Supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em Cardiomyocytes induzida

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da reprogramação cardíaca, como identificar quais vias promovem ou reparam a cardiomiogênese. A principal vantagem desta técnica é que podemos gerar cardiomiócitos induzidos funcionais, com maior eficiência do que os métodos publicados anteriormente. Essas doenças cardíacas químicas resultam em perda de cardiomiócitos e comprometimento da função cardíaca.

Portanto, essa técnica pode auxiliar no alto reparo, convertendo fibroblastos em cardiomiócitos induzidos funcionais. Para iniciar a produção de retrovírus, cultive células Platinum E ou PE em meio PE. Complemente-o com marcadores de seleção em um prato de 10 cm, em um gabinete de nível de biossegurança dois.

A cada dois dias passam as células, em uma a quatro, ou uma a quinta diluição. Um dia antes da transfecção planejada, semeie as células PE em 10 ml de meio de crescimento, em uma placa de cultura de 10 cm e, em seguida, balance suavemente as placas para frente e para trás. Coloque cuidadosamente os pratos em uma incubadora, para permitir uma distribuição uniforme das células, e incube por 24 horas.

No dia da transfecção, adicione o coquetel GHMT2M a um tubo de 1,5 ML. Em seguida, adicione 360 microlitros de meio de soro reduzido a um tubo separado de 1,5 ML. Em seguida, adicione 36 microlitros de reagente de transfecção ao meio de soro reduzido e agite suavemente o tubo para misturar.

Incube em temperatura ambiente por cinco minutos. O reagente de transfecção usado nesta etapa se liga ao plástico. Para evitar a eficiência da transfecção, tome cuidado para pipetar o reagente de transfecção, diretamente no meio de soro reduzido, e evite tocar a ponta da pipeta na parede do tubo.

Em seguida, adicione a mistura de reagentes de transfecção de meio de soro reduzido ao tubo, contendo o coquetel de DNA GHMT2M. Agite suavemente o tubo para misturar e incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Por fim, adicione a mistura de reação de transfecção gota a gota às células PE.

Gire suavemente o prato por 10 a 15 segundos. Incubar as células transfectadas a 37 graus Celsius, por 16 a 20 horas. Agora cubra os pratos de 60MM com colágeno e incube a 37 graus Celsius, por no mínimo duas horas.

Em seguida, dispense fibroblastos embrionários de camundongo recém-descongelados, ou MEFs, nos pratos revestidos de colágeno. E adicione meio de crescimento em um volume final, de 4ML por prato de 60MM. Balance suavemente os pratos e coloque-os na incubadora.

Ao revestir MEFs, é importante que as células sejam revestidas uniformemente. Evite girar os pratos, isso pode causar um revestimento irregular. Em vez disso, balance suavemente o prato para frente e para trás e coloque-o cuidadosamente na incubadora.

24 horas após a transfecção das células PE, use uma seringa de 30ML para coletar o meio retroviral gerado pelas células. Passe a primeira coleta de meio retroviral através de um filtro de tamanho de 45 micrômetros, em um tubo cônico de 50ML. Em seguida, adicione 10ML de meio de crescimento fresco na parede do prato, tomando cuidado para não deslocar as células PE.

Incube as células a 37 graus Celsius por mais 24 horas. Em seguida, adicione 7,2 microlitros de 10MG por mililitro de reagente de transdução de brometo de metatrina de hexidina ao tubo cônico de 50ML contendo sobrenadante viral. Agora aspire o meio dos MEFs e adicione 4ML do meio retroviral recém-colhido ao prato.

Incubar as células a 37 graus Celsius por 24 horas. 48 horas após a transfecção das células PE, coletar o meio retroviral e realizar a transdução exatamente da mesma maneira que na primeira coleta. Descarte as células PE após a segunda coleta do meio retroviral e adicione 10% de alvejante a todos os materiais em contato com o meio retroviral.

Após a incubação, aspirar o meio retroviral dos MEFs e adicionar 4ML de meio ICM, contendo 05 micromolares, inibidores do receptor TGF Beta Tipo 1. A cada dois dias, troque o meio ICM, até novo uso. Para iniciar a imunocoloração, aspire o meio ICM do dia 14 MEFs reprogramados.

Em seguida, lave as células uma vez com 1ML de PBS 1X gelado, por poço da placa de 12 poços. Em seguida, aspire o PBS, adicione 500 microlitros de 2% de paraformaldeído para fixar as células e incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Após aspirar o paraformaldeído, lavar as células três vezes com 1ML de PBS.

Depois de aspirar o PBS, adicione 500 microlitros de. 02%Triton X 100 e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a aspiração de Triton X 100, bloqueie as células com 500 microlitros de soro de cavalo a 10%, por 30 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, aspire o soro de cavalo e adicione 500 microlitros de anticorpo primário diluído. Incube por uma hora em temperatura ambiente. Após aspirar o anticorpo primário, lave três vezes com 1ML de PBS.

Após a última lavagem de PBS, adicione 500 microlitros de anticorpo secundário diluído. Embrulhe o prato em papel alumínio e incube no escuro, por uma hora em temperatura ambiente. Por fim, aspire o anticorpo secundário e lave três vezes com 1ML de PBS.

Embrulhe a placa em papel alumínio e guarde a quatro graus Celsius até que a imagem seja feita. Este método mostra alta eficiência de conversão de MEFs em cardiomiócitos. Uma análise representativa de citometria de fluxo, adicionada ao nono dia após a transdução, mostra a expressão de troponina T cardíaca ativada em aproximadamente 70% das células.

Da mesma forma, a expressão cardíaca de alfa-actinina é observada em aproximadamente 55% das células, quando comparada ao controle de transdução de GFP. Além disso, a imunocoloração para marcadores cardíacos, realizada duas semanas após a transdução, mostra que a maioria das células expressa Troponina I, Alfa-actinina e Troponina T. A proteína de junção comunicante Cx43 também foi detectada ao longo da periferia dos ICMs. Além disso, a co-marcação de ICMs com alfa-actinina, ou troponina T e Cx43, revela formações de junções comunicantes entre células vizinhas.

A transdução de GHMT2M e o tratamento com A83O1 reprogramam uma fração de MEFs em células batedoras no oitavo dia. No dia 11, são observadas aproximadamente 10000 células batendo por centímetro quadrado. Transientes espontâneos de cálcio são detectados em cardiomiócitos batendo.

A adição de agonista beta adrenérgico isoproterenol aumenta significativamente a frequência de transientes espontâneos de cálcio. Em contraste, a sedição do bloqueador dos canais de cálcio do tipo L, nifedipina, diminui significativamente a frequência de transientes de cálcio. Depois de assistir a este vídeo, deve-se ter uma boa compreensão de como reprogramar fibroblastos em cardiomiócitos funcionais induzidos com alta eficiência.

Seguindo este protocolo, outros métodos, incluindo sequenciamento de RNA e sequenciamento de chip, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como expressão gênica global e status da cromatina, são alterados durante a reprogramação cardíaca. Não se esqueça de que trabalhar com retrovírus pode ser perigoso. Precauções, como trabalhar em um gabinete de nível dois de biossegurança, usar equipamento de proteção individual e descarte adequado de todos os resíduos retrovirais, devem sempre ser implementadas durante a execução deste protocolo.