Name: Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Aprenda a isolar células do estroma endometrial humanas e induzir decidualização in vitro com suplementação hormonal. Este protocolo demonstra também o silenciamento gênico por siRNA para estudar mecanismos moleculares na biologia reprodutiva.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Todas as biópsias de endométrio humano coletadas para este estudo foram alcançadas na Universidade de Washington em St. Louis, departamento de obstetrícia e Ginecologia usando um institucional Review Board (IRB) aprovou o formulário de consentimento por escrito.
1. preparação
<ol><li>Prepare 500 mL de 1 x do Hank equilibrado sal solução (HBSS) adicionando 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL para o frasco contendo mídia (mais referenciado como meio HBSS +).</li>
	<li>Preparar 500 mL de meio de águia de Dulbecco modificado: F-12 mistura de nutrientes (DMEM/F12) com vermelho de fenol, L-glutamina e 15mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) adicionando 1% solução de antibiótico antimicótico (a concentração final é de 0,25 µ g/mL, 100 µ g/mL Estreptomicina e 100 U/mL penicilina Fungizone) para a mídia contendo o frasco (ainda mais referenciado como meios de isolamento HESC).</li>
	<li>Preparar 500 mL de DMEM/F12 com vermelho de fenol, L-glutamina e 15 mM HEPES, adicionando 10% de soro Fetal bovino (FBS), 1 x at2HCO3e 1% penicilina (10.000 U/mL) e estreptomicina (10.000 µ g/mL) (caneta Strep) à mídia contendo frasco (mais referenciado como HESC Media).</li>
	<li>Preparar 500 mL de meio de soro reduzido com L-glutamina, bicarbonato de sódio 2,4 g/L e HEPES com 2% carvão despojado Fetal soro bovino (csFBS) e 1% Strep caneta à mídia contendo frasco (mais referenciado como Decidualization Media).</li>
	<li>Prepare 500 mL de vermelho de fenol livre DMEM/F12, adicionando 2% carvão despojado de soro fetal bovino (csFBS) na mídia contendo frasco (mais referenciado como mídia de mudança).</li>
	<li>Prepare-se 10 nM estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona 1 µM (MPA) e 50 µM adenosina monofosfato cíclica (cAMP) em um tubo cónico polipropileno de 15 mL e adicionar a 2 mL por alíquota bem de mídia previamente preparado decidualization para in vitro ensaio de decidualization (mais referenciado como EPC Media).</li>
	<li>Prepare 50 mL de congelação mídia com 90% FBS e 10% dimetilsulfóxido (DMSO) 50 mL polipropileno cónica (mais referenciada como meios de congelamento).</li>
	<li>Pre-pesar 25 mg de colagenase e 5 mg de DNase I em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL e loja a-20 ° C.</li>
</ol>2. aquisição de biópsia de endométrio humana
<ol><li>Obter amostras de biópsia de endométrio humano coletadas na fase proliferativa (dia 9 - dia 12) do ciclo menstrual da clínica em HBSS IRB aprovado.</li>
	<li>Lavar as amostras de biópsia com 1 mL de escaldadas 37 ° C HBSS + médio e agite suavemente para remover o excesso de sangue e muco.</li>
</ol>3. isolamento de células do estroma Endometrial humanas (HESC)
Nota: Este procedimento de isolamento é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.
<ol><li>Transferir a biópsia com Pinças esterilizadas em um tubo de centrifuga conico de polipropileno de 50 mL contendo 10 mL HBSS fresco.</li>
	<li>Centrifugue a biópsia à temperatura ambiente a 500 x g, durante 90 s.<ol>
<li>Se as rupturas de pellet celular, re-spin a biópsia a 2.000 x g, durante 90 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova a mídia usando uma pipeta de 1 mL e lavar com 10 mL de 37 ° C pré-aquecido HESC isolamento Media seguido por centrifugação a 500 x g durante 90 s.</li>
	<li>Remova a mídia usando uma pipeta de 1 mL e vigorosamente, adicionar 3 mL de mídia de isolamento HESC fresco para desalojar a biópsia.</li>
	<li>Decante a biópsia para uma placa de Petri contendo 5 mL de HESC isolamento Media.</li>
	<li>Picar a biópsia em como pequenas peças possível usando #5 pinças e tesouras de costura reta bem por cerca de 20 minutos.</li>
	<li>Preparar a DNase I e enzimas colagenase, adicionando 10 mL de HESC isolamento Media para pré-pesados DNase I (0,5 mg/mL) e colagenase (2,5 mg/mL). Misture com pipeta.</li>
	<li>Pipeta de corta amostras de tecido usando uma pipeta de 1 mL para um tubo de polipropileno cônico de novo 50 mL. Lavar com 7 mL de meios de isolamento HESC e adicionar ao tubo de polipropileno para adquirir a amostra completa.</li>
	<li>Centrifugar a amostra à temperatura ambiente a 800 x g por 2 min. Retire com cuidado o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Filtre o DNase I e solução de colagenase através de filtro de 0,2 µm anexados a seringa de 10 mL diretamente na pelota.</li>
	<li>Vórtice de 10 s para resuspenda o pellet.</li>
	<li>Digest em banho de água a 37 ° C por 1,5 h, num Vortex para 10 s minuciosamente cada 10 min, até tecido é digerido.</li>
	<li>Filtre a amostra através de um filtro de célula 40 µm empilhados sobre um tubo de polipropileno cônico de 50 mL para remover as células epiteliais e restos de tecido. Nota: As células estromais são no tubo de polipropileno cônico de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar o tubo polipropileno cônico de 50 mL a 800 x g, durante 2,5 min à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 10 mL de HESC isolamento Media.</li>
	<li>Centrifugar a 800 x g, durante 2,5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e depois Ressuspender as células em 6 mL de mídia HESC e pipeta para diante e reversa para misturar.</li>
	<li>Lentamente a camada em 3 mL de mídia gradiente de densidade para as células ressuspensa separar restantes células do sangue das células do estroma, tomando cuidado para não misturar as camadas.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de polipropileno de 15 mL a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coletar 5 mL do sobrenadante em um novo tubo de polipropileno de 50 mL e adicionar um adicionais 5 mL HESC mídia para Ressuspender as células.</li>
	<li>Centrifugar a 800 x g durante 2,5 min à temperatura ambiente, seguida pela remoção do líquido sobrenadante e adição de 6 mL HESC Media. Vórtice da amostra durante 10 segundos e mistura pipetando para a frente e reverter 5 vezes.</li>
	<li>Alíquota de 10 µ l de células re-suspensas para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para contagem de células.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de 0,4% de azul de Trypan manchar a alíquota de pilha e misture com pipeta. Carregar 10 µ l da alíquota e contar as células usando um hemocytometer.</li>
	<li>As células em um frasco apropriado dependente contagem celular total em 15 mL HESC Media da placa.<ol>
<li>Se o número total de células é menor que 1 milhão, placa todas as células em balão de 25 cm com 6 mL de HESC Media. Se o número total de células é mais de 1 milhão, placa todas as células de 75cm frasco com 15 mL de HESC Media.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultura de células em uma 5% CO2 incubadora a 37 ° C por um período mínimo de 6 h para assegurar a aderência de célula apropriada e alterar os meios de comunicação para mídia HESC.</li>
	<li>Cultura a HESC isolado numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C por um período de 3-5 dias até que as células formam uma monocamada alcançar confluência de 80-90% em um balão chapeado.</li>
	<li>Alterar HESC Media em dois dias.<ol>
<li>Mídia de HESC quente em banho-maria 37 ° C por 15-20 min.</li>
		<li>Aspirar a mídia do recipiente e adicionar fresco HESC Media no balão (volume de trabalho: 8 mL ou 16 mL por frasco de 25 cm ou 75 cm respectivamente).</li>
		<li>Colocar o balão volta para 5% CO2 incubadora a 37 ° C, até alcançar a confluência de 80-90%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez HESC se tornar confluente de 80-90%, as células de transferência de 25 cm para balão de 75 cm ou de um balão de 75 cm para três frascos de 75 cm. Nota: HESC pode ser congelado e armazenado para uso posterior neste momento para experiências futuras.</li>
</ol>4. congelamento e descongelamento HESCs
<ol><li>Mídia de balão de 75 cm, Aspire e adicionar 2 mL de EDTA-tripsina.</li>
	<li>Incube numa incubadora 5% CO2 para 2-3 min a 37 ° C até que as células desalojar do recipiente.</li>
	<li>Adicione 7 mL de mídia HESC e misture bem por pipetagem, frente e verso.</li>
	<li>Centrifugar a 800 x g, durante 2,5 min e aspirar o sobrenadante.</li>
	<li>Etiqueta congelamento tubos com linha celular, data e número de passagem.</li>
	<li>Ressuspender o centrifugado em 5 mL de congelamento de mídia.</li>
	<li>Alíquotas de 1ml da HESC re-suspenso a cada tubo e transferência tubos de freezer-80 ° C.</li>
	<li>Transferi os tubos para nitrogênio líquido dentro de 24 horas. Nota: Se pretende descongelar células no futuro imediato, armazene células congeladas em-80 ° C durante um mês.</li>
	<li>Para descongelar os HESCs pré-aquecer HESC Media por 20 min.</li>
	<li>Adicione 8 mL de pré-aquecido HESC Media 25cm balão.</li>
	<li>Recuperar o tubo congelante do tanque de nitrogênio líquido ou -80 ° C e mergulhe o tubo em banho de água a 37 ° C durante 1-2 minutos descongelar as células.</li>
	<li>Transferir HESC descongelado para um balão de 25 cm com HESC mídia e incubá-los numa incubadora 5% CO2 durante a noite a 37 ° C.</li>
	<li>No dia seguinte, mudar a mídia HESC e esperar 2-3 dias até HESC se tornar confluente e transferir células para balão de 75 cm, conforme detalhado abaixo no protocolo 5.<ol>
<li>Mídia de HESC quente em banho-maria 37 ° C por 15-20 min.</li>
		<li>Aspirar a mídia do recipiente e adicionar fresco HESC Media no balão (volume de trabalho: 8 mL ou 16 mL por frasco de 25 cm ou 75 cm respectivamente).</li>
		<li>Colocar o balão volta para 5% CO2 incubadora a 37 ° C, até alcançar a confluência de 80-90%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cultivo de células do estroma Endometrial humanas (HESC)
Nota: Este procedimento de Culturing é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.
<ol><li>Pré-aquece o HESC Media a 37 ° C em banho-maria por 20-30 min.</li>
	<li>Aspirar a mídia do recipiente e adicionar o ácido de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) do tripsina 0,25% (1 mL para o frasco de 25 cm ou 2 mL para o frasco de 75 cm).</li>
	<li>Incube em uma 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2-3 min até desalojar as células.</li>
	<li>Bata levemente as paredes de balão para desalojar as células restantes. Adicione 7 mL de mídia HESC e misture bem por pipetagem, frente e verso.</li>
	<li>Pipetar a mistura de células em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL e centrifugar 800 x g por 2,5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em Media HESC.<ol>
<li>Adicione 15 mL para o frasco de 25 cm ou 45mL para o frasco de 75 cm (15 mL cada).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 5 mL ou 15 mL de suspensão de células para cada balão de 25 cm ou 75 cm, respectivamente.</li>
	<li>Cultura a HESC isolado numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C por um período de 3-5 dias até que as células formam uma monocamada alcançar confluência de 80-90% em um balão chapeado.</li>
	<li>Alterar HESC Media em dois dias.<ol>
<li>Mídia de HESC quente em banho-maria 37 ° C por 15-20 min.</li>
		<li>Aspirar a mídia do recipiente e adicionar fresco HESC Media no balão (volume de trabalho: 8 mL ou 16 mL por frasco de 25 cm ou 75 cm respectivamente).</li>
		<li>Colocar o balão volta para 5% CO2 incubadora a 37 ° C, até alcançar a confluência de 80-90%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. humano chapeamento de célula (HESC) do estroma Endometrial e siRNA Transfection
Nota: Este procedimento de transfeccao é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.
<ol><li>Aspire HESC Media de balão de 75 cm e adicionar 2 mL de solução de EDTA-tripsina 0,25%.</li>
	<li>Incube em 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2-3 min até desalojar as células.</li>
	<li>Uma vez que as células são desalojadas do recipiente, adicionar 7 mL de mídia HESC e misture suavemente pipetando para diante e reversa 5 vezes.</li>
	<li>Pipetar a mistura de células em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL e centrifugar 800 x g por 2,5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 mL de HESC Media. Nota: Se chapear pilhas de mais de um balão, simplesmente aumente o volume de mídia HESC.</li>
	<li>Contar as células usando um Hemocytometer.<ol>
<li>Alíquota de 10 µ l de células re-suspensas em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 10 µ l de 0,4% azul Trypan manchar a célula alíquota e misturar pipetando para frente e reversa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placa de 0,8 x 105 células por poço em placas 6-boas. Depois de dois dias, as células devem ser 60-70% de confluencia para transfeccao ideal.</li>
	<li>Para cada amostra de transfeccao siRNA, prepare complexos usando siRNA (60 nanomoles) de reagente de transfeccao.</li>
	<li>Diluir 5 µ l de reagente de Transfeccao de 150 µ l de meios livres de soro reduzida e incubar durante 5 min.</li>
	<li>Diluir 60 nanomoles de siRNA em 100 µ l de meios livres de soro reduzida e incubar durante 5 min.</li>
	<li>Após 5 minutos, combinar siRNA diluído com solução de reagente de transfeccao diluídos e misture suavemente pipetando para a frente e reverter 5 vezes. Nota: Se transfecting um ou mais siRNA em vários poços, mestre mix em 10 mL prepare tubos de poliestireno.</li>
	<li>Incube a complexos de reagente de transfeccao siRNA por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Durante esta incubação, adicione 1 mL de meios de comunicação de mudança a cada poço.</li>
	<li>Depois de 5 min. de incubação, centrifuga tubos a 500 x g por 2 min coletar a solução e adicionar a 250 µ l de complexos de reagente de transfeccao siRNA a bem, contendo células e mídia.</li>
	<li>Misture suavemente agite e incube as celulas a 37° C numa incubadora 5% CO2 por 5 h.</li>
	<li>Após 5h, mude os meios de comunicação de mídia HESC.</li>
	<li>Incube as células a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 2 dias em preparação para um ensaio de decidualization em vitro .</li>
</ol>7. ensaio de Decidualization in Vitro
Nota: Este ensaio é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.
<ol><li>Preparar a mídia EPC antes de iniciar o tratamento decidualization em vitro , conforme descrito em Camden et al 3 (ver 1.6).</li>
	<li>Aspire a mídia da hora post-48 transfectada linha de HESC incubada da etapa 6.16.</li>
	<li>Adicione 2 mL de EPC Media em cada poço. Nota: como um controle, deixar um conjunto de células não tratado com Media de EPC. Em vez disso, adicione 2 mL de mídia HESC para os poços de controle.</li>
	<li>Incube as celulas em 5% CO2 incubadora a 37 ° C por 6 dias.<ol>
<li>Altere a mídia de EPC em 48 horas.<ol>
<li>Aquecer e preparar a mídia de EPC em banho maria a 37 ° C por 15-20 min.</li>
			<li>Aspirar a mídia do poço e adicionar mídia fresco do EPC.</li>
			<li>Coloque a placa de volta para a 5% CO2 incubadora a 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após o sexto dia, analise o grau de decidualization de células do estroma através de ELISA e qRT-PCR (conforme descrito abaixo).</li>
</ol>8. validação de Decidualization In Vitro utilizando PCR em tempo Real quantitativo (qRT-PCR)
Nota: qRT-PCR é completada conforme descrito em Kommagani et al.10.
<ol><li>Isole o RNA total de HESC utilizando o protocolo de um kit de isolamento de RNA comercialmente disponível.<ol>
<li>Analise a quantidade de RNA e pureza (um260/A280) usando um NanoDrop ou metodologia similar, conforme descrito em Garcia-Elias et al.15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sintetiza o cDNA de 1 µ g de RNA total através de um protocolo do kit de transcrição reversa comercialmente disponível.</li>
	<li>Execute uma reação de qRT-PCR, conforme descrito em um protocolo do kit de qRT-PCR comercialmente disponível.<ol>
<li>Gene específico testes junto com controles do sistema interno (18s, PRLe IGFBP1) e realizar a reação usando uma mistura de mestre de PCR em tempo real disponível comercialmente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. validação de Decidualization In Vitro utilizando ELISA
<ol><li>Quantificar os níveis de prolactina secretados dos meios de cultura de tecidos utilizando um kit de prolactina ELISA comercialmente disponível.</li>
</ol>10. validação de Decidualization In Vitro utilizando faloidina coloração.
<ol><li>Introduza cada poço de uma placa bem 12 lamínulas estéreis.</li>
	<li>Repita as etapas de 6.1-6.5.</li>
	<li>Placa de 0,8 x 105 células por poço de um prato bem 12.</li>
	<li>Incube as celulas em 5% CO2 incubadora a 37 ° C por 2 dias.</li>
	<li>Aspire os meios de comunicação.</li>
	<li>Repita as etapas 7.3-7.4.</li>
	<li>Consertar as células em paraformaldeído 4% (PFA) em solução salina tamponada fosfato (PBS) à temperatura ambiente por 30 min.</li>
	<li>Aspirar a solução de fixação e lavar 3 vezes com 1 mL de PBS durante 5 min cada.</li>
	<li>Adicione 0,1% de éter de fenil tensoativo não-iônico polietilenoglicol tert-octil em PBS por 5 min para as células fixas para aumentar a permeabilidade.</li>
	<li>Lavar 3 vezes com 1 mL de PBS durante 5 min cada.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de solução faloidina por lamela e incubar a temperatura ambiente por 90 min.<ol>
<li>Prepare a diluição de 1: 100 em PBS de usar uma solução estoque faloidina em 1 unidade por 5 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar 3 vezes com 1 mL de PBS durante 5 min cada.</li>
	<li>Monte as lâminas com meio de montagem contendo 4' 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).</li>
	<li>Observe as células utilizando um microscópio confocal.</li>
</ol>

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<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+endometritis+modifies+decidualization+in+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16(2017).</li>
<li>Garcia-Elias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+quantification+methods+and+optimizing+protocols+for+microarray+hybridization+of+circulating+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs.</a> Scientific Reports. 7, 7725(2017).</li>
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</ol>

Este trabalho é apoiado por financiamento de institutos nacionais de saúde (NIH) / Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano (FORMULADORES) grant (R00 HD080742) e start-up Washington University School of Medicine fundos para R.K. Gostaríamos de agradecer a clínica de fertilidade de Universidade de Washington para fornecer as amostras de biópsia endometrial.

O ciclo menstrual reprodutivo feminino é caracterizado por um aumento nos níveis de progesterona durante a fase lútea, induzindo assim a decidualization de ESC em redondo, epitelial, como as células secretoras de3,8. A iniciação de decidualization é dependente de espécies. Em humanos, decidualization ocorre espontaneamente sobre o aumento da concentração de progesterona, enquanto ratos requerem blastocisto presença10,<sup class=...

Entre os estágios da menarca e menopausa, as mulheres em idade reprodutiva sofrem ciclos mensais de proliferação endometrial hormônio-regulada, diferenciação e subsequente derramamento em preparação para a gravidez em um processo conhecido como menstruação1 ,2. Tais modificações físicas do endométrio humano são necessárias para a implantação do embrião adequado para a parede uterina1. Alterações do endométrio, incluindo adaptações morfológicas e bioquímicas, são mediadas por todo o ciclo menstrual através de hormônios esteroides ovarianos estrógeno e progesterona (P4)3,4,5. No âmbito da fase proliferativa (ou folicular), os níveis de estrogênio preovulatory aumento, iniciando o espessamento do endométrio. Após a ovulação, a fase secretora (ou lútea) promove um aumento significativo nas concentrações de P4, induzindo a transformação morfológica das células do estroma endometriais (ESC) da aparência de fibroblasto arredondados, células epiteliais-decidual em um processo conhecido como decidualization4,6. Decidualization impróprio foi estabelecida como das causas para o fracasso do implante e posterior início embrião aborto espontâneo de4,de7,8. Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes decidualization é vantajoso para o diagnóstico e o tratamento de perda de gravidez precoce.
Atualmente, várias metodologias são utilizadas para explorar os efeitos subjacentes de decidualization em células do estroma endometriais. In vivo, o útero de rato pode ser induzida artificialmente para decidualization através de estimulação mecânica (i.e.,coçar) ou injeção em um útero hormonalmente condicionadas9de óleo. Distintos dos humanos, esta estimulação sintética promove a diferenciação do lúmen uterino, fornecendo a aparência da presença de blastocisto, um passo que é necessário para a iniciação de decidualization em roedores10,11. Nesse sentido, devido as complicações translacionais associadas com modelos animais e os dilemas éticos que cercam na vivo com base em estudos em seres humanos, modelos de decidualization com base são estudados com mais êxito in vitro.
Neste estudo, os sujeitos são recrutados através da colocação de anúncios em dois jornais locais, inglês e espanhol. Indivíduos identificados como candidatos adequados para este estudo são trazidos para se reunir com o coordenador da pesquisa, em que uma divulgação completa dos riscos potenciais são discutidos. Após a confirmação de uma compreensão completa dos riscos potenciais envolvidos, consentimento dos sujeitos é atingido nas formas verbais e escritas. Consentimento do sujeito inclui permissão para (1) submetido a armazenagem (2) a longo prazo de flebotomia de seus tecidos para fins de pesquisa futura e (3) concordar com a criação de culturas primárias de amostras de tecido coletadas. Após consentimento, indivíduos recebem um formulário para preencher no qual auto-identificação permitida de raça/etnia e/ou o direito de não-divulgação. Uma visita subsequente é programada para atingir a biópsia de endométrio com base no ciclo menstrual do sujeito. Voluntários recrutados para este estudo, refletem a demografia étnica e racial da região metropolitana de St. Louis, como documentado pelo censo de 2012 e que não envolvem a participação de qualquer população vulnerável, incluindo mulheres grávidas, fetos, embriões, crianças menores de 18 anos de idade, ou de outros grupos vulneráveis. Requisitos de elegibilidade para participação na coleção de amostra de biópsia incluem (1) estar entre as idades de 18-45 anos (2) ter ciclos menstruais regulares (25-32 dias) (3) não ter nenhuma gravidez atual ou uso de dispositivo intra-uterino hormonal/contraceptivos por 30 dias antes da inscrição (4) sem qualquer infecção vaginal atual ou doenças sexualmente transmissíveis (5) tendo nenhum atuais tratamentos com antibióticos e (6) não tendo nenhum atual de Papanicolau anormais.
Dentro deste estudo, células do estroma endometriais humanas (HESC) são cultivadas e induzidas artificialmente a submeter-se decidualization em vitro através da suplementação de hormônios (estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona (MPA) e adenosina cíclica monofosfato (cAMP)) ao meio. Neste método, o grau de decidualization é alterado com base no número total de dias de tratamento hormonal. Em conjunto com o rearranjo do citoesqueleto, suplementação hormonal induz adaptações bioquímicas em que as células decidual experimentam de qualidades secretoras2,4. A expressão de genes de marca, tais como a prolactina (PRL) e proteína fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGFBP1), pode ser utilizada para confirmar e quantificar o grau de HESC decidualization5,12, 13 , 14. importante, a viabilidade do presente protocolo realizar knockdown específicos do gene também é demonstrada.

<table><tbody><tr><td>Opti-MEM I (1X) Meio de Soro Reduzido</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Para meios de decidualização</td></tr><tr><td>DMEM / F12 (1:1) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Mancha Azul de Tripano (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Para contagem de células</td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183018A</td><td>Para Isolamento/Purificação de RNA</td></tr><tr><td>TaqMan 2X Universal PCR Master Mix</td><td>Kit</td><td></td> de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade 4304437 <td></td></tr><tr><td></td><td>Applied Biosystems</td><td>4374967</td><td></td></tr> Controle <tr><td>endógeno eucariótico de 18S rRNA</td><td>Life Technologies</td><td>4319413E</td><td>para controle interno de qPCR</td></tr><tr><td>Ensaio de expressão gênica de TaqMan Sonda de prolactina</td><td>4331182</td><td>aplicada de biossistemas</td><td>para controle interno de qPCR</td></tr><tr><td>Expressão gênica de TaqMan A ponta de prova IGFBP1 do ensaio</td><td>aplicou 4331182 de Biosystems</td><td></td><td>para o reagente</td></tr> interno de <tr><td>Phalloidin-iFluor 488 do controle qPCR - CytoPainter</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>Prolactina humana ELISA Kit</td><td>Invitrogen</td><td>EHIAPRL</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>Fixador</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>ProLong Gold reagente antidesbotamento com DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Para montagem</td></tr><tr><td>de 0,25% de tripsina-EDTA (1X)</td> <td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Carvão vegetal despojado Soro fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F6765-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (7,5%)</td> <td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque MAIS</td> colagenase <td>científica 45001749</td><td></td>de <td>Fisher</td> do reagente</tr><tr><td>do histolyticum de Clostridium</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease mim do pâncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Medroxyprogesterone 17-acetato</td><td>Sigma</td><td>M1629-1G</td><td>para o meio Sigma</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>de Estradiol da MPEE1024-1G</td><td>para mídia EPC</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A6885-100MG</td><td>para mídia EPC</td></tr><tr><td>Tesoura de ponto reto fino</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Ensaio de expressão gênica NCOA2 Sonda</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351372</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal, inativado por calor</td><td>Gibco</td><td>10-082-147</td><td></td></tr><tr><td>Thermo antibiótico</td><td> Científico</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada</td><td>Corning</td><td>21-021-cv</td><td></td></tr><tr><td>50 mL polipropileno cônico Tubo Falcon</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Placa de Petri de vidro</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de célula de 40 mícrons</td><td>Midsci</td><td>229481</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 Banho-maria</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS-215</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga LSE&nbsp;</td><td>Corning</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>SiRNA NCOA2 Humano&nbsp;</td><td>Dharmacon</td><td>L-020159-00</td><td>Sonda qPCR específica</td></tr><tr><td>do gene Incubadora de CO2 i160 de ciclo</td> sanguíneo<td>Thermo Scientific</td><td>51030301</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Para quantificação de RNA</td></tr><tr><td>Tamponado com Fosfato Salino&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50146771</td><td></td></tr><tr><td>75 cm Canted Neck Cell Culture Flask</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>6 poços Non-Pyrogenic Cell Culture Plate</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Controller Ultra</td><td>Corning</td><td>4099</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>19.0.1.334</td><td></td></tr><tr><td>25 cm Canted Neck Cell Culture Flask</td><td>Corning</td><td>7200876</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>15 mL cônico polipropileno Falcon tubo</td><td>Corning</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td></td><td>Capota de</td> Segurança Biológica BD 302995 <td></td></tr><tr><td>1300 Série A2</td><td>Thermo Scientific</td><td>1377</td><td></td></tr><tr><td>accuspin Centrífuga Micro17</td><td>Fisher Scientific</td><td>13100675</td><td></td></tr><tr><td>7500 Fast sistema de PCR em tempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>3052632</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Microscópio de imunofluorescência</td><td>Life Technologies</td><td>01414-155G-291</td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscópio de luz invertida</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Illrustrator</td><td>Adobe</td><td>22.0.1.253</td><td></td></tr><tr><td>Planilhas Excel</td><td>Microsoft</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaser 18 mm óculos de cobertura</td><td>NeuVitro</td><td>GG-18</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Hemacitômetro de Linha Brilhante</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Fisher Bioreagentes</td><td>BP176-100</td><td>Para tampão de lise de RNA</td></tr><tr><td>1.2mL Frasco de Polipropileno Criogênico com Rosca Externa</td><td>Corning</td><td>430658</td><td>Para congelar células HESC&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650-100mL</td><td>para meios de congelamento</td></tr></tbody></table>

isolamento de células do estroma endometrial humanas para in vitro decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

A diferenciação das células do estroma endometriais humanas (HESC) da aparência de um fibroblasto em secretora decidua é uma transformação necessária para a implantação do embrião no revestimento do útero do ventre materno. Decidualization impróprio foi estabelecida como das causas para a falha de implantação e subsequente aborto precoce do embrião. Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes decidualization é vantajoso melhorar a taxa de nascimentos bem sucedidos. In vivo com base em estudos de decidualization artificial estão limitando muitas vezes devido a dilemas éticos associadas à investigação humana, bem como complicações translacionais em modelos animais. Como resultado, em vitro ensaios através de cultura de células primárias são frequentemente utilizados para explorar a modulação de decidualization através de hormônios. Este estudo fornece um protocolo detalhado para o isolamento de HESC e subsequente decidualization artificial através da suplementação de hormônios para o meio de cultivo. Ainda mais, este estudo fornece um método bem projetado para nocaute qualquer gene de interesse utilizando transfections de siRNA baseadas em lipídios. Este protocolo permite a otimização da pureza da cultura, bem como rendimento de produto, maximizando assim a capacidade de utilizar este modelo como um método confiável para compreender os mecanismos moleculares subjacentes à decidualization e a posterior quantificação dos agentes secretados pelas células do estroma endometriais decidualized.

Decidualization em cultura HESC
Após isolamento, células do estroma endometriais humanas foram cultivadas a uma formação de monocamada com confluência de 80-90% e induzido para decidualization em vitro , tratando com 10 nM E2, 1 µM MPA e acampamento de 50 µM (EPC). Mudanças morfológicas associadas em vitro decidualization foram visualizadas na figura 1A. Sobre deci...

Este estudo apresenta um processo otimizado e validado para o isolamento e a cultura de células do estroma endometriais humanas para realizar o ensaio de decidualization em vitro . Além disso, este estudo fornece um método detalhado para eficientemente "knockdown" um gene específico usando siRNAs em células do estroma endometriais humanas.

Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Este método pode ser usado para responder a perguntas-chave no campo da medicina reprodutiva sobre os mecanismos moleculares subjacentes da decidualização e a compreensão dos papéis de genes específicos na decidualização das células estromais endometriais. Este estudo fornece um protocolo detalhado para o isolamento de células estromais endometriais humanas e subsequente decidualização artificial pela suplementação de hormônios ao meio de cultura. A expressão de alterações hormonais, como prolactina e proteína ligadora ao fator de crescimento semelhante à insulina, pode ser utilizada para confirmar e quantificar o grau de decidualização.É importante ressaltar que a viabilidade deste protocolo para conduzir knockdown específico do gene também é demonstrada. Transferir a biópsia com pinça esterilizada para um tubo de 50 mililitros contendo dez mililitros de HBSF fresco, seguido de centrifugação a 500x G por 90 segundos. Usando uma pipeta de um mL, remova o meio e adicione três mL de meio de isolamento hES pré-aquecido.Transvase a biópsia em um prato de 10 centímetros contendo cinco mL de meio de isolamento hES e comece a picar usando uma pinça Dumont 5 e uma tesoura de ponto reto fino por cerca de 20 minutos. Usando uma pipeta de mL, transfira a biópsia picada para um novo tubo de 50 mL e adicione mais sete mL de meio de isolamento hES ao prato, para transferir os pedaços restantes para o tubo de 50 mL. Em seguida, centrifugue a amostra por dois minutos a 800x G e remova o sobrenadante usando uma pipeta de um mL.Em seguida, filtre a mistura de digestão de DNase-1 e colagenase através de um filtro de 0,2 mícron conectado a uma seringa de 10 mililitros diretamente no pellet. Em seguida, vórtice o tubo por 10 segundos para ressuspender o pellet e incubar por 90 minutos em banho-maria. A cada 10 minutos, faça um vórtice no tubo por 10 segundos para garantir que o tecido seja digerido adequadamente.Após a incubação, filtre a suspensão através de um filtro de células de 40 mícrons empilhado sobre um novo tubo de 50 mililitros para recuperar as células estromais e, em seguida, centrifugue as células coletadas a 800x G por 2,5 minutos. Após a centrifugação, remova suavemente o sobrenadante usando uma pipeta de um mililitro, certificando-se de não perturbar o pellet celular. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio de isolamento de hES fresco, seguido de centrifugação a 800x G por 2,5 minutos.Após a centrifugação, aspire o sobrenadante cuidadosamente e ressuspenda as células em seis mililitros de meio hES fresco. Em seguida, para remover as células sanguíneas, coloque lentamente as células ressuspensas em três mililitros de meio de gradiente de densidade e centrifugue a amostra a 400x G por 30 minutos. Após centrifugação, recolher o sobrenadante sem perturbar o meio de gradiente de densidade.Em seguida, adicione o meio hES para fazer o volume total de até 10 mililitros e centrifugue a amostra novamente a 800x G por 2,5 minutos. Após centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em seis mililitros de meio hES. Em seguida, coloque as células em um frasco de 75 centímetros, adicionando seis mililitros da ressuspensão da célula e 10 mililitros de meio hES ao frasco, seguido de uma mistura suave através do balanço do frasco.Após o revestimento, verifique a densidade celular ao microscópio e, em seguida, cultive as células em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono por três a cinco dias, certificando-se de trocar o meio hES a cada dois dias. Após 48 horas, as células devem crescer como uma monocamada. Geralmente, após cinco dias, as células atingem 80 a 90% de confluência em um frasco de 75 centímetros.Para a transfecção de siRNA, comece com o plaqueamento de 800.000 células por poço em uma placa de seis poços em triplicados para cada condição e incube as células em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono por dois dias para se preparar para a transfecção. Após dois dias, adicione 150 microlitros de meio livre de soro Opti-MEM em um tubo de cinco mL, seguido pela adição de cinco microlitros de reagente de transfecção. Misture bem por inversão e incube por cinco minutos.Em seguida, adicione 100 microlitros de meio livre de soro Opti-MEM em um novo tubo de cinco mL, seguido pela adição de 16 nanomoles de siRNA SRC-2. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio livre de soro Opti-MEM em um tubo de cinco mL, seguido pela adição de 16 nanomoles de siRNA de controle. Após a incubação, combine o reagente de transfecção diluído com o siRNA SRC-2 e misture bem pipetando para frente e para trás.Em seguida, combine o reagente de transfecção diluído com o siRNA de controle e misture bem pipetando para frente e para trás. Em seguida, incube os complexos por cinco minutos. Durante esta incubação, aspire o meio hES e adicione um mililitro de meio de troca a cada poço.Após cinco minutos de incubação, centrifugar os complexos a 500x G durante dois minutos para recolher a solução. Em seguida, adicione 250 microlitros dos complexos de reagentes de transfecção de siRNA a cada poço contendo células e meios e misture por balanço suave, seguido de incubação em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% por cinco horas a 37 graus Celsius. Após cinco horas, aspirar o meio e mudar para o meio hES e continuar a incubação por dois dias em preparação para um ensaio de decidualização in vitro.Após a transfecção de 48 horas e antes de iniciar o ensaio de decidualização in vitro, colete as células transfectadas de siRNA de controle e siRNA SRC-2 do dia zero. Primeiro, aspire o meio e lave com um mL de PBS por poço. Em seguida, remova o PBS e adicione 300 microlitros de tampão de lise de RNA por poço e incube por três minutos.Após três minutos de incubação, recolher as células em tampão de lise de ARN para um tubo de 1,5 ml para posterior análise a jusante. Em seguida, prepare o meio EPC alíquota do volume apropriado de meio de decidualização e adicione 10 estradiol nanomolar, um acetato de medroxiprogesterona micromolar e 50 monofosfato de adenosina cíclico micromolar em um tubo de 50 mililitros. Para os poços restantes do sexto dia, adicione dois mililitros de meio EPC em cada poço e incube as células em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por seis dias, trocando o meio EPC a cada 48 horas.Após o sexto dia, colete o siRNA de controle do dia seis e os pellets de células transfectadas de siRNA SRC-2 do dia seis em tampão de lise de RNA para análise a jusante usando PCR em tempo real. A indução da decidualização pelo acetato de medroxiprogesterona estrogênica e monofosfato de adenosina cíclico resulta no rearranjo do citoesqueleto das células estromais de células fibroblásticas alongadas para células epitelioides arredondadas. A coloração com faloidina de células estromais endometriais revela ainda mais a reorganização do citoesqueleto da fibra ativa característica da decidualização de hES.Nas hES tratadas com veículo, as células permanecem fibroblásticas na aparência, enquanto nas células tratadas com EPC, as hES pareciam epitelióides. Para confirmar a eficácia do ensaio de decidualização in vitro, os níveis de transcrição de mRNA dos marcadores de decidualização prolactina e proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina-1 foram avaliados durante um período de 6 dias. Após a decidualização das células estromais endometriais humanas, os níveis de prolactina e IGFBP1 aumentaram de forma dependente do tempo.O aumento dependente do tempo dos níveis de prolactina secretada também foi confirmado pelo exame dos meios de cultura de tecidos hES via método ELISA. Os efeitos do knockdown específico do gene nas alterações celulares e moleculares da decidualização de células estromais endometriais humanas foram avaliados no sexto dia de cultura após a transfecção de siRNA de 48 horas, com controle ou co-ativador do receptor de esteróide 2 siRNA. O hES transfectado com siRNA de controle demonstrou alterações celulares e moleculares, consistentes com a decidualização adequada, incluindo uma mudança morfológica de paralelepípedos e aumento dos níveis de transcrição dos marcadores de decidualização PRL e IGFBP1.No knockdown de siRNA SRC-2, hES permaneceu fibroblástico na aparência em comparação com o hES transfectado com siRNA de controle e mostrou níveis de transcritos PRL e IGFBP1 significativamente diminuídos. Os níveis de transcritos SRC-2 foram significativamente diminuídos em hES transfectados com siRNA SRC-2 quando comparados ao siRNA controle, indicando a viabilidade deste método para silenciamento gênico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células estromais primárias de biópsias endometriais para fins de decidualização in vitro e derrubar um gene específico de interesse usando transfecção de siRNA.

isolation-human-endometrial-stromal-cells-for-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Estabelecimento de sistemas de cultura primária de células do estroma endometrial a partir de espécimes de histerectomia é uma técnica biológica valioso e um passo crucial antes de prosseguir uma vasta gama de pesquisa objetiva. Aqui, descrevemos dois métodos utilizados para estabelecer culturas de tecidos do estroma endometriais ressecados cirurgicamente de pacientes humanos.

Dois métodos para estabelecer células endometriais Humano estromais primários de espécimes de histerectomia

Este estudo apresenta um método padronizado e validado para o isolamento e cultura de rato primária do estroma do endométrio e pelas células epiteliais, o que pode ser utilizado num sistema de co-cultura para estudo em decidualização vitro.

Isolamento de rato Endometrial epiteliais e estromais para células<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Este protocolo demonstra um método para o isolamento de células de decidual humanas primários coletados de membranas fetais de placentas de termo que podem ser usadas para uma variedade de aplicações (ou seja, imunocitoquímica, citometria de fluxo, etc.) com o objetivo para estudar o papel das populações de células diferentes em complicações na gravidez.

Isolamento de células humanas primárias do Decidual de membranas fetais de termo placentas

Este protocolo descreve metodologias para estabelecer organoides epiteliais endometriais de camundongos para expressão gênica e análises histológicas.

Estabelecendo organoides endometriais 3D do útero do rato

O protocolo mostra um novo modelo experimental in vitro que pode recapitular a biologia de dois tipos de linhagens celulares aderentes com um andaime impresso em tridimensional (3D). A construção deste modelo e os procedimentos operacionais, desde a preparação e cultura celular até a análise e avaliação, são descritos.

Modelo de co-cultura usando dois tipos de linhagens celulares aderentes

A heterogeneidade transcricional dentro das células estromais derivadas do tecido adiposo humano pode ser definida no nível de célula única usando marcadores de superfície celular e genes osteogênicos.  Descrevemos um protocolo que utiliza citometria de fluxo para o isolamento de subpopulações celulares com potencial osteogênico aumentado, que pode ser usado para melhorar a reconstrução esquelética craniofacial.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Descreve-se aqui métodos para a dissecação de tecidos fetais e maternas de placenta humana, seguido por isolamento e expansão de células estaminais mesenquimais / estroma (MSC) a partir desses tecidos.

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

As células estromais derivadas do tecido adiposo podem ser úteis para a engenharia de novos tecidos a partir das próprias células do paciente. Apresentamos um protocolo para o isolamento de uma subpopulação de células estromais derivadas do tecido adiposo humano (ASCs) com potencial osteogênico aumentado, seguido da aplicação das células em um ensaio de cicatrização calvarial in vivo.

Isolamento rápido de BMPR-IB + adiposo-derivados de células estromais para uso em um Defeito Modelo Cura calota craniana

Aqui, apresentam-se um protocolo para a dissecção de cordão umbilical humano (UC) e a amostra da placenta fetal em cordão de revestimento (CL), geleia de Wharton (WJ), junção de cabo-placenta (CPJ), e na placenta fetal (FP) para o isolamento e caracterização de células estromais mesenquimais (MSCs), utilizando a técnica de cultura de explante.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando proteína morfogênica óssea 4 e inibidores das vias Activina/Nodal. Este método é adequado para a diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas e pode gerar grandes quantidades de células para manipulação genética.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

Aprenda a isolar células do estroma endometrial humanas e induzir decidualização in vitro com suplementação hormonal. Este protocolo demonstra também o silenciamento gênico por siRNA para estudar mecanismos moleculares na biologia reprodutiva.

Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization

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