Fabricação de gradiente Nanopattern pela técnica de Nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas

A principal vantagem desta técnica é que ela pode produzir padrões de gradiente com alta reprodutibilidade e permitiu a triagem da resposta celular às estruturas observacionais dos parasitas. A resposta observada à estimulação física ainda não foi totalmente descoberta. Acreditamos que nosso método será uma ferramenta essencial para descobrir esses mecanismos desconhecidos.

Para começar, conecte um béquer de camisa dupla contendo a solução de eletropolimento a um circulador e ajuste a temperatura em sete graus Celsius. Deixe a solução mexendo por pelo menos 30 minutos até que a temperatura caia para sete graus Celsius. Mergulhe a placa de alumínio ultrapuro e o contra-eletrodo de carbono na solução de eletropolimento usando clipes de crocodilo e fio de cobre.

Ajuste a posição da placa de alumínio no contra-eletrodo de carbono para ficar de frente um para o outro. Conecte a placa de alumínio ao terminal positivo e conecte o contra-eletrodo de carbono ao terminal negativo de uma fonte de alimentação de corrente contínua. Depois de aplicar uma tensão de 20 volts, a placa de alumínio deixa de ter uma superfície áspera e sem brilho para ter uma superfície espelhada de cor prata.

Para realizar a anodização primária, despeje um litro do eletrólito em um béquer de camisa dupla de dois litros. Mergulhou a placa de alumínio polido e o contra-eletrodo de carbono na solução com clipes de crocodilo em fio de cobre. Instale um eixo vertical em um pedestal em forma de U.

Conecte um agitador suspenso e um impulsor usando braçadeiras de metal. Posicione a hélice do impulsor perto da extremidade inferior de ambos os eletrodos. Defina a velocidade de rotação da agitação aérea entre 200 e 300 rpm e aplique uma tensão de 195 volts sob agitação por 16 horas.

Após a anodização primária, a cor da placa de alumínio muda de prata para cinza. Para realizar a coceira de alumina, mergulhe a placa de alumínio anodizado na solução de gravação. Selar a parte superior do copo com papel alumínio e deixar mexer durante pelo menos 10 horas.

Durante a etapa de gravação, a cor da placa de alumínio muda de cinza para branco. Para a anodização secundária, estabeleça as mesmas condições experimentais da anodização primária e aplique novamente uma tensão de 195 volts por seis horas. Após a anodização secundária, a cor da placa de alumínio muda de branco para cinza.

Para realizar o alargamento dos poros do gradiente, primeiro conecte o béquer de camisa dupla contendo uma solução de ácido fosfórico ao circulador e ajuste a temperatura em 30 graus Celsius. Coloque um palco móvel linear verticalmente ao lado do copo e prenda um suporte à parte móvel do palco linear. Coloque a parte móvel do palco linear na posição inicial.

Prenda o clipe do suporte e carregue a placa de alumínio anodizado. Manipule a posição da placa de alumínio manualmente para que a placa de alumínio fique logo acima da superfície da solução. Mergulhe gradualmente a placa de alumínio na solução a uma velocidade de quatro vírgula oito e seis mícrons por segundo por 120 minutos para fazer um molde AAO de 35 milímetros com um gradiente de tamanho de 120 nanômetros a 200 nanômetros.

Inicie um cronômetro no momento em que a placa de alumínio toca a superfície da solução. Após 100 minutos, metade do molde AAO deve estar na solução. Para fazer os moldes GP 200 a 280 e GP 280 a 360, imergiu toda a área do molde GP 120 a 200 na solução de alargamento de poros por duas a quatro horas, respectivamente.

Mergulhe a solução de molde AAO e piranha por 30 segundos usando uma pinça não metálica. Enxágue o molde AAO várias vezes com água deionizada. Mergulhe o molde em água deionizada por 30 minutos e coloque em álcool metílico por mais 30 minutos.

Seque completamente o molde AAO sob vácuo por três horas. Para deposição de monocamadas automontadas, mergulhe o molde AAO em 57 mililitros de hexano filtrado e um béquer de 100 mililitros. Em seguida, adicione três mililitros de solução estoque de HDFS ao hexano N para fazer uma solução HDFS de 2,9 milimolares e aguarde 10 minutos para que a reação prossiga.

Depois de transferir o molde AAO para fresco e hexano, embebido o molde AAO em 60 mililitros de metoxi-nonafluorobutano. Limpe por ultrassom o molde AAO em um béquer por 10 segundos de uma vez para remover as moléculas de HDFS fisicamente adsorvidas. Repita o procedimento de limpeza 10 vezes antes de secar o molde AAO sob vácuo por 24 horas.

Corte uma folha de poliestireno de um ponto e um milímetro de espessura em um tamanho de dois vírgula nove milímetros de largura por três vírgula sete milímetros de comprimento usando um cortador de placa de circuito impresso. Trabalhando em uma sala limpa, corte o molde AAO a 35 milímetros do fundo usando uma pinça. Marque o nome da amostra e o fabricante dos dados no verso.

Limpe um wafer de oito vírgulas de zero polegada com a pequena dose de álcool etílico, depois coloque as folhas de poliestireno no wafer e monte o molde AAO. Em seguida, coloque o filme inferior na gaveta de uma impressora térmica e prenda o filme superior à gaxeta, depois coloque o wafer no filme inferior e coloque a gaxeta no wafer. Certifique-se de que não haja poeira no wafer.

Depois de fechar a gaveta da térmica e da impressora, aplique 165 graus Celsius de calor e 620 vírgula cinco/dois quilopascal de pressão a partir de 100 segundos. Em seguida, resfrie a amostra à temperatura ambiente. Depois de esfriar, ventile a câmara e a pressão cairá para zero quilo Pascal.

Torça suavemente a folha de poliestireno para liberar o molde AAO. Colete 50 mililitros de sangue humano usando um tubo inibidor de heparina. Coloque seis mililitros de solução de polissacarídeo hidrofílico em um tubo de 15 mililitros e adicione oito mililitros de sangue à solução de polissacarídeo hidrofílico.

Um sangue precisa ser coletado imediatamente e adicionado lentamente em cima da solução de polissacarídeo hidrofílico. Depois de centrifugar o tubo a 1020 vezes G por 20 minutos para granular as células, colher a camada de células opaca e transferi-la para um novo tubo de 15 mililitros. A 10 mililitros de PBS contendo 10% de FBS na centrífuga, o tubo a 1020 vezes G por 10 minutos para pellet as células.

Remova o sobrenadante e adicione tampão de lise de glóbulos vermelhos. Depois de incubar em gelo por cinco minutos em PBS contendo 10% FBS e centrifugar o tubo a 1020 vezes G por cinco minutos para pellet as células. Remova o sobrenadante e adicione um mililitro de meio de expansão de células endoteliais suplementado com 10% de FBS.

Semeie oito vírgula zero milhão de células por poço para cada placa codificada de colágeno. Induza as células formadoras de colônias humanas e etéreas, conforme descrito no protocolo de texto, e cultive as células até a passagem sete para novos experimentos. Em seguida, cubra as placas de padrão nano gradiente com um mililitro de solução de revestimento de proteína de zero vírgula a um por cento em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.

Fazer uma suspensão de ECFC humanos da placa de cultura por um método padrão de divisão celular usando tripsina. Depois de diluir a suspensão celular para alcançar a confluência desejada, semeie os ECFCs humanos cessam nas placas de nanopadrão de gradiente em um controle plano. Cultive as células em placas de nanopadrão planas ou gradientes por dois dias na incubadora.

Essas imagens mostram os moldes AAO fabricados sob três condições diferentes de alargamento de vazamento. Um lado com o menor tempo imerso na solução de condicionamento de ácido fosfórico tem o menor tamanho de poros, enquanto o outro lado com o maior tempo na solução de condicionamento tem o maior tamanho de poros. Como o padrão nano foi transferido para o poliestireno através do método de impressão térmica, as estruturas dos nano pilares são geradas na superfície do poliestireno e o gradiente de tamanho do molde AAO é mantido em placas de nano padrão.

Os ECFCs humanos confluentes mostraram que a morfologia típica de paralelepípedos informa uma colônia que pode ser facilmente distinguida sob um microscópio de contraste de fase. Após dois dias de cultivo de ECFCs humanos no plano em placas de padrão nano gradiente, foi observado um crescimento significativo de filopódios em células cultivadas em GP 120 a 200. Por outro lado, nenhuma mudança notável foi observada no GP 200 a 280 ou GP 280 ao 360 em comparação com o controle plano.

Este resultado indica que a resposta das células é diferente dependendo do tamanho da nanoestrutura da superfície. Existem muitas etapas para fabricar uma placa de padrão nano. Portanto, pode ser complicado no começo, mas uma vez dominado, você obterá padrões com gradiente de tamanho de desejos sem dificuldades.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma grande compreensão de como produzir placas de padrão nano gradiente e cultivar para humanos e as séries de formação de colônias mais tolas na placa de padrão nano. Além disso, este método está disponível para vários tipos de séries. Este método pode fornecer uma ponte entre a engenharia de materiais e a biotecnologia que ajudará a entender as injeções de células e a topografia Nano da superfície.