Otimizado zero ensaio para In Vitro testes de migração celular com uma câmera óptica automatizada

A principal vantagem dessa técnica é que você pode observar as células em tempo real no microscópio óptico automático. As implicações deste tratamento estendem-se a uma terapia de feridas crónicas ou cancro onde a migração desempenha um papel crucial nestas doenças. Comece lavando uma cultura confluente de células HaCaT duas vezes com cinco mililitros de magnésio estéril e PBS livre de cálcio por lavagem.

Em seguida, incube as células com um mililitro de tripsina em uma incubadora de 37 graus Celsius por cinco a oito minutos. Após confirmar o descolamento ao microscópio óptico, interromper a reação enzimática com nove mililitros de meio de cultura suplementado com FBS. E dilua as células para 7,5 vezes 10 elevado a quarto células por 250 microlitros de meio mais concentração de FBS.

Em seguida, semeie 250 microlitros de células em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo redondo de 48 poços e deslize suavemente a placa de um lado para o outro para garantir que as células sejam distribuídas igualmente pelo fundo do poço. Em seguida, transfira a placa para uma incubadora de cultura de células. Quando as culturas atingirem uma confluência de 90 a 95%, substitua o sobrenadante em cada poço por 250 microlitros de meio recém-preparado suplementado com 10 microgramas por mililitro de mitomicina C e retorne a placa à incubadora por mais duas horas.

No final da incubação, lave as células com 250 microlitros de PBS e adicione 250 microlitros de PBS fresco a cada poço. Em seguida, use uma ponta de micropipeta de 200 microlitros para fazer um arranhão vertical em cada monocamada de célula. Quando todas as monocamadas tiverem sido arranhadas, substitua o PBS em cada poço por 250 microlitros com o estímulo peptídico de interesse e monte a placa em um sistema de câmera óptica com a tampa intacta.

Para configurar a câmera óptica, abra a janela de aquisição e selecione cicatrização de feridas. Selecione o tipo de placa e desmarque os poços que não estão em uso. Em seguida, clique em ativar e clique com o botão direito em um dos poços para ajustar o foco para se ajustar à posição das células.

Defina o período de tempo para as imagens no intervalo de imagens e defina o número de repetições para caber no período desejado. Em seguida, selecione o tipo de análise apropriado. Em seguida, clique em iniciar para começar a obter imagens das células.

Quando ocorre uma ferida, as células da pele começam a proliferar e migrar pelo leito da ferida para fechá-la, um processo que pode ser observado através da câmera óptica. Após uma incubação de 48 horas, o tratamento com fator de crescimento endotelial induz um fechamento de quase 95% da ferida, em comparação com um fechamento de 38% nos poços de controle não tratados e 33 e 62% nas culturas de lactoferrina e lactoferricina, respectivamente. A porcentagem de fechamento da ferida determinada a partir de mudanças na largura da lacuna desde o arranhão inicial também pode ser plotada para cada estímulo de crescimento.

Este vídeo descreve um protocolo simples e eficiente para estudar a migração de queratinócitos através de um arranhão feito em uma monocamada de células saudáveis. Embora as células usadas neste ensaio sejam células HaCaT, o método também pode ser aplicado em outras linhagens celulares, fungos ou mesmo bactérias, desde que sejam aderentes ao fundo da placa de microtitulação.