Otimizado zero ensaio para In Vitro testes de migração celular com uma câmera óptica automatizada
8 de agosto de 2018
Aqui descrevemos um procedimento para testar a célula migração em vitro com um microscópio de câmara óptica automatizada. O ensaio de risco tem sido amplamente utilizado, onde o encerramento da Risque é seguido por um período. O microscópio óptico permite detecção confiável e barata de migração celular.
A principal vantagem dessa técnica é que você pode observar as células em tempo real no microscópio óptico automático. As implicações deste tratamento estendem-se a uma terapia de feridas crónicas ou cancro onde a migração desempenha um papel crucial nestas doenças. Comece lavando uma cultura confluente de células HaCaT duas vezes com cinco mililitros de magnésio estéril e PBS livre de cálcio por lavagem.
Em seguida, incube as células com um mililitro de tripsina em uma incubadora de 37 graus Celsius por cinco a oito minutos. Após confirmar o descolamento ao microscópio óptico, interromper a reação enzimática com nove mililitros de meio de cultura suplementado com FBS. E dilua as células para 7,5 vezes 10 elevado a quarto células por 250 microlitros de meio mais concentração de FBS.
Em seguida, semeie 250 microlitros de células em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo redondo de 48 poços e deslize suavemente a placa de um lado para o outro para garantir que as células sejam distribuídas igualmente pelo fundo do poço. Em seguida, transfira a placa para uma incubadora de cultura de células. Quando as culturas atingirem uma confluência de 90 a 95%, substitua o sobrenadante em cada poço por 250 microlitros de meio recém-preparado suplementado com 10 microgramas por mililitro de mitomicina C e retorne a placa à incubadora por mais duas horas.
No final da incubação, lave as células com 250 microlitros de PBS e adicione 250 microlitros de PBS fresco a cada poço. Em seguida, use uma ponta de micropipeta de 200 microlitros para fazer um arranhão vertical em cada monocamada de célula. Quando todas as monocamadas tiverem sido arranhadas, substitua o PBS em cada poço por 250 microlitros com o estímulo peptídico de interesse e monte a placa em um sistema de câmera óptica com a tampa intacta.
Para configurar a câmera óptica, abra a janela de aquisição e selecione cicatrização de feridas. Selecione o tipo de placa e desmarque os poços que não estão em uso. Em seguida, clique em ativar e clique com o botão direito em um dos poços para ajustar o foco para se ajustar à posição das células.
Defina o período de tempo para as imagens no intervalo de imagens e defina o número de repetições para caber no período desejado. Em seguida, selecione o tipo de análise apropriado. Em seguida, clique em iniciar para começar a obter imagens das células.
Quando ocorre uma ferida, as células da pele começam a proliferar e migrar pelo leito da ferida para fechá-la, um processo que pode ser observado através da câmera óptica. Após uma incubação de 48 horas, o tratamento com fator de crescimento endotelial induz um fechamento de quase 95% da ferida, em comparação com um fechamento de 38% nos poços de controle não tratados e 33 e 62% nas culturas de lactoferrina e lactoferricina, respectivamente. A porcentagem de fechamento da ferida determinada a partir de mudanças na largura da lacuna desde o arranhão inicial também pode ser plotada para cada estímulo de crescimento.
Este vídeo descreve um protocolo simples e eficiente para estudar a migração de queratinócitos através de um arranhão feito em uma monocamada de células saudáveis. Embora as células usadas neste ensaio sejam células HaCaT, o método também pode ser aplicado em outras linhagens celulares, fungos ou mesmo bactérias, desde que sejam aderentes ao fundo da placa de microtitulação.
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Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento para testar a migração celular in vitro utilizando um microscópio óptico com câmera automatizada. O ensaio de arranhão é destacado como um método confiável para observar a migração celular ao longo do tempo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Microscopia
- Técnicas In Vitro
Contexto
- O ensaio de arranhão é uma técnica amplamente utilizada para o estudo da migração celular.
- Microscópios ópticos automatizados permitem a observação em tempo real das células.
- Compreender a migração celular é essencial para terapias de feridas crônicas e câncer.
- Este método é econômico e confiável para detectar o movimento celular.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método confiável para avaliar a migração celular.
- Explorar as implicações da migração celular no tratamento de feridas crônicas e na terapia do câncer.
- Utilizar microscopia óptica automatizada para análise em tempo real.
Métodos Utilizados
- Lavando culturas confluentes de células HaCaT com PBS.
- Incubando as células com tripsina para destacá-las.
- Interrompendo a reação enzimática com meio de cultura.
- Diluindo as células até uma concentração específica para análise.
Resultados Principais
- A observação em tempo real da migração celular foi alcançada.
- O método demonstrou-se eficaz para monitorar o fechamento do arranhão.
- Os resultados podem orientar estratégias terapêuticas para feridas crônicas e câncer.
- A microscopia automatizada aumenta a confiabilidade das avaliações de migração.
Conclusões
- O microscópio óptico automatizado é uma ferramenta valiosa para o estudo da migração celular.
- Essa técnica pode impulsionar pesquisas sobre cicatrização de feridas crônicas e terapias contra o câncer.
- Estudos futuros podem ampliar suas aplicações em diversos contextos biológicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Ensaios de migração celular são essenciais para avaliar candidatos terapêuticos em cicatrização de feridas e oncologia, mas os ensaios de arranhão tradicionais apresentam artefatos nas bordas e gargalos na análise manual. Este protocolo otimizado resolve os desafios de reprodutibilidade ao eliminar o acúmulo celular mediado por cátions e integrar imagem automatizada, permitindo leituras de migração consistentes e quantitativas. A abordagem apoia a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas ao fornecer dados confiáveis em tempo real sobre compostos pró- e anti-migratórios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de alterações na migração em resposta a estímulos como lactoferrina ou fatores de crescimento.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade proveniente da análise manual de arranhões e de flutuações de temperatura por meio de imagem óptica automatizada.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz métricas padronizadas e quantitativas de fechamento de feridas a partir de seções idênticas de arranhão ao longo do tempo.
- Valor Operacional: Elimina a análise e a alternância trabalhosas de imagens, melhorando o rendimento para triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Utiliza queratinócitos HaCaT relevantes para doenças para modelar a migração epitelial, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Valor Operacional: Garante a continuidade do ensaio da fase de descoberta à avaliação pré-clínica por meio de fluxos de trabalho automatizados e reprodutíveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, apoiando a verificação de hipóteses na fase inicial de descoberta e permitindo a identificação quantitativa de compostos ativos por meio da inibição ou estimulação mensurável da migração.
- Biologia da Descoberta: Apoia a elucidação de vias ao isolar a migração como variável dependente em resposta a tratamentos com peptídeos ou citocinas.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis (por exemplo, % de fechamento da ferida) que permitem comparação entre bibliotecas de compostos ou variantes proteicas.
- Análises: Gera dados de migração em série temporal adequados para comparação estatística e modelagem de resposta à dose.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à relevância pré-clínica mediante o uso de células de queratinócitos humanos e contexto de cicatrização de feridas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável e automatizada para ensaios de migração em múltiplos projetos e tipos celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista em ensaios de migração.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e escalabilidade por meio de imagem automatizada e preparação consistente do arranhão.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados quantitativos confiáveis sobre migração no início do processo.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em efeitos de migração validados.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células e técnica estéril para o preparo de monocamada.
- Depende de sistemas ópticos automatizados com câmera de lapso de tempo e capacidades de análise.
- Necessita padronização da largura e do tempo da arranhadura entre poços para obtenção de dados comparáveis.
- Envolve a otimização das etapas de lavagem com PBS para prevenir artefatos nas bordas em diferentes linhagens celulares.
- Limitado a células aderentes compatíveis com a adesão ao fundo de placas de microtitulação.
