Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

O objetivo geral desta técnica é fornecer um método para o perfil simultâneo das frações de células imunes e cancerígenas que contribuem para o microambiente imunológico de tumores sólidos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da oncologia imunológica, como quais alterações seriais imunes e não imunes ocorrem dentro do tumor após um determinado tratamento. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita o enriquecimento efetivo dos componentes imunes e não imunes do tumor, permitindo um perfil completo do estado imunológico do tumor.

O objetivo geral deste método é traçar um perfil eficiente do microambiente imunológico do tumor e identificar as alterações induzidas pelo tratamento. Depois de pulverizar o camundongo com etanol 70% para evitar a contaminação do cabelo, remova cirurgicamente os tumores subcutâneos, cuidando para que os tumores estejam livres de qualquer tecido contaminante. Em seguida, coloque cada tumor em 1,8 mililitros de meio RPMI 1640 básico sem soro fetal bovino em poços individuais de uma placa de 24 poços no gelo.

Quando todos os tumores tiverem sido coletados, use uma tesoura para cortar as amostras em pedaços de menos de um milímetro cúbico e adicione 200 microlitros de coquetel de dissociação 10X recém-preparado contendo colagenase-1, colagenase-4 e DNase um em cada poço. Após uma hora a 37 graus Celsius, em um agitador de placa orbital a 60 a 100 RPM, neutralize a reação com um mililitro de meio RPMI 1640 suplementado com 5% FBS e dois EDTA milimolar e use uma ponta de pipeta modificada de um mililitro para transferir cada amostra de pasta tumoral para tubos cônicos individuais de 50 mililitros cobertos com filtros individuais de 40 micrômetros. Usando um êmbolo de seringa de 10 mililitros, desagregue mecanicamente os pedaços do tumor através dos filtros, enxaguando periodicamente cada filtro com dois mililitros de meio RPMI 1640 mais 5% FBS até que os filtros estejam livres do tumor.

Quando todos os tumores tiverem sido dissociados, adicione meio a cada tubo conforme necessário para trazer todas as amostras até o mesmo volume e peletizar as células por centrifugação. Em seguida, use uma pipeta sorológica de cinco mililitros para ressuspender os pellets em dois mililitros de meio suplementado com FBS por tubo. Para separar as frações de células imunes e tumorais, adicione três mililitros de meio de gradiente de densidade ao fundo de um tubo cônico de 15 mililitros por amostra e coloque lentamente dois mililitros de suspensão de células tumorais na lateral de cada tubo em cada gradiente.

Tome cuidado para garantir que as suspensões de células tumorais sejam bem misturadas antes da estratificação, que as suspensões de células sejam pipetas lentamente pela lateral dos tubos e que os tubos sejam manuseados com cuidado para evitar a mistura das camadas. Separe as células por centrifugação com gradiente de densidade e colete cuidadosamente o meio superior e as camadas leucocitárias infiltrantes do tumor em um novo tubo de 15 mililitros por amostra. Descarte o meio de gradiente de densidade restante e ressuspenda os pellets tumorais em dois mililitros de meio mais FBS por tubo.

Em seguida, centrifugue todas as amostras e ressuspenda os leucócitos infiltrantes do tumor em 200 microlitros e as células tumorais em dois mililitros de meio mais FBS por tubo em gelo. Para plaquear as células, rotule uma placa de fundo em U de 96 poços para cada painel de coloração imunológica mais uma placa adicional para contagem de células e aliquota as suspensões de células únicas em cada uma das placas do painel de coloração e na placa de cálculo. Lave as células duas vezes com 200 microlitros de PBS de Dulbecco por amostra e bloqueie as células com 50 microlitros de bloco FC por poço por 20 minutos a quatro graus Celsius.

No final da incubação de bloqueio, adicione 50 microlitros de anticorpo de direcionamento extracelular concentrado 2X e mistura de coloração de viabilidade fixável a cada poço para uma incubação de 30 minutos no escuro. Ao final da incubação de coloração, lave as amostras duas vezes com tampão FACS e ressuspenda os pellets em 200 microlitros de solução de fixação e permeabilização durante a noite a quatro graus Celsius, protegidos da luz. No dia seguinte, coletar as células por centrifugação, seguida de uma lavagem com 200 microlitros de tampão de permeabilização por poço.

Rotule as células com 100 microlitros de painel de coloração de anticorpos intracelulares em tampão de permeabilização por uma incubação de 30 minutos no escuro, seguida de outra lavagem do tampão de permeabilização. Em seguida, lave as células novamente com tampão FACS e ressuspenda as amostras em 300 microlitros de tampão FACS fresco para sua análise por citometria de fluxo. A digestão tumoral, conforme demonstrado, com ou sem enriquecimento do meio gradiente de densidade, resulta em uma população de células tumorais inteiras viável de aproximadamente 70 a 90%, avaliada por citometria de fluxo.

O enriquecimento do meio de gradiente de densidade promove um aumento maior que duas vezes na fração leucocitária infiltrante do tumor CD45 positivo, em comparação com digestões tumorais não enriquecidas, bem como vários subconjuntos de células imunes comumente observados em estudos de microambiente imunológico. A fração de células tumorais CD45 negativas também pode ser perfilada para várias características tumorais, como viabilidade geral do tumor ou apoptose, capacidade de proliferação e expressão de vários marcadores imunossupressores. Para determinar como os subconjuntos imunológicos de mielóides e linfócitos variam em um único tumor sólido, o tumor pode ser dividido em quatro partes iguais de forma que cada seção contenha regiões intratumorais aproximadamente iguais, bem como porções dérmicas e peritoneais iguais.

Cada pedaço pode então ser digerido separadamente e analisado, conforme demonstrado, quanto à presença de várias populações de células imunológicas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em quatro a 8 horas, dependendo de quantas amostras você possui. Ao tentar este procedimento, é importante trabalhar de forma rápida, mas eficiente, para preservar a viabilidade celular.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de dissociação e separação envolvem técnicas difíceis de aprender apenas com texto escrito. Após este procedimento, a citometria de fluxo pode ser realizada para responder a perguntas adicionais sobre como as populações celulares mudam dentro de um tumor, tanto em termos de abundância quanto de fenótipo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como separar e analisar os componentes imunológicos e não imunes de um tumor murino subcutâneo estabelecido usando as técnicas demonstradas de digestão e separação por gradiente de densidade.