Name: Matriz de glicano impressa: Uma técnica sensível para a análise do repertório de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprenda a técnica de matriz de glicano impressa para análise de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais. Este método permite medir centenas de alvos glicânicos com alta sensibilidade usando volumes mínimos de amostra.

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Este trabalho foi apoiado pela "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) conceder PI13/01098 do Instituto de saúde Carlos III, Ministério espanhol da saúde. DB-G foi beneficiado de uma posição de investigação pós-doutoramento financiada pela União Europeia sétimo programa-quadro (FP7/2007-2013) sob o 603049 de acordo de Grant (TRANSLINK). Trabalho de NB e NK, NS, foi apoiado por grant #14-50-00131 da Fundação de ciência russo. DB-G quer expressar sua gratidão a Marta Broto, J. Pablo Salvador e Ana Sanchis assistência técnica excelente e Alexander Rakitko para auxílio na análise estatística. Com o apoio do "Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d'Universitats eu Recerca del Departament d'Empresa eu Coneixement de la Generalitat de Catalunya (conceder número 2018 DI 021). Agradecemos a CERCA programa / Generalitat de Catalunya para apoio institucional.

1. Glycochips produção
<ol><li>
Preparação de Microarray
	<ol>
<li>Imprimir os glicanos (50mm) e polissacarídeos (10 µ g/mL) em fosfato de 300mm, solução salina tamponada (PBS, pH 8,5) em 6 repetições em lâminas de vidro de N-Hidroxisuccinimida-derivatizado, usando o contato não-robótico arrayer (queda de volume de ~ 900 pL). Cada slide contém 4 blocos de diferentes matrizes sub (figura 1A, em cores) repetidos 6 vezes. Cada submatriz único é formado por 112 glicano diferentes pontos, incluindo controles (8 linhas × 14 colunas) (figura 1B). Nota: Informações relacionadas ao glicano são fornecidas na tabela complementar 1. A biblioteca de glicano usada para impressão "microchips" é o resultado de um esforço sintético a longo prazo da equipe IBCh; exemplos de síntese são descritos em publicações relacionadas29,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38. A biblioteca de glicano incluído antígenos do grupo sanguíneo e alguns dos mais frequentemente ocorrendo oligossacarídeos terminais, bem como os motivos de núcleo dos mamíferos N - e O-ligados glicoproteínas e glicolipídios, antígenos de carboidrato associada a tumor, e polissacarídeos de bactérias patogênicas.</li>
		<li>A incubar em caixa de umidade (umidade relativa ~ 70%) à temperatura ambiente (25 ° C) por 1h.</li>
		<li>Bloqueio de microarrays: a incubar por 1,5 h com tampão de bloqueio à temperatura ambiente (ácido bórico de 100mm, etanolamina 25 mM, 0,2% (v/v) em água ultrapura de Tween-20).</li>
		<li>Lavar o glycochip com água ultrapura e secá-la pelo ar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Controle de qualidade de Glycochip
	<ol>
<li>Analisar dois microarrays de cada lote usando 1mg/mL solução de preparação complexo imunoglobulina (CIP, contendo IgG, IgM e IgA), 10 µ g/mL da solução de imunoglobulinas de anti-humano biotinilado cabra como um anticorpo secundário (IgM + IgG + IgA), seguido de 1 µ g/mL solução do conjugado fluorescente streptavidin correspondente (via protocolo descrito abaixo, consulte a etapa 2).</li>
		<li>Digitalizar e analisar o glycochips (consulte a etapa 3, análise da matriz de glicano).</li>
		<li>Use lotes de microarray com chip intra e inter correlação superior a 0,9.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. glicano matriz técnica
<ol><li>
Preparar as seguintes soluções aquosas (em água ultrapura) e armazená-los em temperatura ambiente (25 ° C):
	<ul>
<li>1-tampão: 1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) em PBS, 1% (v/v) Tween-20 e 0,01% (p/v) de NaN3
</li>
		<li>Tampão-2: 1% (p/v) BSA em PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 e 0,01% (p/v) de NaN3.</li>
		<li>3-tampão: 0,1% (v/v) Tween-20 em PBS.</li>
		<li>4-tampão: 0,001% (v/v) Tween-20 em PBS.</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Preparação de Glycochip e amostra
	<ol>
<li>Coloque a caixa de armazenamento com os slides sobre a mesa, até atingirem a temperatura ambiente (25 ° C). Nota: Utilize luvas de látex sem pó. O glycochip deve ser manipulado pela parte inferior da lâmina de vidro, onde se encontra o código de barras. O código de barras vai ajudar você a identificar o lado direito, evitando o contato com a superfície onde os glicanos são impressos.</li>
		<li>Abrir a caixa, pegue o glycochip e colocá-lo na câmara de incubação (25 ° C), já condicionada com papel de filtro molhado a manter a umidade constante no interior da câmara.</li>
		<li>Enquanto isso, dilua o soro de ratos com Buffer-1 (01:20) em tubos de 1,5 mL. Homogeneizar a solução de soro (5 s) com um misturador do vortex. Nota: O volume necessário para cobrir totalmente uma superfície única glycochip é aproximadamente de 1 mL.</li>
		<li>Após a homogeneização, incube o soro diluído a 37 ° C por 10 min em um banho de água para evitar a agregação de imunoglobulina. Centrifugar os tubos por 3 min em 10.000 x g e 25 ° C, recolher o sobrenadante e descartar qualquer material precipitado.</li>
		<li>Coloque o glycochip cuidadosamente em câmara úmida. -Incube por 15 min a 25 ° C, com 1 mL de tampão-3 para eliminar qualquer material residual na superfície do glycochip.</li>
		<li>Mantenha o glycochip na posição vertical e rewash-lo com algumas gotas de Buffer-3 utilizando uma pipeta Pasteur plástica. Cuidadosamente remova o tampão da superfície glycochip usando papel de filtro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reação: ligação de anticorpos
	<ol>
<li>Coloca o glycochip na câmara de incubação. Espalhe a amostra de soro diluído sobre a superfície de glycochip utilizando uma micropipeta. Incube com agitação orbital (30 rpm) a 37 ° C por 1,5 h. Certifique-se de que toda a área seca da superfície glycochip é coberta pela amostra de soro diluído, usando a ponta da pipeta.</li>
		<li>Retire qualquer excesso amostra e mergulhe o glycochip por 5 min em Buffer-3 a 25 ° C. Em seguida, mover o glycochip para um contêiner com Buffer-4 (5 min) e finalmente lavar o glycochip com água ultrapura (5 min). Centrifugue a glycochip por 1 min em 175 x g e 25 ° C, para remover o líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deteção: anticorpo secundário
	<ol>
<li>Coloca o glycochip na câmara de incubação. Espalhe sobre a superfície de glycochip uma solução (5 µ g/mL), de cabra anti-rato (IgG + IgM) conjugada com biotina em Buffer-2. Incube com agitação orbital (30 rpm) a 37 ° C por 1h.</li>
		<li>Remover a fração não acoplada e repita as etapas de lavagem.</li>
		<li>Após a centrifugação, incube o glycochip na escuridão a 25 ° C, durante 45 min (30 rpm) com 2 µ g/mL da solução de correspondente streptavidin fluorocromo-rotulado (no Buffer-2).</li>
		<li>Na escuridão, remover a fração não acoplada e repita as etapas de lavagem.</li>
		<li>Seque o glycochip pelo ar. Nota: Glycochip deve ser verificado logo que possível. Mas se não for possível digitalizar imediatamente depois da coloração, glycochips pode ser armazenado em local fresco e seco na escuridão.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. análise da matriz de glicano
<ol><li>
Digitalizar a matriz
	<ol>
<li>Deixe o glycochip na mesa até que ele atinja a temperatura ambiente no escuro. Ao mesmo tempo, ligue o scanner de slides e o laser (comprimento de onda de excitação de 633 nm).</li>
		<li>Segurando o microarray, deslize o glycochip na ranhura até que toque a parte de trás.</li>
		<li>Digitalizar o glycochip ("executar varredura fácil") e salvar a digitalização como um ". Arquivo TIFF".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificação de matriz
	<ol>
<li>Quantificar a matriz usando um sistema de análise de ScanArray. Aberto anteriormente imagens digitalizadas, clicando em "Arquivo" no "grupo configurar & arquivo" na janela principal (figura 1B-D)</li>
		<li>Carregar o modelo de arquivo correspondente matriz em formato de GAL (disposição dos glicanos impressas sobre a lâmina de vidro) (Figura 1).</li>
		<li>Ajustar o modelo GAL alinhando cuidadosamente a matriz (grades), com as manchas na imagem e iniciar a quantificação (Figura 1).</li>
		<li>Selecione os parâmetros de quantificação:<ul>
<li>Tipo de quantificação: Quant fácil de executar.</li>
			<li>Método de quantificação: fixa o círculo</li>
			<li>Auto encontrar pontos: desmarque todas as opções</li>
			<li>Método de normalização: LOWESS (localmente ponderada Scatter Plot suavização).</li>
		</ul>
</li>
		<li>Salvar os dados quantificados como ". Arquivo CSV"(Figura 1). Transferi dados para um arquivo de planilha comum usando o Microsoft Excel ou outro aplicativo apropriado.</li>
		<li>Use o intervalo interquartil (IQR) como o principal método estatístico: cálculo da mediana (quartil 2) de todos os sinais para cada ligante e o desvio interquartil (percentis 75 e 25, ou quartis superiores e inferiores, Q3 e Q1, respectivamente).</li>
		<li>Execute exploração interativa de dados, usando um aplicativo Explorer de Clustering hierárquico.</li>
		<li>Uso de parâmetros de cluster: enlace média (UPGMA) e distância euclidiana como similaridade distância medida. Execute a clusterização hierárquica por linhas sem normalização.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Nailya Khasbiullinae Alexey Nokel são empregados da Semiotik LLC, que é o fornecedor do glycochips utilizado neste estudo.

Microarrays de glicano tornaram-se ferramentas indispensáveis para o estudo de interações proteína-glicano40. O presente trabalho descreve um protocolo baseado em tecnologia de PGA para estudar o repertório da circulação de anticorpos anti-hidrato de carbono em camundongos BALB/c. Desde que o PGA oferece a possibilidade de um grande número de tela dos glicanos biologicamente desconhecidos, é uma descoberta extremamente conveniente ferramenta13,1...

Os anticorpos desempenham um papel central em nossa defesa contra invasores patogénicos neutralizando diretamente vírus1,2 e bactérias2,3, ativando o sistema complemento4,5 e o reforço da fagocitose6. Além disso, eles são elementos essenciais no direcionamento de câncer e eliminação das células malignas7e homeostase manutenção8,9.
Distúrbios do sistema imunológico podem resultar em doenças auto-imunes e inflamatórias câncer de10 e11. Todas essas condições patológicas, idealmente, exigir um diagnóstico alerta para um tratamento eficiente. No caso de doenças auto-imunes, a presença serológica de auto-anticorpos na maioria dos casos é um predictor para diagnóstico de auto-imunidade10,12. Estes anticorpos reagem com a superfície da célula e extracelulares auto-antigénios e, muitas vezes estão presentes por muitos anos antes da apresentação da doença auto-imune10,12. Câncer e deficiências imunológicas também são diagnosticados com exames de sangue que quer medir o nível de elementos imunes, tais como anticorpos, ou sua atividade funcional11.
A identificação do repertório de anticorpos e seus níveis sorológicos de circulação são fundamentais para definir um prognóstico e avaliar a progressão de todas as mencionadas condições patológicas. Nós anteriormente demonstraram o potencial da técnica do PGA para a análise da circulação anticorpos em diferentes espécies animais13–16, minimizando o uso de grandes volumes de amostras serológicas, evitando o problema associados de reatividade cruzada de anticorpos17 e permitindo elevado-throughput de perfil de um extenso repertório de anticorpos15.
Baseado em glicano imunoensaios são principalmente condicionados, entre outros fatores, pela origem e produção de hidratos de carbono, que determinam a afinidade e ligação de ligantes15,18,19,20 ,21. Os imunoensaios baseados em glicano podem ser desenvolvidos em suspensão (microesferas)15,21,22 , ou em superfícies plana-ativado15,21,22, 23,24. Os últimos incluem o ELISA (o mais convencional desses métodos) e PGA. Não há muitos dados comparando estas metodologias na mesma configuração experimental15,25,26,27. Nós anteriormente compararam a eficácia e seletividade destes imunoensaios para anticorpos antiglicano de perfil em amostras de plasma humano individual15. Para alguns anticorpos como aqueles direcionamento anti-A/B Grupo de sangue, todos os imunoensaios podem detectá-los com significância estatística e eles positivamente correlacionaram com os outros15,18,21. Enquanto isso, os anticorpos anti-P1 foram detectados principalmente pela PGA com a mais alta potência discriminativa, e não houve correlação nas determinações feitas por diferentes baseados em glicano imunoensaios15,18, 21. estas diferenças entre os métodos foram principalmente relacionadas com o anticorpo/antigénio ratio e glicano orientação15. Matrizes de ELISA e suspensão são mais suscetíveis a vinculação inespecíficas que PGA, porque há um excesso de antígeno sobre anticorpos nestes métodos15. Além disso, a orientação dos glicanos em PGA é mais restrita do que em matrizes de ELISA e suspensão15. ELISA é conveniente quando o estudo inclui um painel limitado dos glicanos. Juntamente com matrizes de suspensão, ELISA oferece maior flexibilidade em relação a reconfiguração do ensaio. PGA é extremamente conveniente para descoberta abordagens15,18,21,28. Apesar destas claras vantagens e desvantagens, os três mencionados imunoensaios poderiam ser usados para estudar os diferentes aspectos das interações glicano-anticorpo. O objetivo final do estudo é o que guiará a seleção da metodologia mais adequada.
O presente trabalho tem como objetivo estender o uso da tecnologia de PGA para a análise do repertório de anticorpos antiglicano em pequenos animais em circulação. Como um resultado representativo, apresentamos aqui um protocolo detalhado para avaliar o repertório de anticorpos anticarboidratos naturais em adultos camundongos BALB/c pela PGA.

<table><tbody><tr><td>Anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>biotinilado cabra anti-humano Igs</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>Ref. #: 31782</td><td></td></tr><tr><td>cabra biotinilada anti-rato IgM + IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: 31807</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5&nbsp;</td><td>Scienion AG, Berlim, Alemanha</td><td>http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/</td><td></td></tr> <tr><td>Bandeja de manchas (câmara de incubação de lâminas)</td><td>Simport, Beloeil, QC, Canadá</td><td>Ref. #: M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha&nbsp;</td><td>Ref. #: 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Gilson, Middleton, WI, EUA</td><td>http://www.gilson.com/en/Pipette/</td><td></td></tr> <tr><td>Scanner de slides&nbsp;</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA, EUA</td><td>ScanArray GX Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora agitada</td><td>Cole-Parmer, Staffordshire, Reino Unido</td><td>Ref. #: SI50</td><td></td></tr><tr><td>Amostras biológicas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c soros de camundongos</td><td>Este artigo</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>Preparação de Imunoglobulina Complexa (CIP)</td><td>Immuno-Gem, Moscou, Rússia</td><td>http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531</td><td></td></tr><tr><td><forte>Químicos, Reagentes e Glicanos&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca de glicanos</td><td>Instituto de Química Bioorgânica (IBCh), Moscou, Rússia</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,&nbsp;</td><td>Ref. #: A9418</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: 411000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Espanha</td><td>Ref. #: 655204</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fospahte (PBS)</td><td>VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Espanha</td><td>Ref. #: E404</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: S2002</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugado&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: S21381</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy5 conjugado</td><td>GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido</td><td>Ref. #: PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide-derivatized lâminas de vidro H&nbsp;</td><td>Schott-Nexterion, Jena, Alemanha</td><td>Ref. #: 1070936</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: WHA10347509</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 1,5 mL</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Ref. #: 0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Software e algoritmos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express Sistema de Análise de Microarray</td><td>PerkinElmer</td><td>http://www.per</td><td></td></tr><tr><td>kinelmer.com/microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplicativo Hierarchical Clustering Explorer</td><td>Universidade de Maryland, MD, EUA</td><td>http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/</td><td></td></tr></tbody></table>

matriz de glicano impressa: uma técnica sensível para a análise do repertório de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

O repertório de anticorpos anti-hidrato de carbono de um determinado indivíduo em circulação é frequentemente associado com seu estado imunológico. Não só a condição de imune individual determina o sucesso na luta contra os sinais de ameaça potencial interno e externo, mas também a existência de um determinado padrão de circulação de anticorpos antiglicano (e sua variação de nível serológica) poderia ser um marcador de significativa do aparecimento e progressão de certas condições patológicas. Aqui, descrevemos uma metodologia baseada em impresso glicano matriz PGA que oferece a oportunidade de medir centenas de glicano alvos com altíssima sensibilidade; usando uma quantidade mínima de amostra, que é um comum animais de presente quando pequena restrição (ratos, ratos, hamster, etc.) são usados como modelos para os aspectos de endereço de doenças humanas. Como um exemplo representativo desta abordagem, mostramos os resultados obtidos a partir da análise do repertório de anticorpos antiglicano natural em camundongos BALB/c. Demonstramos que cada rato BALB/c envolvido no estudo, apesar de ser geneticamente idêntico e mantida sob as mesmas condições, desenvolve um padrão específico de anticorpos anticarboidratos naturais. Este trabalho pretende expandir o uso da tecnologia de PGA para investigar o repertório (especificidades) e os níveis de anticorpos anti-hidratos de carbono, tanto na saúde e durante qualquer condição patológica em circulação.

Aqui, apresentamos um resumo dos resultados representativos obtidos a partir da quantificação do repertório de anticorpos antiglicano natural em uma população de 20 camundongos BALB/c. O glycochips utilizado neste estudo continha 419 glicano diferentes estruturas. A maioria os glicanos foram sintetizados como -CH2CH2CH2NH2 Oespaçador-armado-glicosídeos, em vários casos como -CH2CH2NH2 ou NHCOCH -2</...

Este trabalho mostra o potencial da tecnologia de matriz (PGA) glicano impressa para a análise de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação.

Matriz de glicano impressa: Uma técnica sensível para a análise do repertório de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

O objetivo geral deste protocolo é estudar o perfil dos anticorpos antiglicanos circulantes no soro de pequenos animais usando uma tecnologia baseada em matriz glicano impresso. Essa abordagem tem potencial no diagnóstico precoce e no tratamento correto em algumas condições patológicas onde os anticorpos contra estruturas glican desempenham um papel importante. A principal vantagem com essa técnica é a possibilidade de medir no mesmo cenário experimental centenas de alvos glicanos com uma sensibilidade muito alta usando uma quantidade mínima de amostra.Para preparar a micro matriz, use um arrayer robótico sem contato. Imprime seis réplicas de 50 glicanos milimolares e 10 microgramas por polissacarídeos mililitros e 300 mililitros PBS, pH 8,5 em n-hidroxy 6 lâminas de vidro derivatizadas cinnâmicas. Cada slide contém quatro blocos diferentes de subarrays repetidos seis vezes.Cada subarray é formada por 112 pontos diferentes de glicanos, incluindo controles. Incubar os slides em uma caixa de umidade em temperatura ambiente por uma hora. Para bloquear as micro matrizes, incubar os slides por 1 1/2 horas com tampão de bloqueio à temperatura ambiente.Em seguida, lave o chip glicol com água ultra pura e seque-o pelo ar. Prepare o buffer um através do buffer quatro, conforme descrito no protocolo de texto. Para preparar os chips e amostras de glicol, coloque a caixa de armazenamento com os slides sobre a mesa até atingirem a temperatura ambiente.Abra a caixa e transfira o chip glicol para a câmara de incubação que já deve ser condicionado com papel filtro molhado para manter a umidade constante dentro da câmara. Enquanto isso, diluir o soro de camundongos com tampão um em tubos de 1,5 mililitro. Homogeneize a solução de soro por cinco segundos com um misturador de vórtice.Após a homogeneização, incubar o soro diluído a 37 graus celsius por 10 minutos em um banho de água para evitar a agregação de imunoglobulina. Em seguida, centrifugar os tubos por três minutos a 10.000 vezes G e 25 graus Celsius. Recolhe o supernaspe e descarta qualquer material precipitado.Coloque o chip glicol cuidadosamente na câmara de incubação. Incuba-o com um mililitro de tampão três para eliminar qualquer material residual na superfície do chip glicol. Por 15 minutos, a 25 graus Celsius.Segure o chip glicol em uma posição vertical e recue-o com algumas gotas de buffer três usando uma pipeta pasteur de plástico. Em seguida, remova cuidadosamente o tampão da superfície do chip glicol usando papel filtro. Coloque o chip glicol de volta na câmara de incubação.Espalhe a amostra de soro diluído sobre a superfície do chip glicol usando uma micro pipeta. Certifique-se de que todas as áreas secas da superfície do chip glicol estejam cobertas pela amostra de soro diluído usando a ponta da pipeta. Incubar com agitação orbital a 37 graus Celsius por 1 1/2 horas.Após a incubação, remova qualquer amostra em excesso e mergulhe o chip glicol por cinco minutos no buffer três a 25 graus Celsius. Passe o chip glicol para um recipiente com tampão quatro e, finalmente, lave o chip glicol com água ultra pura. Centrifugar o chip glicol por um minuto a 175 vezes G e 25 graus Celsius para remover o líquido.Depois de colocar o chip glicol de volta na câmara de incubação, espalhe uma solução de anti-rato de cabra conjugado à biotina sobre a superfície do chip glicol. Incubar com agitação orbital a 37 graus Celsius por uma hora. Retire a fração desvinculada e repita as etapas de lavagem.Após a centrifugação, incubar o chip glicol na escuridão a 25 graus Celsius por 45 minutos com dois microgramas por mililitro da solução de streptavidina rotulada fluorocromo correspondente no buffer dois. Depois de trabalhar na escuridão para remover a fração desvinculada e repetir os passos de lavagem, seque o chip glicol pelo ar. Para escanear a matriz, deixe o chip glicol sobre a mesa até atingir a temperatura ambiente no escuro.Ao mesmo tempo, ligue o scanner de slides e o laser. Segurando a micro matriz, deslize o chip glicol para dentro do slot até tocar a parte de trás. Escaneie o chip glicol executando o EasyScan e salve a varredura como um arquivo tif.Quantifique a matriz usando um sistema de análise ScanArray. Abra as imagens digitalizadas anteriormente clicando no arquivo na configuração e no grupo de arquivos na janela principal. Carregue o modelo de arquivo de matriz correspondente no formato GAL, o que representa a disposição de glícanos impressos no slide de vidro.Ajuste o modelo GAL alinhando cuidadosamente a matriz com as manchas na imagem e inicie a quantificação. Selecione os perímetros de quantificação como tipo de quantificação executado fácil quant e método de quantificação círculo fixo. Despreseça todas as opções para o auto encontrar pontos e selecione lowess para o método de normalização.Salve os dados quantificados como um arquivo csv. Transfira esses dados para um arquivo de planilha comum usando o Microsoft Excel ou outro aplicativo apropriado. Camundongos geneticamente idênticos não devem ser considerados como equivalentes imunológicos porque desenvolveram diferentes padrões de anticorpos anti carboidratos naturais.Como mostrado aqui, apenas 12 especificidades glicocanos foram conservadas. Mostrado aqui, é um exemplo representativo das imagens obtidas a partir de micro chips de varredura usando um scanner florescente. A grade é então alinhada aos pontos em cada sub array.Os florescentes são detectados para cada ponto e os resultados são transferidos para um arquivo de planilha comum. Após a incubação com soro do mouse, os chips de glico foram escaneados usando um leitor de matriz de varredura. Os dados foram analisados com um sistema de análise de micro array e os resultados foram expressos na RFU como mediana mais de menos o desvio absoluto mediano.As cores azul e branco representam sinais de ligação de fundo inferiores a 4000 RFU. A cor vermelha representa sinais de ligação positivos maiores ou iguais a 4000 RFU. A maioria das estruturas glicas expostas nos chips glicol não foram reconhecidas pelo repertório de anticorpos antiglicanos circulantes de ratos balp C.Uma vez dominada esta técnica pode ser feita em cinco horas e 45 minutos se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a tecnologia de matriz de glicon de impressora para investigar o repertório e os níveis de anticorpos anti carboidratos circulantes em amostras de soro. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o chip glico deve ser manipulado por uma parte inferior da luz dos óculos.Onde o código de barras está localizado. Para evitar contato com os glicanos impressos. Além disso, certifique-se de que toda a área seca do chip glico esteja coberta pela amostra de soro diluído usando a ponta da pipeta.O volume necessário para cobrir totalmente uma única superfície de um chip de glico é de aproximadamente um mililitro. Após este procedimento, outros métodos como o conjunto de suspensão da base da microesfera podem ser feitos para responder a perguntas adicionais relacionadas à detecção flexível de multiplex do perfil de anticorpos antiglicanos. Após sua introdução, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo de moléculas de biomacral e imunologia explorarem uma interação não-proteína glicol no conjunto de pequenos animais.

printed-glycan-array-sensitive-technique-for-analysis-repertoire

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo melhorado para um microarray anticorpo multiplexado de alto rendimento com o método de detecção de lectina que pode ser usado em perfil de glicosilação de proteínas específicas. Este protocolo apresenta novos reagentes fiáveis ​​e reduz significativamente o tempo, custo e requisitos de equipamento de laboratório, em comparação com o procedimento anterior.

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

Este vídeo demonstra a tecnologia de matriz de glicanos impressos para analisar anticorpos antiglicanos circulantes no soro de camundongos. Os anticorpos no soro interagem com glicanos específicos no chip, o que é confirmado por imunocoloração seguida de varredura de fluorescência.

Detecção de anticorpos antiglicanos circulantes com uma matriz de glicanos impressa

Usando uma estratégia de microarray de glicano impresso, um ensaio convencional de placa de 96 poços foi miniaturizado para análise da avidez e especificidade da hemaglutinina do vírus influenza A para receptores contendo ácido siálico.

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

Descrevemos aqui um método para gerar microarrays de antígenos personalizáveis que podem ser usados para a detecção simultânea de autoanticorpos séricos IgG e IgM de humanos e camundongos. Essas matrizes permitem alto rendimento e detecção quantitativa de anticorpos contra quaisquer antígenos ou epítopos de interesse.

Geração de duas cores Antigen Microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos IgG e IgM

Uma abordagem modular para a síntese de N- os glicanos para fixação a um vidro revestido de óxido de alumínio slide (slide ACG) como desenvolveu um microarray glicano e demonstrou-se seu uso para a criação de perfil de um HIV amplamente neutralizando anticorpos.

Quimio-enzimático síntese de N- os glicanos para desenvolvimento de matriz e anticorpos de HIV de criação de perfil

Um ensaio de microarrays de sialoglicano pode ser usado para avaliar anticorpos anti-Neu5Gc em soros humanos, tornando-se um possível ensaio de diagnóstico de alto rendimento para câncer e outras doenças crônicas causadas por inflamação mediada por doenças humanas.

Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano

Um protocolo detalhado para a purificação e a análise subseqüente de um anticorpo monoclonal do líquido de cultura de pilha colhido (HCCF) de microbioreactors automatizados foi descrito. O uso de análises para determinar os atributos críticos de qualidade (CQAs) e maximizar o volume de amostra limitado para extrair informações vitais também é apresentado.

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

O padrão de glicosylation de um anticorpo determina seu desempenho clínico, assim persistem os esforços industriais e acadêmicos para controlar a glicosylation. Uma vez que as campanhas típicas de glicoengenia são tempo e trabalhoso, a geração de um protocolo rápido para caracterizar o impacto dos genes de glicosylação usando silenciamento transitório seria útil.

Glicoengenia de anticorpos rápidos em células de ovário de hamster chinês

Microarray polymer profiling (MAPP) é uma técnica de alto rendimento para análise composicional de glicanos em amostras biológicas.

Perfil de polímero de microarray (MAPP) para análise de glicanos de alto rendimento

Um método simples blot slot foi desenvolvido para a quantificação da gripe hemaglutinina e neuraminidase viral utilizando anticorpos universal, direccionado para suas seqüências mais conservadas identificados através de análises de bioinformática. Esta abordagem inovadora pode fornecer uma alternativa útil para determinação quantitativa de todos os hemaglutinina e neuraminidase viral.

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Aprenda a técnica de matriz de glicano impressa para análise de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais. Este método permite medir centenas de alvos glicânicos com alta sensibilidade usando volumes mínimos de amostra.

Matriz de glicano impressa: Uma técnica sensível para a análise do repertório de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação (Vídeo) | JoVE Journal

Matriz de glicano impressa: Uma técnica sensível para a análise do repertório de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação

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