Name: Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a enriquecer e caracterizar as frações imune e não imune do microambiente tumoral em tumores subcutâneos murinos estabelecidos. Esta técnica permite o perfilamento simultâneo das populações celulares para estudos em oncologia imunológica.

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JMN reconhece o apoio financeiro do Instituto Nacional de General Medical Ciências (T32GM088129) e do Instituto Nacional de Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) ambos os institutos nacionais de saúde. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde. Este projeto também foi apoiado pela citometria e núcleo de classificação de célula no Baylor College of Medicine com financiamento do NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 e S10 RR024574) e a assistência especializada de Joel M. Sederstrom.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) do Baylor College of Medicine e institucional Cuidado Animal.
1. digestão e colheita tumor
Nota: O tempo necessário para a colheita é ~ 3-5 min/tumor e o tempo necessário para o processamento é ~ 1 h + 2-3 min/tumor.
<ol><li>Eutanásia em ratos por inalação de dióxido de carbono e uma mangueirada cada rato com etanol a 70% antes da colheita para evitar a contaminação de cabelo. Cirurgicamente remover tumores subcutâneos de ratos e certifique-se de que os tumores são livres de qualquer contaminante tecido (i.e., cabelo, pele, peritônio, etc.). Coloque cada tumor em 1,8 mL de base RPMI-1640 mídia sem soro fetal bovino (FBS) em uma placa de 24. Para maiores colheitas, manter placas frias no gelo para preservar a viabilidade celular. Nota: Se esterilidade é necessária, todas as dissecções de tumor precisará ser realizada em uma armário com instrumentos cirúrgicos estéreis (i.e., tesouras, pinças, etc.), bem como quaisquer outras medidas de biossegurança. Tumores com o maior diâmetro entre 0,5 - 1 cm são ideais, e tumores de maiores ou menores exigirá dimensionamento dos reagentes.</li>
	<li>Use uma tesoura para cortar os tumores em menos de 1 mm3 peças dentro de cada poço.</li>
	<li>Preparar um cocktail de digestão de 10x dissolvendo colagenase que 10mg/mL, IV de colagenase em 2.500 U/mL e DNase eu a 200 U/mL em base meios de RPMI-1640 (sem FBS). Nota: A digestão cocktail pode ser preparada um dia de antecedência e armazenada a-20 ° C; no entanto, um armazenamento prolongado não é recomendado como enzimas vão perder atividade ao longo do tempo uma vez dissolvido.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de 10 x dissociação cocktail contendo colagenase I, IV colagenase e DNase I para cada poço com pedaços de3 a 1 mm.</li>
	<li>Permitir que as amostras digerir durante 1 h a 37 ° C, agitando levemente 60-100 RPM usando um agitador orbital de placa. Nota: A elevação da temperatura a 37 ° C durante a digestão enzimática pode causar ativação de células imunes.</li>
	<li>Depois de 1 h, neutralize a reação adicionando 1 mL de RPMI-1640 mídia suplementada com 5% FBS e 2 mM de EDTA para cada poço.</li>
	<li>Pipete a digestão do tumor e o restante do tumor em um coador de célula de 40 µm sentado em cima de um tubo de centrífuga de 50 mL. Nota: Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1 mL para fácil transferência de digestão do tumor para o filtro.</li>
	<li>Use um êmbolo de seringa de 10 mL para desagregar mecanicamente as peças do tumor através do filtro. Periodicamente, lave o filtro com 2 mL de completados mídia RPMI-1640 (contendo 5% FBS) e repita até que o filtro célula está livre de tumor. Nota: Cerca de 4-10 mL de mídia total deve ser suficiente para enxaguar adequadamente o coador de tumor. Nota: Colocar as amostras no gelo, até que essa etapa for concluída para todas as amostras preservar a viabilidade celular.</li>
	<li>Ajuste cada tubo de centrífuga de 50 mL para o mesmo volume utilizando o meio RPMI 1640 completado. Nota: O ajuste do volume é essencial para balanceamento de centrífuga. Pular esta etapa pode resultar em lesões pessoais ou danos de centrífuga.</li>
	<li>Centrifugar as suspensões celulares (5 min, 805 x g, 4 ° C), descartar os sobrenadantes e ressuspender em 2 mL de completados mídia RPMI-1640. Nota: Um agregado de células pode formar a centrifugação que é difícil Ressuspender a seguir. Use uma pipeta sorológica 5ml e misture rapidamente para quebrá-lo antes de prosseguir.</li>
</ol>2. separação de frações celulares imunológico e Tumor
Nota: O tempo necessário para esta etapa é de cerca de 1 h.
<ol><li>Adicione 3 mL de meio de gradiente de densidade para o fundo de um tubo de centrífuga de 15 mL. Preparar e rotular suficiente tubos para cada tumor.</li>
	<li>A 2 mL de suspensão de células de tumor em cima do meio de gradiente de densidade da camada pipetando lentamente para baixo do lado do tubo para evitar a mistura das duas camadas.</li>
	<li>Cuidadosamente coloque os tubos em camadas no centrifugador e rotação por 20 min a 805 x g, 20 ° C, com o sem freio. Nota: É extremamente importante verificar o correcto balanceamento e certifique-se de que o freio não é usado durante a centrifugação. Qualquer interrupção deste processo resultará em camada de mistura e a recuperação completa de amostras será difícil.</li>
	<li>Transferi com cuidado o tumor infiltração leucocitária (TIL) camada e a camada superior de mídia para um novo tubo de 15 mL com uma pipeta de transferência. Descartar todos os restantes médio de gradiente de densidade e ressuspender o tumor na parte inferior do tubo em 2 mL de RPMI-1640 completados. Nota: Após a centrifugação haverá quatro camadas visíveis de cima para baixo, que correspondem respectivamente a: mídia, TILs, médio gradiente de densidade e aglomerados de células do tumor. Consulte a Figura 2A para a exemplo das várias camadas.</li>
	<li>Centrifugar os dois o TIL e amostras de tumor em separam os tubos (5 min, 805 x g, 4 ° C) e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda amostra TIL em 200 µ l e a pelota de tumor em 2 mL de completados mídia RPMI-1640. Manter-se no gelo para preservar a viabilidade.</li>
</ol>3. chapeamento e coloração
Nota: O tempo necessário para o chapeamento é 30 s/tumor; o tempo necessário para a coloração da superfície é de 1 h; o tempo necessário para coloracao intracelular é 40 min; o tempo necessário para análise de citometria de fluxo é 1 - 4 min/tumor.
<ol><li>Prepare-se e conta com placa de rótulo um U-fundo de 96 poços para cada imunológico coloração painel e uma placa adicional para celular. Nota: Normalmente, três pratos são preparados no total: uma placa do painel de linfócitos com foco, uma placa de painel mieloide focada e uma placa de contagem de células.</li>
	<li>Alíquota as suspensões de célula única em cada um da coloração do painel placas e um volume definido na placa de contagem. Nota: A placa de contagem é usada para calcular o número total de células adicionado para cada painel de coloração, permitindo assim que a contagem de população de células precisos. Um citômetro de fluxo com capacidades de amostragem e de análise volumétrica de placa de 96 poços pode fornecer o número de células por µ l em cada amostra e portanto, calcular o número de células adicionado para cada painel de coloração. Placas de contagem podem ser adquiridas no dia seguinte após a fixação durante a noite a 4 ° C, enxágue com buffer de FACs (tampão fosfato salino (PBS), com 2% FBS) e resuspending em um volume definido de buffer de FACs.</li>
	<li>Lave as células duas vezes com 200 µ l de solução salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS) por amostra por centrifugação (5 min, 805 x g, 4 ° C) e descartar o sobrenadante entre cada enxágue para remover qualquer enciclopédia FBS.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l do bloco Fc, misturar as amostras usando uma pipeta multicanal e incube por 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de 2x concentrado anticorpo direcionamento extracelular e viabilidade fixável mancha mistura, misture com uma pipeta multicanal e incube por 30 min no escuro no RT ou 4 ° C. Nota: As condições exatas de coloração para o anticorpo dependem as instruções do fabricante. Todas as diluições de coloração devem ser em DPBS, com nenhum FBS adicionado para evitar a saturação do corante viabilidade fixável. Por favor, veja a Tabela de materiais e equipamentos para as diluições ideais do painel coloração usada neste manuscrito. Anticorpo e viabilidade fixável solução de coloração é preparado em uma concentração de 2 x para fornecer um final 1 x manchando a concentração de 100 µ l de volume total de coloração quando adicionado ao bloco de Fc.</li>
	<li>Lave as amostras duas vezes com tampão de FACs por centrifugação (5 min, 805 x g, 4 ° C) e descartando os sobrenadantes entre cada lavagem.</li>
	<li>Resuspenda em 200 µ l de solução de fixação/permeabilização de 1x e incubar durante uma noite a 4 ° C, protegido da luz. Nota: O experimento pode ser pausado a noite neste ponto: manter as amostras em 4 ° C, protegido da luz.</li>
	<li>No dia seguinte, Centrifugar as placas (5 min, 805 x g, 4 ° C) e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Lave uma vez com 200 µ l de tampão de permeabilização, centrifugador (5 min, 805 x g, 4 ° C), 1x e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de 1 x concentrado anticorpo intracelular coloração painel preparado em tampão de permeabilização de 1x e incube por 30 min no escuro no RT ou 4 ° C (isso depende de coloração as recomendações do fabricante).</li>
	<li>Lave uma vez com permeabilização 1x tampão (5 min, 805 x g, 4 ° C), desprezar o sobrenadante e lavar uma segunda vez com buffer de FACs (PBS com 2% FBS).</li>
	<li>Resuspenda as amostras em 300 µ l de tampão de FACs (PBS com 2% FBS), transferir as amostras para tubos de citometria de fluxo e executar análise de citometria de fluxo.</li>
</ol>

<ol><li>Fouad, Y. A., Aanei, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5446472/">Revisiting the hallmarks of cancer.</a> American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).</li>
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<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyTOF+supports+efficient+detection+of+immune+cell+subsets+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples.</a> Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O tempo é composto de moléculas e componentes celulares diversos e complexos. Recentes sugerem que a caracterização exata deste ambiente pode fornecer um melhor entendimento do tratamento de sucesso ou fracasso e pode até mesmo ajudar a identificar os mecanismos de resistência terapêutica. Por exemplo, aumentando os níveis de intratumoral de várias células imunossupressoras (i.e., MDSCs, pilhas de T reguladoras, etc.) pode atenuar efetoras imune respostas e abrogar efeitos imunoterapia. Por outro lado, ...

O tempo supressivo recentemente tem sido reconhecido como uma marca registrada de câncer e é conhecido por desempenhar um papel significativo no desenvolvimento e progressão, proteção de cânceres de tumor sólido, bem como atenuar sua susceptibilidade à imunoterapia1. O tempo é composto por vários subconjuntos celulares e fenótipos, os quais fornecem a introspecção crítica do estado imunológico do tumor. Estes subconjuntos imunológicos podem ser ainda mais estratificados em células de origem mieloide, ou linfócitos, que juntos constituem a maioria das respostas de imune inata e adaptativa2,3. Recentes avanços no campo da imunoterapia têm demonstrado que as estratégias de imunoterapia (i.e., inibidores da barreira imune, receptor de antígeno quimérico células-T, etc.) têm o potencial para induzir câncer durável regressões; no entanto, eles permanecem relativamente ineficazes em tumores sólidos cancros4,5. Numerosos grupos mostraram o obstáculo crítico que o tempo pode jogar no tratamento sucesso6,7, e ainda assim, há uma necessidade de avaliar com precisão novas imunoterapias no cenário pré-clínico enfocando especificamente seus capacidade de modular ou superar o tempo8.
Os esforços atuais para caracterizar o tempo normalmente utilizam ou microscopia ou fluem cytometry juntamente com anticorpo rotulagem estratégias para identificar subconjuntos de celulares imunes e suas características9,10. Estas duas estratégias fornecem informações excepcionalmente diferentes, como microscopia permite valorização espacial de subconjuntos de celulares e citometria de fluxo fornece alto rendimento e quantificação mais ampla de mudanças celulares. Apesar das recentes melhorias no multiplex fluorescente imuno-histoquímica otimizando sistemas de imagem espectrais, que agora podem suportar até 7 parâmetros, tamanho limitado do painel torna nível mais amplo imune de perfil difícil e, portanto, esta técnica é frequentemente reservados para mais focada análises. Como resultado, citometria de fluxo permanece um do mais amplamente utilizado imunológico técnicas de criação de perfil. Apesar de seu uso generalizado na caracterização do tempo, os métodos utilizados para processamento e coloração são bastante variável. Mais frequentemente protocolos utilizam um tumor dissociando enzima (ou seja, colagenases, DNase, etc.) e métodos de dissociação manual para atingir as suspensões de célula única, seguido por anticorpo manchando e análise7. Apesar dos benefícios de cada método, numerosos grupos mostraram a extensa variabilidade que pode ser induzida através destas técnicas11. Isto faz comparações de estudo transversal de tumor microambiente perfil extremamente difícil, mesmo quando avaliar o mesmo modelo de tumor murino. Além disso, esses métodos fornecem um potencial limitado para avaliar tumor celular e imunológico tumor infiltrar componentes independente, desde que ambos os componentes são intercalados após a digestão. Quantidade de amostra então limita multi-painel manchando e análise, que se torna um grande problema ao tentar caracterizar subconjuntos imunológicos raros (i.e., tumor-específicas células T)12. Técnicas mais recentes como citometria de massa ou citometria por hora de voo (CyTOF), permitem alta dimensão análise fenotípica de subconjuntos de celulares com alguns sistemas de apoio a projetos de painel superior a 42 parâmetros independente13. Apesar do enorme poder da CyTOF tecnologia em perfil imune, continua a ser limitada devido a despesa, conhecimentos de análise e o acesso ao equipamento. Além disso, muitos protocolos de CyTOF recomendam purificação de subconjuntos imunes para melhorar a relação sinal-ruído14, e, assim, sugerimos que o nosso método de enriquecimento poderia ser usado a montante da análise CyTOF para melhorar a qualidade dos dados.
Neste documento descrevemos uma digestão de microambiente do tumor e análise método que incorpora imune tumor infiltrar na separação. A finalidade desse método é permitir que independente da elevado-produção de perfil do infiltrado imune tumor e frações celulares do tumor para caracterização mais ampla do microambiente do tumor. Usando esse método, demonstramos ainda mais a importância da realização de análises de todo tumor, como um modelo de tumor sólido subcutânea foi encontrado para ter significativa heterogeneidade espacial de imunológica. Em geral, esse método pode com mais precisão e de forma consistente comparar entre amostras porque enriquece para subconjuntos celulares imunes dentro do tumor e permite a caracterização independente das células do tumor e imunes frações de um tumor.

<table><tbody><tr><td>Camundongos machos C57BL/6 de 6 a 12 semanas de idade</td><td>Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Camundongos usados em nossos estudos de tumor</td></tr><tr><td>MEER Linha de Células Cancerígenas Murinas</td><td>Adquiridas de colaboradores&nbsp;</td><td>N/A</td><td>E6/E7 Antígeno do HPV expressando linha celular de câncer epitelial tonsilar murino&nbsp;</td></tr><tr><td>Álcool isopropílico 70%&nbsp;</td><td>EMD Milipore&nbsp;</td><td>PX1840</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ferramentas cirúrgicas murinas</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td>Principalmente só precisa de tesouras, pinças e um bisturi.&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços&nbsp;</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>T1024</td><td>Ou qualquer placa de fundo plano de 24 poços.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I&nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>234153</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Agitador Orbital de Baixa Velocidade</td><td>BioExpress (fornecedor: Genemate)&nbsp;</td><td>S-3200-LS</td><td>Ou qualquer agitador orbital.&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubadora termorreguladora</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-255-27</td><td>Ou qualquer outra incubadora termorregulada</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>E177</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipeta e pontas</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-032</td><td>Ou qualquer outra pipeta e pontas</td></tr><tr><td>40 um Filtros de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga de 50 mL</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 mL</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Luer-Lok de 10 mL sem agulhas</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep Gradiente de Densidade Médio</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P7212</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo em U de 96 poços</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td>Conjunto de Tampão de Coloração do Fator de Transcrição <td>FoxP3 D8573</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-5523-00</td><td>Tampão de Fixação/Permeabilização e Tampão de Permeabilização</td></tr><tr><td>Centrífuga Termoregulada</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Citômetro de Fluxo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Para contagem volumétrica de células de 96 poços&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-rato purificado CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)&nbsp; Clone 2.4G2&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>553141</td><td>Fc Block</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de Coloração de Células Mortas Azuis Fixável, para excitação UV</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34962</td><td>Mancha de viabilidade fixável</td></tr><tr><td>CD45 Anticorpo Monoclonal (30-F11), APC-eFluor 780</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>47-0451-80</td><td></td></tr><tr><td>TCR beta Anticorpo Monoclonal (H57-597), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8-&alfa; Anticorpo (KT15), PE</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53473&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal CD4 (GK1.5), PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>MHC Classe II (I-A/I-E) Anticorpo Monoclonal (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>56-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal CD11c (N418), PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Anticorpo Monoclonal (BM8), eFluor 450</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48-4801-80</td><td></td></tr><tr><td>CD11b Anticorpo monoclonal (M1/70), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G (Gr-1) Anticorpo monoclonal (RB6-8C5), PE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>CD274 (PD-L1, B7-H1) Anticorpo monoclonal (MIH5), PE-Cyanine7</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25-5982-80</td><td></td></tr><tr><td>CD273 (B7-DC) Anticorpo monoclonal (122), PerCP-eFluor 710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9972-82</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Anticorpo monoclonal (B56), BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563755</td><td></td></tr></tbody></table>

enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

O microambiente imune tumor (tempo), recentemente, tem sido reconhecida como um mediador crítico da resposta do tratamento em tumores sólidos, especialmente para imunoterapias. Recentes avanços clínicos em imunoterapia destacam a necessidade de métodos pode ser reproduzidos com precisão e completamente caracterizar o tumor e seu associado infiltrado imune. Digestão enzimática do tumor e análise do fluxo cytometric permitam ampla caracterização dos vários subconjuntos de células imunes e fenótipos; no entanto, profundidade de análise muitas vezes é limitada pela fluoróforo restrições no projeto do painel e a necessidade de adquirir amostras de tumor grande observar raras populações imunes de interesse. Assim, nós desenvolvemos um método eficaz e alta taxa de transferência para separar e enriquecendo o infiltrado imune tumor dos componentes não imune tumor. A digestão de tumor descrito e separação centrífuga baseado em densidade técnica permite separada caracterização do tumor e tumor infiltrar imune fracções e preserva a viabilidade celular e assim, fornece uma ampla caracterização do tumor estado imunológico. Este método foi usado para caracterizar extensa espacial imune heterogeneidade em tumores sólidos, que demonstra ainda mais a necessidade de técnicas de perfil imunológica de tumor todo consistente. Em geral, esse método proporciona uma técnica eficaz e adaptável para a caracterização imunológica do subcutâneos tumores sólidos de murino; como tal, esta ferramenta pode ser usada para melhor caracterizar as características imunológicas tumorais e na avaliação pré-clínica de novas estratégias de imunoterapia.

Nossos resultados demonstram o benefício significativo de TIL separação de componentes de tumor não imune, conforme explicado no protocolo. Além disso, usando o método descrito Demonstramos a heterogeneidade imunológica significativa de tumores sólidos estabelecidos.
Um problema significativo com muitas técnicas de dissociação de tumor é a perda da viabilidade da amostra, geralmente como resultado de condições de digestão dura (...

Aqui nós descrevemos um método para separar e enriquecer os componentes do microambiente de imune e não imune a tumor em tumores subcutâneos estabelecidas. Esta técnica permite a análise separada de infiltrar imune tumor e frações não imune tumor que podem permitir a caracterização abrangente do microambiente imune do tumor.

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

O objetivo geral desta técnica é fornecer um método para o perfil simultâneo das frações de células imunes e cancerígenas que contribuem para o microambiente imunológico de tumores sólidos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da oncologia imunológica, como quais alterações seriais imunes e não imunes ocorrem dentro do tumor após um determinado tratamento. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita o enriquecimento efetivo dos componentes imunes e não imunes do tumor, permitindo um perfil completo do estado imunológico do tumor.O objetivo geral deste método é traçar um perfil eficiente do microambiente imunológico do tumor e identificar as alterações induzidas pelo tratamento. Depois de pulverizar o camundongo com etanol 70% para evitar a contaminação do cabelo, remova cirurgicamente os tumores subcutâneos, cuidando para que os tumores estejam livres de qualquer tecido contaminante. Em seguida, coloque cada tumor em 1,8 mililitros de meio RPMI 1640 básico sem soro fetal bovino em poços individuais de uma placa de 24 poços no gelo.Quando todos os tumores tiverem sido coletados, use uma tesoura para cortar as amostras em pedaços de menos de um mi

enrichment-characterization-tumor-immune-non-immune-microenvironments

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo para o isolamento de populações altamente purificados de leucócitos que infiltram tumores. Este protocolo é adaptado a partir do Biotech Miltenyi protocolo para aumentar o rendimento e grau de pureza para o isolamento de células a partir de tecido de tumor complexo.

Isolamento de células imunes de tumores primários

Este vídeo ilustra o teste de terapia adjuvante ou adicional em um modelo de camundongo com tumores subcutâneos ressecados de forma incompleta. O camundongo parcialmente ressecado pelo tumor é tratado com um anticorpo direcionado à proteína anticitotóxica das células T reguladoras, reduzindo potencialmente o crescimento do tumor e sugerindo terapia adjuvante eficaz.

Uma terapia adjuvante em um modelo de camundongo com um tumor subcutâneo ressecado incompletamente

Este protocolo descreve um método para a avaliação detalhada de subconjuntos de leucócitos dentro do microambiente tumoral em um modelo de tumor de camundongo. Células de melanoma B16 que expressam chemerina foram implantadas por via subcutânea em camundongos singênicos. As células do microambiente tumoral foram então coradas e analisadas por citometria de fluxo, permitindo análises detalhadas de subconjuntos de leucócitos.

Avaliação do tumor infiltrantes Leucócitos Subconjuntos em um modelo de tumor subcutâneo

Adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável para mimetizar o microambiente tumoral (TME). O modelo consiste em uma cultura de células mistas, permite a geração simplificada de populações de células individuais altamente enriquecidas sem o uso de marcação fluorescente ou classificação de células e permite estudar a comunicação intercelular dentro do TME em condições normais ou de estresse.

A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação

Aqui nós apresentamos um método reprodutível para desenvolver um modelo murino ortotópico de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas. Tumores demonstram clinicamente relevantes características histopatológicas da doença, incluindo necrose, pobre diferenciação, metástases nodais e infiltração imune. Tumor-rolamento ratos desenvolvem sintomas clinicamente relevantes, incluindo disfagia, deslocamento da mandíbula e perda de peso.

Intramucosal inoculação de células de Carcinoma de células escamosas em ratos para perfil imune de Tumor e tratamento avaliação de resposta

Este protocolo descreve a geração cirúrgica de tumores pancreatic ortotópicos e a digestão rápida de tumores pancreatic recentemente isolados do murine. Após a digestão, populações de células imunes viáveis podem ser usadas para análise a jusante, incluindo a estimulação ex vivo das células T para detecção intracelular de citocina por citometria de fluxo.

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

Aqui, apresentamos um protocolo de transplante de tumor para a caracterização de linfócitos derivados de tumores inerentes ao tumor e periferia em um modelo de tumor de camundongos. O rastreamento específico do influxo de células imunes derivadas do receptor com citometria de fluxo revela a dinâmica das alterações fenotípicas e funcionais dessas células durante as respostas imunológicas antitumorais.

Transplante de tumor para avaliar a dinâmica das células CD8+ T que se infiltram em tumores em camundongos

Um protocolo padrão é descrito para estudar a atividade antitumoral e a toxicidade associada da IL-1α em um modelo singênico de camundongo de HNSCC.

Avaliação da Atividade Antitumoral In vivo de Nanopartículas de Polianidrido IL-1α

O protocolo apresenta um modelo de imunoterapia contra o câncer utilizando a vacinação tumoral baseada em células com melanoma B16-F10 expressando Flt3L. Este protocolo demonstra os procedimentos, incluindo a preparação de células tumorais cultivadas, implantação tumoral, irradiação celular, medição do crescimento tumoral, isolamento de células imunes intratumorais e análise de citometria de fluxo.

Modelo Experimental de Imunoterapia para Melanoma utilizando Vacinação Tumoral com Citocina Hematopoiética

Este protocolo descreve a geração de camundongos do sistema imunológico humano (HIS) para estudos de imuno-oncologia. Instruções e considerações sobre o uso deste modelo para testes de imunoterápicos humanos em tumores humanos implantados neste modelo são apresentadas com ênfase na caracterização da resposta do sistema imune humano ao tumor.

Testando imunoterápicos contra o câncer em um modelo humanizado de camundongo com tumores humanos

Com o crescente interesse na imunoterapia intratumoral, a seleção de modelos tumorais acessíveis e práticos é essencial. Tumores subcutâneos são fáceis de estabelecer, mas difíceis de visualizar e manipular. Neste protocolo, descrevemos métodos para gerar tumores intradérmicos que proporcionam melhor visibilidade e acessibilidade.

Implantação de Tumores Intradérmicos como Modelo Robusto para Estudos de Imunoterapia Intratumoral do Câncer de Múrino

Aprenda a enriquecer e caracterizar as frações imune e não imune do microambiente tumoral em tumores subcutâneos murinos estabelecidos. Esta técnica permite o perfilamento simultâneo das populações celulares para estudos em oncologia imunológica.

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

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