Name: Supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em Cardiomyocytes induzida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a reprogramar fibroblastos embrionários de rato em cardiomyócitos funcionais usando fatores de transcrição e microRNAs. Este método de reprogramação cardíaca alcança até 60% de eficiência em apenas 7 dias.

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Esta pesquisa foi apoiada por fundos da Fundação Boettcher Webb-Waring biomédica pesquisa programa, americano coração Associação cientista desenvolvimento Grant (13SDG17400031), Universidade do Colorado departamento medicina pendentes do início de carreira Programa acadêmico, Universidade de Colorado divisão de Cardiologia Barlow Nyle doação e NIH R01HL133230 (para Klein). A.S.R foi apoiada pelo NIH/NCATS Colorado CTSA Grant número TL1TR001081 e uma bolsa doutorandos do consórcio Universidade do Colorado para pesquisa de fibrose & tradução (CFReT). Esta pesquisa foi apoiada também pela concessão de apoio do centro de câncer (P30CA046934), a concessão de núcleos de investigação de doenças pele (P30AR057212) e o núcleo de citometria de fluxo no Campus Anschutz-médica da Universidade do Colorado.

Todas as experiências que exigem animais foram aprovadas pelo Comitê de uso no Campus médico da UC Denver Anschutz e institucional Cuidado Animal.
1. isolamento de MEFs
<ol><li>Compra de ratos grávidas C57BL/6 no E13. Navio durante a noite.</li>
	<li>Eutanásia-a mãe de acordo com protocolos aprovados IACUC (ex: ~1.3 L/min de CO2 até animal aparece morto seguido por deslocamento cervical)</li>
	<li>Pulverizar a mãe com 70% de etanol e abrir a cavidade abdominal. Remover o corno uterino contendo embriões e coloque em um prato de 10 cm com PBS estéril.</li>
	<li>Fazer uma incisão no saco do embrião para liberar o embrião. Transferi o embrião para limpar o prato de 10 cm com PBS estéril. Enxague abundantemente.</li>
	<li>Corte o corpo abaixo do fígado e elimine a cabeça e parte superior do corpo. Remover os órgãos internos e descarte. Transferir o tecido remanescente para um prato limpo 10cm com PBS estéril e transferir a placa para um nível de biossegurança 1 ou 2 do armário. Combine os tecidos de todos os embriões em um prato limpo e seco de 10 cm e picar em pedaços bem.</li>
	<li>Adicione 6 mL de 0,25% tripsina/1 mM EDTA para embriões picados. Triture várias vezes com uma pipeta para romper o tecido. Incube durante 40 min a 37 ˚ c com 5% de CO2.</li>
	<li>Ressuspender as células em meio de crescimento (tabela 1). O volume de mídia é ajustado com base no número de embriões colhidos. Em geral, use uma proporção de aproximadamente meio de crescimento 25 mL por 1,2 embriões.</li>
	<li>Placa 25 mL de células ressuspensa em um prato de 15 cm. Após 24h, aspirar a mídia e adicionar 25 mL de meio de cultura fresco para cada placa.</li>
	<li>Depois de 72 h, adicione 2 mL de 0,25% tripsina/1 mM EDTA para cada prato de 15 cm. Quando células desanexe o prato de cultura, inativar tripsina com 15 mL de meio de crescimento e recolher pilhas em poliestireno tubos cônicos de 50 mL. Centrifugar as células para 3 min a 160 x g , à temperatura ambiente. Resuspenda o pellet de células em meio de crescimento e filtro através de um filtro de célula 70 µm poro.</li>
	<li>Contar as células usando um hemocytometer e congelar MEFs em alíquotas de 2 milhões de células em meio de congelamento (DMSO 10%, 25% FBS em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) / alta glicose) a-80 ° C. Transferência de células para nitrogênio líquido após 24h e loja até estar pronto para usar. Nota: A expressão gênica Global em MEFs foi perfilado isolado usando este protocolo por sequenciação do ARN (RNA-seq) para garantir a autenticação de célula. RNA-seq dados de células codificar MEF foram baixados do NIH Gene Expression Omnibus (GEO) com o número de adesão GSE93454. Dados da expressão do gene do RNA-seq para os MEFs usados por nós foram depositados no NIH GEO com número de adesão GSE71405. De acordo com símbolos comuns do gene, fundiram-se estes dois conjuntos de dados. Os dados de expressão foram então log-transformados e um gráfico de dispersão dos dados de expressão para nosso MEFs e ENCODE MEFs foram gerados e ajuste com uma linha de regressão linear (figura 1A). MEFs isolados usando este protocolo são molecularmente similares àqueles isolados por outros laboratórios.</li>
</ol>2. produção de retrovírus e transdução de MEFs
Nota: Todas as etapas desta seção devem ser efectuadas em um armário de 2 do nível de biossegurança. Desde que este protocolo utiliza a transdução retroviral, certifique-se que sejam tomadas precauções, incluindo tratamento de que todos os resíduos contendo mídia viral com 10% de lixívia pelo menos 20 min. consulte a figura 1B para um cronograma para reprogramação a segurança.
<ol><li>
Produção de retrovírus usando a linha de celular de platina E (PE)
	<ol>
<li>Manter disponíveis comercialmente células PE PE médio (tabela 1) contendo blasticidin e puromicina seleção marcadores para garantir a expressão de amordaçar-pol e env genes para a produção eficiente de partículas retroviral36 . Células de passagem a 1:4 ou 1:5 em dois dias. Tome cuidado para evitar a superlotação das células, pois isto pode reduzir rendimentos de produção retroviral.</li>
		<li>No dia -1, semente aproximadamente 5 x 106 células por prato de 10cm no meio de crescimento (tabela 1), 16-20 h antes do transfection (ver tabela 2 para chapeamento densidades para outros tamanhos de prato de cultura de célula padrão). Delicadamente rock pratos e para trás várias vezes e coloque cuidadosamente em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora para assegurar mesmo distribuição de chapeamento (ver Figura 1 para chapeamento ideal de densidade antes do transfection). Nota: tenha cuidado para células de PE placa no meio livre de marcadores de seleção antes de Transfeccao para garantir meio contendo partículas retrovirais geradas não mata MEFs.</li>
		<li>No dia 0, prepare DNA para transfeccao. Para transfeccao de prato 10cm, adicionar 2 µ g de cada fator reprogramação — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) — para um tubo de 1,5 mL. Nota: Consulte a tabela 2 para dimensionar a quantidade de DNA necessária para transfect outros tamanhos de prato de cultura de célula padrão.</li>
		<li>Em um tubo separado 1,5 mL, adicione 360 µ l soro reduzida mídia. Em seguida, adicione 36 reagente de transfeccao µ l diretamente para a mídia de soro reduzida. Delicadamente, agite o tubo e incubar a temperatura ambiente por 5 min. Nota: Para evitar a eficiência reduzida do transfection, adicione cuidadosamente reagente de transfeccao diretamente para a mídia de soro reduzida.</li>
		<li>Adicione mistura de reagente de transfeccao/mídia de soro e reduzida ao DNA GHMT2m cocktail. Delicadamente, agite o tubo e incubar a temperatura ambiente por 15 min. Fazer não o vórtice.</li>
		<li>Adicione a mistura de reação gota a gota para células de PE, suavemente redemoinho mídia para 10-15 s e coloque em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Nota: De acordo com o fabricante, células PE geram uma concentração média de 106 107 infecciosas unidades/ml. Este protocolo gera aproximadamente 2 x 106 infecções unidades/mL por 24 h e 6 x 106 infecções unidades/mL por 48 h para uma média de 4 "moi". Transfecção de GFP/DsRed também pode ser utilizada como um substituto para eficiência de transfeccao/transdução se desejado; eficiência de transfeccao deverá ultrapassar 90% por 48 h (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transdução de MEFs
	<ol>
<li>No dia 0, casaco pratos com colágeno e coloque em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora pelo menos 2 h.</li>
		<li>Remova MEFs de degelo e nitrogênio líquido. Placa de 0,2 x 106 células por prato de 60 mm no meio de crescimento. Delicadamente placas de pedra para garantir até mesmo a distribuição de chapeamento e colocar na incubadora (ver Figura 1 para densidade ideal do chapeamento e tabela 2 para chapeamento densidades para outros tamanhos de prato de cultura de célula padrão). Nota: Estas densidades de chapeamento foram testadas ao longo de vários lotes de MEFs isolados; a menos que a exibição de MEFs significativamente comprometida viabilidade, ajustar a célula densidades de semeadura não é necessário.</li>
		<li>No dia 1, pós-transfecção 24 h, use uma seringa de 30 mL para coletar retroviral médio gerado pelas células de PE. Passe o meio através de um filtro de tamanho de poro 0,45 µm para um tubo cónico de 50 mL. Adicione o reagente de Transfeccao de brometo de hexadimethrine para uma concentração final de 6 µ g/mL. Cuidadosamente, adicione 10 mL de meio de crescimento fresco às células de PE pela mídia pipetagem das buchas do prato cultura para evitar o deslocamento das células.</li>
		<li>Aspire o meio de MEFs e adicionar 4 mL de meio de retroviral recém-colhidas para cada prato. Retorno MEFs para a incubadora. Adicione água sanitária 10% para todos os materiais em contacto com o meio viral para neutralizar partículas retrovirais.</li>
		<li>No dia 2, pós-transfecção 48 h, repita os passos 2.2.2 e 2.2.3. Células de PE são descartadas após a coleção 2nd do meio retroviral. Nota: Adicione 10% de lixívia para células de PE descartadas pelo menos 20 min neutralizar o retrovírus indesejados.</li>
		<li>No dia 3, Aspire o meio de MEFs e reabasteça com 4 mL de meio de iCM (tabela 1) contendo 0,5 µM A-83-01 uma TGF-β tipo I inibidor do receptor. Reabastecer o iCM médio contendo A-83-01 a cada 2 dias. Nota: Se utilizar as boas práticas agrícolas como um controle de transdução, a expressão deverá ultrapassar 90% por esse ponto do tempo (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. citometria de fluxo para marcadores cardíacos
<ol><li>Aspirado médio de 9 dia reprogramado MEFs e lavagem (1x) com PBS 1x para remover detritos e células mortas.</li>
	<li>Adicione 1 mL 0,25% tripsina/EDTA por 5 min em 37 ˚ c. Verifique as células usando um microscópio de luz e agitar o prato; Se as células continuam a ser anexadas, incube mais 5min em 37 ˚ c até células desanexar.</li>
	<li>Lavam-se células em 1X PBS contendo 5% FBS e filtrar através de um filtro de célula 70 µm poro.</li>
	<li>Centrifugar a 160 x g por 3 min em temperatura ambiente e aspirar líquido da pelota. Nota: Para aumentar o rendimento da célula, deixe o líquido de cerca de 50 µ l acima o centrifugado.</li>
	<li>Lavam-se células com 500 µ l 1X PBS contendo 1% de BSA.</li>
	<li>Solução de fixação por 20 min Fix células com 0,2 mL 1 milhão de células no gelo.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de perm/lavagem gelada de 1x. Nota: A solução do fabricante é de 10x.</li>
	<li>Centrifugar as células a 160 x g por 5 min a 4 ° C e aspire o sobrenadante.</li>
	<li>Repita as etapas de 3.7 e 3.8 um tempo adicional. Após a lavagem de 2nd , prossiga diretamente para a próxima etapa ou manter células a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Bloco com 100 µ l de soro de cabra de 5% e soro de burro em 1x tampão de perm/lavagem por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de anticorpo primário diluído. Nota: Para o presente protocolo, as células foram rotuladas com mouse troponina T (1: 200) e rato α-actinin (1: 200) para quantificar a porcentagem de células positivas para componentes-chave do sarcômero cardíaco. Incube o anticorpo primário por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar as células a 160 x g durante 5 m a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e lavar 2x com tampão de perm/lavagem gelada.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de anticorpo secundário diluído. Nota: Para este protocolo, as células foram rotuladas com anti-rato 647 nm anticorpo secundário (1: 200). Incube o anticorpo secundário por 45 min à temperatura ambiente em um rotador extremidade-sobre-extremidade do tubo. Protege as células de luz envolvendo tubos em folha.</li>
	<li>Centrifugar as células a 160 x g por 5 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e lavar 2x com tampão de perm/lavagem gelada.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de 1% de BSA em PBS e executar FACS imediatamente. Nota: Gere um avanço vs lado dispersão de dispersão para portão células viáveis primeiro ao executar FACS. Alternativamente, use uma mancha comercialmente disponível ao vivo/morto célula antes da fixação de células para identificar ao vivo e morto populações de células.</li>
</ol>4. imunocoloração de MEFs reprogramadas
<ol><li>Meio, aspirado por dia 14 reprogramado MEFs e lavagem (1x) com 1 mL 1 x PBS gelado. Nota: Para imunocoloração, reprogramação foi realizada em 12 placas bem para minimizar o volume de solução de anticorpos. 24 placas bem também podem ser utilizadas; simplesmente metade de todos os volumes a seguir.</li>
	<li>Aspire e reparar células com paraformaldeído de 2% 500 µ l para 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirar e lavar as células 3 vezes com PBS 1x de 1 mL (5 min por lavagem à temperatura ambiente).</li>
	<li>Permeabilize células com 500 µ l 0,2% permeabilização reagente em PBS por 15 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire e blocos em 500 µ l soro 10% cavalo em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire e incubar com 500 µ l do anticorpo primário diluído por 1h à temperatura ambiente. Nota: Para este protocolo, células foram rotuladas com mouse troponina T ou α-actinin (cada 1: 400) e co rotuladas com Connexin 43 (1: 400) ou troponina eu (1: 400).</li>
	<li>Aspire o anticorpo primário e lavar três vezes com 1 mL 1X PBS (5 min por lavagem à temperatura ambiente).</li>
	<li>Aspire e incubar com anticorpo secundário diluído de 500 µ l por 1 hora em temperatura ambiente. Nota: Para este protocolo, as células foram rotuladas com o anti-rato 555 nm anticorpo secundário (1:800) para reconhecer a troponina T ou α-actinin e anticoelho 488 nm anticorpo secundário (1:800) reconhecer Connexin 43 ou troponina I. Além disso, núcleos foram corados com Hoechst (01:10, 000). Protege as células de luz incubando no escuro.</li>
	<li>Aspirar o anticorpo secundário e lavar três vezes com 1 mL 1X PBS (5 min por lavagem à temperatura ambiente). Enrole a placa com papel de alumínio para proteger células de luz e armazenar a 4 ° C.</li>
	<li>Imagem usando microscopia de epifluorescência de três canais.</li>
</ol>5. cálcio Imaging
Nota: Se de imagem com ampliação de 10x, pratos e pratos de cultura de célula padrão são adequados para a imagem latente de cálcio. Imaging na maior ampliação exige que células ser banhado em lamelas de vidro ou pratos de fundo de vidro.
<ol><li>Aspire médio e adicionar 2 mL (para uma 6 placa bem) modificado solução de Tyrode (140 mM de NaCl, KCl, 1.8 mM CaCl2, de 5 mM 1 mM MgCl2, glicose 10 mM, 10 mM HEPES, 0,1% BSA e 1% de piruvato, pH 7,4) contendo 5 µM Fura-2 estou e 0,1% Pluronic F-127 para bater (D14 t o D20) iCMs. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C. Nota: Protege células de luz para evitar a têmpera do indicador fluorescente.</li>
	<li>Lavam-se células em solução de Tyrode 2 mL por 30 min à temperatura ambiente para permitir que a esterificação de Fura-2 AM.</li>
	<li>Imagem com fiação microscopia confocal disco a 340 nm e 380 nm, utilizando Slidebook 5.5 Ca2 + software de imagem. Execute a imagem à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transientes de cálcio são calculados usando a relação de intensidade de fluorescência a 340 nm sobre a intensidade de fluorescência em 380 nm.</li>
	<li>Se desejado, tratar de iCMs com 1 ou 2 µM isoproterenol ou 10 µM nifedipina para manipular cálcio manipulação após a imagem transientes de cálcio de linha de base. Adicione compostos localmente para as células e imagem.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O presente estudo descreve uma estratégia de alta eficiência para reprogramar diretamente fibroblastos em iCMs funcional através de entrega de GHMT2m fatores combinados com a supressão das vias de sinalização pró-fibróticos de reprogramação. Utilizando citometria de fluxo, imagem latente de imunofluorescência, cálcio imaging e bater a contagem de células, vamos mostrar a maioria das células no presente protocolo submetido a reprogramação bem sucedida e adotar o destino de linhagem CM. Mostramos anteriormente que a adição...

Doença isquêmica do coração é das principais causas de morte no Estados Unidos1. Aproximadamente 800.000 americanos experimentam um primeiro ou recorrente do miocárdio (MI) por ano1. MI, na sequência da morte de cardiomyocytes (CMs) e Fibrose cardíaca, depositados por fibroblastos cardíacos registrados, afectar o coração função2,3. Progressão da insuficiência cardíaca após MI é em grande parte irreversível devido a pobre capacidade regenerativa do adulto CMs4,5. Enquanto atuais terapias clínicas retardar a progressão da doença e diminuem o risco de futuros eventos cardíacos6,7,8,9, sem terapias reverter a progressão da doença, devido à incapacidade de regenere o CMs pós-infarto10. Terapias celulares romance surgem para tratar pacientes seguindo mi decepcionante, ensaios clínicos, entregando as células-tronco para o coração após MI até agora mostraram-se inconclusivos regenerativo potencial11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
A geração de células-tronco pluripotentes induzidas humanos-derivado (hiPSCs) de fibroblastos pela superexpressão de quatro fatores de transcrição, primeiramente demonstrado por Takahashi & Yamanaka, abriu as portas para novos avanços na terapia de célula19. Estas células podem se diferenciar em todas as três camadas germinativas19, e vários métodos altamente eficientes para gerar um grande número de CMs têm demonstrados anteriormente20,21. HiPSC-derivado CMs (quadris-CMs) oferece uma plataforma poderosa para estudar cardiomyogenesis e pode ter implicações importantes para reparar o coração após lesão. No entanto, quadris-CMs atualmente enfrentam obstáculos translacionais devido a preocupações de teratoma formação22, e sua natureza imatura pode ser pro-arrhythmogenic23. Reprogramação de fibroblastos em hiPSCs despertou interesse em diretamente reprogramação de fibroblastos em outros tipos de células. Ieda et al demonstraram que superexpressão de GATA4, Mef2c e Tbx5 (GMT) em resultados de fibroblastos em reprogramação direta linhagem cardíaca, embora a baixa eficiência24. Reprogramação de eficiência foi melhorado com a adição de Hand2 (GHMT)25. Desde os primeiros estudos, muitas publicações têm demonstrado que, alterar o coquetel fator reprogramação com transcrição adicional fatores28,de27,26,29, cromatina modificadores30,31, microRNAs32,33ou34 leva à melhoria de moléculas pequenas reprogramação eficiência e/ou maturação das células de casos-como induzidas (iCMs ).
Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para gerar iCMs de fibroblastos embrionários de rato (MEFs) com alta eficiência. Anteriormente mostramos que o GHMT cocktail é significativamente melhorado com a adição de miR-1 e miR-133 (GHMT2m) e é melhorada quando pró-fibróticos inclusive transformar o fator de crescimento β (TGF-β) sinalização de vias de sinalização ou associadas a Rho vias de sinalização da proteína quinase (ROCK) são inibidas35. Usando este protocolo, mostramos que aproximadamente 60% das células express T de troponina cardíaca (miocardite), aproximadamente 50% express α-actinin, e um elevado número de células de batida pode ser observado logo em dia 11 transdução de reprogramação de fatores e o tratamento a seguir com o TGF-β tipo I inibidor do receptor A-83-01. Além disso, esses iCMs expressam proteínas de junção gap incluindo connexin 43 e apresentam contração espontânea e transientes de cálcio. Esta marcada melhoria na eficiência em comparação com estudos anteriores de reprogramação demonstra o potencial para regenerar CMs de populações de células endógeno que permanecem no infarto de pós coração.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6 Camundongos</td><td>Charles River's Laboratory</td><td>027</td><td>Para isolamento de MEF</td></tr><tr><td>Células Platinum E (PE)</td><td>Cell Biolabs, INC</td><td>RV-101</td><td>Para produção de retrovírus</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Gibco</td><td>SH30022. </td><td>FS Componente do iCM, PE e Meio de Crescimento</td></tr><tr><td>199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>Componente do meio iCM</td></tr><tr><td>Soro Fetal</td><td>Bovino Gemini</td><td>100106</td><td>Componente do iCM, PE e Meio de Crescimento</td></tr><tr><td>Soro de Cavalo Doador</td><td>Gemini</td><td>100508 500</td><td>Componente do meio iCM</td></tr><tr><td>Aminoácidos Essenciais MEM, 50X</td><td>Life</td> Technologies <td>11130051</td><td>Componente do iCM meio</td></tr><tr><td>Solução de piruvato de sódio, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td>componente do meio iCM e para imagem de cálcio</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais MEM, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>componente do meio iCM</td></tr><tr><td>MEM Vitamin Solution, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11120-052</td><td>componente do meio iCM</td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selênio</td><td></td><td>Gibco 41400045</td><td>Componente da mídia iCM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Componente da mídia iCM</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Componente da mídia iCM, PE e mídia de crescimento</td></tr><tr><td>GlutaMAX (Suplemento de L-Glutamina)</td> <td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Componente da mídia iCM, PE e mídia de crescimento</td></tr><tr><td>Blasticidina-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td>Componente da mídia PE</td></tr><tr><td>Dicloridrato de puromicina</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Componente de meio PE</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina / EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Para separar células de placas de cultura</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>R & D Systems - Tocris</td><td>2939/10</td><td>Trate as células para inibir a sinalização TGF-&beta; - promove a reprogramação de alta eficiência. Use em 0,5 &micro; M</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>85190</td><td>Para diluição e armazenamento de A-83-01 e componente de Freeze Medium</td></tr><tr><td>SureCoat</td><td>Cellutron</td><td>SC-9035</td><td>Para revestir pratos para placas MEFs</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Reagente de Transfecção</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Reagente de Transfecção</td></tr><tr><td>Opti-MEM Mídia de Soro Reduzida</td><td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>Reagente</td></tr> <tr><td>de TransfecçãoPlasmídeo pBabe-X Myc-GATA4</td><td></td><td></td><td>contendo fator de reprogramação</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Hand2</td><td></td><td></td><td>Plasmídeo contendo fator de reprogramação</td></tr><tr><td>pBabe-X Plasmídeo Myc-Mef2c</td><td></td><td></td><td>contendo fator de reprogramação</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Tbx5</td><td></td><td></td><td>Plasmídeo contendo fator de reprogramação</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-1</td><td></td><td></td><td>Plasmídeo contendo fator de reprogramação</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-133</td><td></td><td></td><td>Plasmídeo contendo fator de reprogramação</td></tr><tr><td>pBabe-X GFP</td><td></td><td></td><td>Plasmídeo contendo fator de reprogramação</td></tr><tr><td>Polybrene (brometo de hexadimerina)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td>Para indução viral. Use na concentração de 6 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Filtro de Vácuo + garrafas (0,22 &micro; m poros)</td><td>Nalgene</td><td>&nbsp; 569-0020</td><td>Para meios filtrantes</td></tr><tr><td>Seringas</td><td>Bd Vacutainer Labware&nbsp;</td><td>309654</td><td>Para filtração viral</td></tr><tr><td>0.45 &micro; m Filtros</td><td>Celltreat</td><td>229749</td><td>Para filtração viral</td></tr><tr><td>70 &micro; filtros de células m</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>352350</td><td>Para isolamento de MEF e Cytometry</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Solution</td><td>BD</td><td>554722</td><td>Para fixação e permeabilização de células para buffer de perm</td></tr>/wash de citometria de fluxo<tr><td>&nbsp;</td><td>BD</td><td>554723</td><td>Para lavagem de células para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td>Para lavagem de células</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>VWR</td><td>0332-100g</td><td>Para citometria de fluxo e imagem de cálcio</td></tr><tr><td>Sigma</td> de<td>soro de cabra</td><td>G9023</td><td>Para células bloqueadoras para Citometria de Fluxo</td></tr><tr><td>Soro de Burro</td><td>Sigma</td><td>D9663-10mg</td><td>Para células bloqueadoras para Citometria</td></tr> de <tr><td>Fluxo Troponina de Camundongo T</td><td>Thermo Scientific</td><td>ms-295-p</td><td>1:400 IF, Citometria de Fluxo 1:200 Citometria</td></tr><tr><td>de Fluxo de Camundongo &alpha;-actinina</td><td>Sigma</td><td>A7811L</td><td>1:400 IF, 1:200 Citometria de</td></tr><tr><td>Fluxo Rabbit Conexin 43</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6219</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Troponina de coelho I</td><td>PhosphoSolutions</td><td>2010-TNI</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>62249</td><td>1:10000 IF</td></tr><tr><td>Alexa 488, coelho</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 555, mouse</td><td>Life Technologies</td><td>A-21422</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 647, mouse</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td>Citometria de Fluxo 1:200</td></tr><tr><td>27-cores ZE5 Citômetro de Fluxo&nbsp;</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>Para FACS</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>sigma</td><td>P6148-500mg</td><td>Para fixação de células para IF</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td>Para permeabilização de células para IF</td></tr><tr><td>EVOS&trade; Sistema de imagem em cores FL</td><td></td><td>Thermo Scientific AMEFC4300</td><td>para IF</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020-5000</td><td>para imagens de cálcio</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>395</td><td>para imagens de cálcio</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td>para imagens de cálcio</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>VWR</td><td>97061-352</td><td>para imagens de cálcio</td></tr><tr><td>glicose</td><td>sigma</td><td>G7528-250g</td><td>Para imagem de cálcio</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>sigma</td><td>H4034-500g</td><td>Para imagem de cálcio</td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Para imagem de cálcio</td></tr><tr><td>Fluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250g</td><td>Para imagem de cálcio</td></tr><tr><td>Nifedipine</td><td>Sigma</td><td>N7634-1G</td><td>Para transientes de cálcio de ruptura em iCMs - use em 10 & Micro; </td></tr><tr><td>M Isoproterenol</td><td>sigma</td><td>I6504-1g</td><td>Para aumentar o número de transientes de cálcio em iCMs - use em 1-2 &micro; M</td></tr><tr><td>Marianas Spinning Disk Microscópio confocal</td><td>3i</td><td></td><td>Para imagem de cálcio</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>alvejante</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubos cônicos</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td></td><td></td></tr> 227261 <tr><td>tubos cônicos de 15 mL</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td></td><td></td></tr> 188271 <tr><td>placas de cultura de células de 15 cm</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>placas de cultura de células de 10 cm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultura de células de 60 mm</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 6 poços</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>657160&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 12 poços</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>665180&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 24 poços</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>662160&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em cardiomyocytes induzida

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Trans-diferenciação do tipo de uma célula somática em outro tem um enorme potencial para modelar e tratar doenças humanas. Estudos anteriores mostraram esse rato embrionárias, fibroblastos dérmicos e cardíacos podem ser reprogramados em células-induzida-casos-como funcionais (iCMs) pela superexpressão de fatores de transcrição cardiogênico incluindo GATA4, Hand2, Mef2c, e Tbx5 tanto in vitro e in vivo. No entanto, esses estudos anteriores têm mostrado eficiência relativamente baixa. A fim de restaurar a função cardíaca após lesão, os mecanismos que regem a reprogramação cardíaca devem ser elucidados para aumentar a eficiência e a maturação de iCMs.
Demonstramos anteriormente que a inibição da sinalização pró-fibróticos dramaticamente aumenta a eficiência de reprogramação. Aqui, detalhamos os métodos para alcançar uma eficiência de reprogramação de até 60%. Além disso, descrevemos vários métodos, incluindo citometria de fluxo, imunofluorescência imagem e imagem latente de cálcio para quantificar a reprogramação eficiência e maturação dos fibroblastos reprogramadas. Usando o protocolo detalhado aqui, podem ser realizados estudos mecanicistas para determinar os reguladores positivos e negativos de reprogramação cardíaca. Estes estudos podem identificar caminhos de sinalização que podem ser direcionados para promover a reprogramação eficiência e maturação, o que poderia levar a terapias celulares novela para tratar a doença de coração humana.

Usando a estratégia de reprogramação descrita acima e na figura 1B, geramos iCMs com aproximadamente 70% das células expressando T de troponina cardíaca e aproximadamente 55% das células expressando cardíaca α-actinin, quantificada por citometria de fluxo no dia 9 transdução de GHMT2m a seguir (Figura 2A e B). Além disso, a maioria das células express cardíaca troponina T, troponina e α-actinin cardíaca bem como ...

Aqui nós apresentamos um método robusto para reprogramar fibroblastos embrionários primários em cardiomyocytes funcional através de superexpressão de GATA4 Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) juntamente com a inibição da sinalização do TGF-β. Nosso protocolo gera cardiomyocytes bater tão cedo quanto pós-transdução de 7 dias com até 60% eficiência.

Supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em Cardiomyocytes induzida

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da reprogramação cardíaca, como identificar quais vias promovem ou reparam a cardiomiogênese. A principal vantagem desta técnica é que podemos gerar cardiomiócitos induzidos funcionais, com maior eficiência do que os métodos publicados anteriormente. Essas doenças cardíacas químicas resultam em perda de cardiomiócitos e comprometimento da função cardíaca.Portanto, essa técnica pode auxiliar no alto reparo, convertendo fibroblastos em cardiomiócitos induzidos funcionais. Para iniciar a produção de retrovírus, cultive células Platinum E ou PE em meio PE. Complemente-o com marcadores de seleção em um prato de 10 cm, em um gabinete de nível de biossegurança dois.A cada dois dias passam as células, em uma a quatro, ou uma a quinta diluição. Um dia antes da transfecção planejada, semeie as células PE em 10 ml de meio de crescimento, em uma placa de cultura de 10 cm e, em seguida, balance suavemente as placas para frente e para trás. Coloque cuidadosamente os pratos em uma incubadora, para permitir uma distribuição uniforme das células, e incube por 24 horas.No dia da transfecção, adicione o coquetel GHMT2M a um tubo de 1,5 ML. Em seguida, adicione 360 microlitros de meio de soro reduzido a um tubo separado de 1,5 ML. Em seguida, adicione 36 microlitros de reagente de transfecção ao meio de soro reduzido e agite suavemente o tubo para misturar.Incube em temperatura ambiente por cinco minutos. O reagente de transfecção usado nesta etapa se liga ao plástico. Para evitar a eficiência da transfecção, tome cuidado para pipetar o reagente de transfecção, diretamente no meio de soro reduzido, e evite tocar a ponta da pipeta na parede do tubo.Em seguida, adicione a mistura de reagentes de transfecção de meio de soro reduzido ao tubo, contendo o coquetel de DNA GHMT2M. Agite suavemente o tubo para misturar e incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Por fim, adicione a mistura de reação de transfecção gota a gota às células PE.Gire suavemente o prato por 10 a 15 segundos. Incubar as células transfectadas a 37 graus Celsius, por 16 a 20 horas. Agora cubra os pratos de 60MM com colágeno e incube a 37 graus Celsius, por no mínimo duas horas.Em seguida, dispense fibroblastos embrionários de camundongo recém-descongelados, ou MEFs, nos pratos revestidos de colágeno. E adicione meio de crescimento em um volume final, de 4ML por prato de 60MM. Balance suavemente os pratos e coloque-os na incubadora.Ao revestir MEFs, é importante que as células sejam revestidas uniformemente. Evite girar os pratos, isso pode causar um revestimento irregular. Em vez disso, balance suavemente o prato para frente e para trás e coloque-o cuidadosamente na incubadora.24 horas após a transfecção das células PE, use uma seringa de 30ML para coletar o meio retroviral gerado pelas células. Passe a primeira coleta de meio retroviral através de um filtro de tamanho de 45 micrômetros, em um tubo cônico de 50ML. Em seguida, adicione 10ML de meio de crescimento fresco na parede do prato, tomando cuidado para não deslocar as células PE.Incube as células a 37 graus Celsius por mais 24 horas. Em seguida, adicione 7,2 microlitros de 10MG por mililitro de reagente de transdução de brometo de metatrina de hexidina ao tubo cônico de 50ML contendo sobrenadante viral. Agora aspire o meio dos MEFs e adicione 4ML do meio retroviral recém-colhido ao prato.Incubar as células a 37 graus Celsius por 24 horas. 48 horas após a transfecção das células PE, coletar o meio retroviral e realizar a transdução exatamente da mesma maneira que na primeira coleta. Descarte as células PE após a segunda coleta do meio retroviral e adicione 10% de alvejante a todos os materiais em contato com o meio retroviral.Após a incubação, aspirar o meio retroviral dos MEFs e adicionar 4ML de meio ICM, contendo 05 micromolares, inibidores do receptor TGF Beta Tipo 1. A cada dois dias, troque o meio ICM, até novo uso. Para iniciar a imunocoloração, aspire o meio ICM do dia 14 MEFs reprogramados.Em seguida, lave as células uma vez com 1ML de PBS 1X gelado, por poço da placa de 12 poços. Em seguida, aspire o PBS, adicione 500 microlitros de 2% de paraformaldeído para fixar as células e incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Após aspirar o paraformaldeído, lavar as células três vezes com 1ML de PBS.Depois de aspirar o PBS, adicione 500 microlitros de. 02%Triton X 100 e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a aspiração de Triton X 100, bloqueie as células com 500 microlitros de soro de cavalo a 10%, por 30 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, aspire o soro de cavalo e adicione 500 microlitros de anticorpo primário diluído. Incube por uma hora em temperatura ambiente. Após aspirar o anticorpo primário, lave três vezes com 1ML de PBS.Após a última lavagem de PBS, adicione 500 microlitros de anticorpo secundário diluído. Embrulhe o prato em papel alumínio e incube no escuro, por uma hora em temperatura ambiente. Por fim, aspire o anticorpo secundário e lave três vezes com 1ML de PBS.Embrulhe a placa em papel alumínio e guarde a quatro graus Celsius até que a imagem seja feita. Este método mostra alta eficiência de conversão de MEFs em cardiomiócitos. Uma análise representativa de citometria de fluxo, adicionada ao nono dia após a transdução, mostra a expressão de troponina T cardíaca ativada em aproximadamente 70% das células.Da mesma forma, a expressão cardíaca de alfa-actinina é observada em aproximadamente 55% das células, quando comparada ao controle de transdução de GFP. Além disso, a imunocoloração para marcadores cardíacos, realizada duas semanas após a transdução, mostra que a maioria das células expressa Troponina I, Alfa-actinina e Troponina T. A proteína de junção comunicante Cx43 também foi detectada ao longo da periferia dos ICMs. Além disso, a co-marcação de ICMs com alfa-actinina, ou troponina T e Cx43, revela formações de junções comunicantes entre células vizinhas.A transdução de GHMT2M e o tratamento com A83O1 reprogramam uma fração de MEFs em células batedoras no oitavo dia. No dia 11, são observadas aproximadamente 10000 células batendo por centímetro quadrado. Transientes espontâneos de cálcio são detectados em cardiomiócitos batendo.A adição de agonista beta adrenérgico isoproterenol aumenta significativamente a frequência de transientes espontâneos de cálcio. Em contraste, a sedição do bloqueador dos canais de cálcio do tipo L, nifedipina, diminui significativamente a frequência de transientes de cálcio. Depois de assistir a este vídeo, deve-se ter uma boa compreensão de como reprogramar fibroblastos em cardiomiócitos funcionais induzidos com alta eficiência.Seguindo este protocolo, outros métodos, incluindo sequenciamento de RNA e sequenciamento de chip, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como expressão gênica global e status da cromatina, são alterados durante a reprogramação cardíaca. Não se esqueça de que trabalhar com retrovírus pode ser perigoso. Precauções, como trabalhar em um gabinete de nível dois de biossegurança, usar equipamento de proteção individual e descarte adequado de todos os resíduos retrovirais, devem sempre ser implementadas durante a execução deste protocolo.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós descrevemos o uso de um ensaio de células de rato ES base para identificar janelas de tempo crítico para Wnt / β-catenina e ativação do sinal BMP durante a indução cardiogênico. O método fornece uma plataforma padronizada, que quantifica a eficiência confiável cardiogênico, e é aplicável ao estudo de linhagens de célula.

Modificado embrionárias de camundongos com células-tronco Ensaio baseado para quantificar a eficiência de indução cardiogênico

Descrevemos aqui um protocolo para a geração de iCMs usando entrega mediada por retrovírus de Gata4, Tbx5 e Mef2c em uma construção policistrônica. Este protocolo produz uma população relativamente homogênea de células reprogramadas com eficiência e qualidade aprimoradas e é valioso para estudos futuros de reprogramação de iCM.

Melhoria Geração de Induced Cardiomyocytes utilizando uma construção policistrónico Expressando proporção ideal de GATA4, MEF2C e Tbx5

Mostrado aqui é um método para visualizar a ultraestrutura da matriz extracelular em tecidos cardíacos descelularizados.

Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Este protocolo descreve um método passo a passo para o isolamento reprodutível e cultura de longo prazo de cardiomiócitos de camundongos adultos com alto rendimento, pureza e viabilidade.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Apresentamos três protocolos de novos e mais eficientes para a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas induzida em cardiomiócitos, células endoteliais, e células do músculo liso e um método de entrega que melhora o enxerto de células transplantadas através da combinação de injecção das células com citocinas entrega mediada por remendo.

Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Neste protocolo, podemos demonstrar e elaborar sobre como usar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para diferenciação e purificação de cardiomiócitos, e ainda, sobre como melhorar sua eficiência de transplante com inibidor de proteína quinase associada a Rho pré-tratamento em um modelo de infarto do miocárdio do camundongo.

Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase

Este protocolo demonstra a indução de um programa hemogenic em fibroblastos dérmicos humanos pela expressão forçada dos fatores de transcrição GATA2, GFI1B e FOS para gerar células-tronco e progenitoras hematopoiéticas.

Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

Descrevemos aqui, o estabelecimento e a aplicação de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo) linha de repórteres para avaliação de reprogramação cardíaca. Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) isolados da cepa do camundongo são convertidos em cardiomiócitos induzidos (iCMs), permitindo uma avaliação conveniente e eficiente da eficiência de reprogramação e maturação funcional dos ICMs via fluxo de cálcio (Ca2+).

Avaliação in vitro da reprogramação cardíaca medindo fluxo de cálcio específico cardíaco com um repórter GCaMP3

Aprenda a reprogramar fibroblastos embrionários de rato em cardiomyócitos funcionais usando fatores de transcrição e microRNAs. Este método de reprogramação cardíaca alcança até 60% de eficiência em apenas 7 dias.

Supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em Cardiomyocytes induzida (Vídeo) | JoVE Journal

Supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em Cardiomyocytes induzida

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