterned Substratos usar a técnica do ponto de Nanotopographical modulação do comportamento celular

O controle de gradientes químicos e de oxigênio é essencial para culturas de células. Este artigo relata um dispositivo microfluídico de polidimetilsiloxano-policarbonato (PDMS-PC) capaz de gerar de forma confiável combinações de gradientes químicos e de oxigênio para estudos de migração celular, que podem ser praticamente utilizados em laboratórios biológicos sem instrumentação sofisticada.

Polidimetilsiloxano-policarbonato microfluídicos para celular Estudos Migratórios Sob Perpendicular Chemical e gradientes de oxigênio

Este artigo descreve a metodologia detalhada para preparar uma matriz multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulação de alta produtividade de física e química sugestões imitando na vivo o microambiente celular e para Identifica o ambiente celular ideal para as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) com perfis de célula única.

Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado

Apresentamos um protocolo para produção de alto rendimento de canais vasculares com tamanhos flexíveis e padrões desejados em uma placa padrão de seis poços usando a tecnologia de bioimpressão 3D, conhecida como vasos em uma placa (VOP). Esta plataforma tem o potencial de avançar no desenvolvimento de terapêuticas para os distúrbios associados ao endotélio comprometido.

Método de bioimpressão de alto rendimento para modelagem da permeabilidade vascular em placas padrão de seis poços com flexibilidade de tamanho e padrão

Aprenda a fabricar placas com nanopadrões gradiente por nanoimpressão térmica e analise a resposta de células progenitoras endoteliais humanas. Este método permite investigar mecanismos celulares por estímulos físicos.

Fabricação de gradiente Nanopattern pela técnica de Nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas (Vídeo) | JoVE Journal

Fabricação de gradiente Nanopattern pela técnica de Nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas

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