Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization

Este método pode ser usado para responder a perguntas-chave no campo da medicina reprodutiva sobre os mecanismos moleculares subjacentes da decidualização e a compreensão dos papéis de genes específicos na decidualização das células estromais endometriais. Este estudo fornece um protocolo detalhado para o isolamento de células estromais endometriais humanas e subsequente decidualização artificial pela suplementação de hormônios ao meio de cultura. A expressão de alterações hormonais, como prolactina e proteína ligadora ao fator de crescimento semelhante à insulina, pode ser utilizada para confirmar e quantificar o grau de decidualização.

É importante ressaltar que a viabilidade deste protocolo para conduzir knockdown específico do gene também é demonstrada. Transferir a biópsia com pinça esterilizada para um tubo de 50 mililitros contendo dez mililitros de HBSF fresco, seguido de centrifugação a 500x G por 90 segundos. Usando uma pipeta de um mL, remova o meio e adicione três mL de meio de isolamento hES pré-aquecido.

Transvase a biópsia em um prato de 10 centímetros contendo cinco mL de meio de isolamento hES e comece a picar usando uma pinça Dumont 5 e uma tesoura de ponto reto fino por cerca de 20 minutos. Usando uma pipeta de mL, transfira a biópsia picada para um novo tubo de 50 mL e adicione mais sete mL de meio de isolamento hES ao prato, para transferir os pedaços restantes para o tubo de 50 mL. Em seguida, centrifugue a amostra por dois minutos a 800x G e remova o sobrenadante usando uma pipeta de um mL.

Em seguida, filtre a mistura de digestão de DNase-1 e colagenase através de um filtro de 0,2 mícron conectado a uma seringa de 10 mililitros diretamente no pellet. Em seguida, vórtice o tubo por 10 segundos para ressuspender o pellet e incubar por 90 minutos em banho-maria. A cada 10 minutos, faça um vórtice no tubo por 10 segundos para garantir que o tecido seja digerido adequadamente.

Após a incubação, filtre a suspensão através de um filtro de células de 40 mícrons empilhado sobre um novo tubo de 50 mililitros para recuperar as células estromais e, em seguida, centrifugue as células coletadas a 800x G por 2,5 minutos. Após a centrifugação, remova suavemente o sobrenadante usando uma pipeta de um mililitro, certificando-se de não perturbar o pellet celular. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio de isolamento de hES fresco, seguido de centrifugação a 800x G por 2,5 minutos.

Após a centrifugação, aspire o sobrenadante cuidadosamente e ressuspenda as células em seis mililitros de meio hES fresco. Em seguida, para remover as células sanguíneas, coloque lentamente as células ressuspensas em três mililitros de meio de gradiente de densidade e centrifugue a amostra a 400x G por 30 minutos. Após centrifugação, recolher o sobrenadante sem perturbar o meio de gradiente de densidade.

Em seguida, adicione o meio hES para fazer o volume total de até 10 mililitros e centrifugue a amostra novamente a 800x G por 2,5 minutos. Após centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em seis mililitros de meio hES. Em seguida, coloque as células em um frasco de 75 centímetros, adicionando seis mililitros da ressuspensão da célula e 10 mililitros de meio hES ao frasco, seguido de uma mistura suave através do balanço do frasco.

Após o revestimento, verifique a densidade celular ao microscópio e, em seguida, cultive as células em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono por três a cinco dias, certificando-se de trocar o meio hES a cada dois dias. Após 48 horas, as células devem crescer como uma monocamada. Geralmente, após cinco dias, as células atingem 80 a 90% de confluência em um frasco de 75 centímetros.

Para a transfecção de siRNA, comece com o plaqueamento de 800.000 células por poço em uma placa de seis poços em triplicados para cada condição e incube as células em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono por dois dias para se preparar para a transfecção. Após dois dias, adicione 150 microlitros de meio livre de soro Opti-MEM em um tubo de cinco mL, seguido pela adição de cinco microlitros de reagente de transfecção. Misture bem por inversão e incube por cinco minutos.

Em seguida, adicione 100 microlitros de meio livre de soro Opti-MEM em um novo tubo de cinco mL, seguido pela adição de 16 nanomoles de siRNA SRC-2. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio livre de soro Opti-MEM em um tubo de cinco mL, seguido pela adição de 16 nanomoles de siRNA de controle. Após a incubação, combine o reagente de transfecção diluído com o siRNA SRC-2 e misture bem pipetando para frente e para trás.

Em seguida, combine o reagente de transfecção diluído com o siRNA de controle e misture bem pipetando para frente e para trás. Em seguida, incube os complexos por cinco minutos. Durante esta incubação, aspire o meio hES e adicione um mililitro de meio de troca a cada poço.

Após cinco minutos de incubação, centrifugar os complexos a 500x G durante dois minutos para recolher a solução. Em seguida, adicione 250 microlitros dos complexos de reagentes de transfecção de siRNA a cada poço contendo células e meios e misture por balanço suave, seguido de incubação em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% por cinco horas a 37 graus Celsius. Após cinco horas, aspirar o meio e mudar para o meio hES e continuar a incubação por dois dias em preparação para um ensaio de decidualização in vitro.

Após a transfecção de 48 horas e antes de iniciar o ensaio de decidualização in vitro, colete as células transfectadas de siRNA de controle e siRNA SRC-2 do dia zero. Primeiro, aspire o meio e lave com um mL de PBS por poço. Em seguida, remova o PBS e adicione 300 microlitros de tampão de lise de RNA por poço e incube por três minutos.

Após três minutos de incubação, recolher as células em tampão de lise de ARN para um tubo de 1,5 ml para posterior análise a jusante. Em seguida, prepare o meio EPC alíquota do volume apropriado de meio de decidualização e adicione 10 estradiol nanomolar, um acetato de medroxiprogesterona micromolar e 50 monofosfato de adenosina cíclico micromolar em um tubo de 50 mililitros. Para os poços restantes do sexto dia, adicione dois mililitros de meio EPC em cada poço e incube as células em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por seis dias, trocando o meio EPC a cada 48 horas.

Após o sexto dia, colete o siRNA de controle do dia seis e os pellets de células transfectadas de siRNA SRC-2 do dia seis em tampão de lise de RNA para análise a jusante usando PCR em tempo real. A indução da decidualização pelo acetato de medroxiprogesterona estrogênica e monofosfato de adenosina cíclico resulta no rearranjo do citoesqueleto das células estromais de células fibroblásticas alongadas para células epitelioides arredondadas. A coloração com faloidina de células estromais endometriais revela ainda mais a reorganização do citoesqueleto da fibra ativa característica da decidualização de hES.

Nas hES tratadas com veículo, as células permanecem fibroblásticas na aparência, enquanto nas células tratadas com EPC, as hES pareciam epitelióides. Para confirmar a eficácia do ensaio de decidualização in vitro, os níveis de transcrição de mRNA dos marcadores de decidualização prolactina e proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina-1 foram avaliados durante um período de 6 dias. Após a decidualização das células estromais endometriais humanas, os níveis de prolactina e IGFBP1 aumentaram de forma dependente do tempo.

O aumento dependente do tempo dos níveis de prolactina secretada também foi confirmado pelo exame dos meios de cultura de tecidos hES via método ELISA. Os efeitos do knockdown específico do gene nas alterações celulares e moleculares da decidualização de células estromais endometriais humanas foram avaliados no sexto dia de cultura após a transfecção de siRNA de 48 horas, com controle ou co-ativador do receptor de esteróide 2 siRNA. O hES transfectado com siRNA de controle demonstrou alterações celulares e moleculares, consistentes com a decidualização adequada, incluindo uma mudança morfológica de paralelepípedos e aumento dos níveis de transcrição dos marcadores de decidualização PRL e IGFBP1.

No knockdown de siRNA SRC-2, hES permaneceu fibroblástico na aparência em comparação com o hES transfectado com siRNA de controle e mostrou níveis de transcritos PRL e IGFBP1 significativamente diminuídos. Os níveis de transcritos SRC-2 foram significativamente diminuídos em hES transfectados com siRNA SRC-2 quando comparados ao siRNA controle, indicando a viabilidade deste método para silenciamento gênico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células estromais primárias de biópsias endometriais para fins de decidualização in vitro e derrubar um gene específico de interesse usando transfecção de siRNA.