Localização de cor multi microscopia de proteínas de membrana única em organelas de células de mamíferos vivas

Essa técnica pode responder a questões-chave em processos regulatórios, como qual papel a dinâmica e a organização das proteínas desempenham na adaptação funcional. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser feita em células vivas, revelando assim a dinâmica da proteína no nível de uma única molécula. Embora esse método tenha sido originalmente implementado para fornecer informações sobre a organização espaço-temporal das proteínas da membrana mitocondrial, ele também pode ser aplicado a outras organelas e outras proteínas da membrana.

Demonstrando a técnica estará Timo Appelhans, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Após a transfecção e preparação das amostras de células e do microscópio de acordo com o protocolo de texto, monte a amostra preparada com esferas fluorescentes no porta-amostras entre o anel de PTFE e o anel de borracha vermelho. Inicie o microscópio, todos os componentes de hardware e todo o software necessário para a microscopia.

Use um lenço de papel fresco e sem fiapos borrifado com isopropanol para limpar a lente objetiva e a parte inferior da lamínula. Em seguida, coloque uma gota de óleo de imersão na pupila da lente objetiva. Em seguida, coloque o porta-amostras com a amostra de esferas no microscópio stage, de modo que a parte inferior da lamínula entre em contato com o óleo.

Em seguida, concentre-se nas contas usando luz de transmissão ou uma linha de laser. Ajuste a potência dos dois lasers de excitação para obter densidade de sinal semelhante nos dois canais de fluorescência. Em seguida, procure uma área com muitos sinais fluorescentes distintos.

Gere uma visualização mesclada dos canais fluorescentes usando o software de controle da câmera. Em seguida, use os parafusos no divisor de imagem para inclinar manualmente o divisor de imagem óptico interno para obter a melhor sobreposição dos sinais dos dois canais fluorescentes. Inicie o software de controle de microscópio TIRF e opte por exibir canais individuais no modo de transmissão ao vivo.

Tire uma imagem instantânea, fluorescentes emocionantes em todos os canais. Em seguida, use essa imagem para produzir a matriz de transformação. Inicie o plug-in de análise de software e carregue as imagens de duas cores gravadas anteriormente de esferas fluorescentes no software.

Escolha a orientação usada dos canais fluorescentes. Clique em Sim quando solicitado a calibrar imagens e selecione o instantâneo tirado anteriormente. Abra o gerenciador de unidades para definir os fatores de conversão de unidades e, em seguida, abra o gerenciador de localização.

Para determinar a função de propagação de pontos, ou PSF, pressione o botão PSF Radius. Na janela PSF Estimator que se abre, defina a abertura numérica e o máximo de emissão. Em seguida, clique em Estimar raio PSF.

Em seguida, aceite o PSF experimental obtido. Defina a caixa de avaliação, o número de loops de deflação e quantos núcleos do computador são usados para o cálculo. Em seguida, pressione Localizar para começar a ajustar a distribuição de intensidade de partículas únicas, usando uma função gaussiana simétrica 2D.

Abra o gerenciador de calibração. Na imagem renderizada e mesclada dos dois canais, o sinal original e os centros localizados serão mostrados. Escolha o modo Afim.

Em seguida, conecte manualmente os pares correspondentes de centros localizados nos dois canais, que se originaram do mesmo cordão fluorescente, desenhando uma linha de conexão. Conecte os sinais correspondentes distribuídos pelo campo de view. Em seguida, pressione Aceitar e salve a matriz de transformação.

Para realizar imagens moleculares únicas de proteínas da membrana mitocondrial, monte a lamínula da amostra entre os anéis de borracha e PTFE. Em seguida, encha a câmara com 0,5 a 0,8 mililitros de meio de imagem. Limpe a lente objetiva e a parte inferior da lamínula.

Em seguida, use luz de transmissão ou uma linha de laser para focar nas células, depois de adicionar uma gota de óleo à lente. Em seguida, ajuste a potência dos dois lasers de excitação para obter uma intensidade semelhante e procure uma área com muitos sinais fluorescentes. Ajuste o ângulo de iluminação no software de controle do microscópio TIRF para criar um ângulo de incidência menor que o ângulo crítico, ou o modo TIR, para excitar a região específica de interesse por meio de uma folha HILO.

Adaptar a iluminação do microscópio TIRF para excitar organelas celulares usando a iluminação HILO requer julgamento rápido da relação sinal-fundo e experiência em microscopia TIRF, bem como conhecimento da morfologia celular. Defina o ganho EM e escolha um tempo de exposição adequado para o experimento que colete fótons suficientes por quadro. Em seguida, ajuste a potência do laser para obter uma alta relação sinal-ruído, pois essa relação corresponde diretamente à precisão da localização.

Encontre uma área na periferia da célula com mitocôndrias alongadas e não sobrepostas e sinais de molécula única. Se nenhum sinal único for visível em um ou ambos os canais, espere até que o branqueamento resulte no aparecimento de sinais de molécula única. No caso de apenas um canal precisar ser branqueado, desligue o laser do outro canal, para evitar o branqueamento, antes de gravar este canal.

Grave até que o número de sinais seja muito baixo para uma continuação razoável. Inicie o software de processamento de imagens e verifique se há estruturas mitocondriais gerando uma imagem de soma renderizada cumulativa de pelo menos 1.000 quadros gravados. Inicie o plug-in de análise de software.

Para realizar o processamento de dados para localização e rastreamento, carregue os dados brutos. Verifique multicolorido. Escolha a orientação correta de ambos os canais.

Quando solicitado a Calibrar imagens, carregue a matriz de transformação. Os canais serão exibidos separadamente. Abra os dados brutos do contêiner de imagem clicando em Mostrar.

Em seguida, abra o gerenciador de unidades na guia superior e defina os fatores de conversão de unidades em cada canal. Abra o gerenciador de localização na guia superior e defina a caixa de avaliação e o número de loops de deflação. Clique em PSF Radius para abrir o estimador PSF.

Defina a abertura numérica e o máximo de emissão para obter o valor teórico de PSF. Pressione Aceitar. Repita isso para todos os canais.

Em seguida, pressione Localizar para iniciar a localização de partícula única para os sinais gravados em ambos os canais. Aguarde a conclusão do software. Agora, uma imagem super-resolvida para cada canal é obtida no contêiner de imagem do plug-in de análise de software.

PINK1 é um fator importante que garante a funcionalidade mitocondrial. Para determinar a localização de PINK1 em relação a Tom20 em mitocôndrias funcionais e disfuncionais, uma série temporal de 1.000 quadros foi registrada. A imagem cumulativa de todos os sinais ao longo do tempo de um canal mostrou que o PINK1 estava localizado no citosol, na membrana externa e dentro das mitocôndrias em condições normais, mas preferencialmente na membrana externa das mitocôndrias despolarizadas.

Como mostram as imagens somadas de partículas localizadas, PINK1 é distribuído principalmente dentro de mitocôndrias polarizadas, enquanto Tom20 está localizado na membrana mitocondrial externa. Isso fica ainda mais claro na imagem mesclada das partículas localizadas de Tom20 e PINK1, o que mostra que a distribuição da proteína de membrana externa Tom20 é muito mais ampla. Para verificar a localização de PINK1 dentro das mitocôndrias, a subunidade de 30 kilodalton do complexo respiratório um foi fundida à GFP fotoativável e registrada por microscopia de localização de fotoativação por fluorescência.

A imagem tripla colorida cumulativa e a distribuição da seção transversal mostram a sobreposição do complexo um e PINK1, confirmando a importação do PINK1 de comprimento total. Esses dados demonstram que as subpopulações de PINK1 ocupam vários microcompartimentos mitocondriais. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 20 horas, incluindo gravação e pós-processamento de dados, se for feita corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de testar o movimento das organelas. Seguindo este procedimento, a localização relativa das proteínas pode ser determinada. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do rastreamento de partículas únicas de proteínas mitocondriais observarem seu comportamento em Z2 e diferentes condições metabólicas e sob estresse.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a microscopia de coluna dupla de proteínas mitocondriais para revelar sua posição e tráfego de suborganelas.