Name: Um método simples e reprodutível para preparar amostras de membrana de Microvessels de cérebro de rato recém isoladas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a isolar microvasos cerebrais de ratos para estudos bioquímicos da barreira hematoencefálica. Este método permite análises proteicas de alta qualidade em animais individuais, facilitando pesquisas em neurofarmacologia.

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Este trabalho foi apoiado por concessões do National Institutes of Health (R01-NS084941) e a Comissão de investigação biomédica do Arizona (ADHS16-162406) de PTR. WA recebeu passado o apoio de uma nomeação de doutorandos para um institutos nacionais de saúde formação Grant (T32-HL007249).

Todos os procedimentos descritos abaixo foram aprovados por um cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) e estar de acordo com o National Institutes of Health (NIH) e pesquisa Animal: Reporting In Vivo experimentos (chegada) orientações. O fluxo processual para o protocolo é descrito na Figura 1.
1. set-up para o procedimento
<ol><li>Prepare o buffer de microvessel do cérebro (BMB). Comece por pesagem 54,66 g D-manitol, 1,90 g EGTA e base de 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (ou seja, Tris) 1,46 g para um copo limpo. Adicione 1,0 L de água desionizada. Misture os componentes da reserva BMB utilizando um agitador magnético. Uma vez que a solução tem sido muito bem misturada, ajuste o pH para 7,4 usando 1,0 M de HCl.</li>
	<li>Prepare a solução de dextran (75.000 MW) de 26% (p/v) antes de anestesiar animais. Prepare a solução de dextran conforme descrito nas etapas a seguir. Nota: É criticamente importante preparar esta solução antes do tempo porque dextrano pode levar cerca de 1,5 a 2 h para dissolver em tampão aquosa.<ol>
<li>Pese o dextran em pó (26 g por 100 mL de tampão) em um copo limpo.</li>
		<li>Meça o volume apropriado de BMB e diluir em um copo separado, limpo.</li>
		<li>Lentamente despeje o copo contendo o pó dextrano BMB. Misture manualmente o dextran em pó durante o derramamento de BMB usando uma vareta de vidro celeuma.</li>
		<li>Ajuste o pH para 7,4 com 1,0 HCl M imediatamente antes de usar. Nota: Um isolamento típico do cérebro microvessels de 12 ratos de Sprague-Dawley individuais (masculino ou feminino; 3 meses de idade; 200-250 g cada) requer 200 mL da solução de dextran (i.e., dextrano 52 g em 200 mL de BMB).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. extração de tecido cerebral de ratos Sprague Dawley
<ol><li>Desejado no tratamento experimental, anestesiamos ratos Sprague-Dawley usando cetamina (50mg/kg; i.p. 2,5 mL/kg) e xilazina (10mg/mL; 2,5 mL/kg eu, p.). Dilua a ketamina e xilazina em soro fisiológico a 0,9% para concentrações finais de 20 mg/mL e 4,0 mg/mL, respectivamente. Eutanásia em animais por decapitação usando uma guilhotina afiada em conformidade com as diretrizes IACUC. Use o mesmo procedimento para masculinos e femininos ratos Sprague-Dawley.</li>
	<li>Ressecar a pele do crânio do rato, fazendo um único corte transversal com uma tesoura cirúrgica.</li>
	<li>Usando ruginas, Retire cuidadosamente a placa de crânio e expor o cérebro.</li>
	<li>Remova o cérebro com uma espátula. Desanexe o encéfalo e coloque o tecido cerebral isolada em um tubo cónico de 50 mL contendo 5 mL de BMB. Adicione 1,0 μL de cocktail por 1,0 mL de tampão BMB imediatamente antes da utilização do inibidor da protease.</li>
</ol>3. cérebro processamento
<ol><li>Transferi o tecido cerebral do tubo cónico de 50 mL para um tubo de ensaio limpo.</li>
	<li>Usando fórceps, Rode suavemente o cérebro 12,5 cm de diâmetro, papel de filtro para remover o exteriores meninges, que são vagamente aderiu ao córtex cerebral. Delicadamente pressione o tecido cerebral contra o papel de filtro e rolar o tecido novo. Vire o papel de filtro com frequência durante esta etapa.</li>
	<li>Separe os hemisférios cerebrais usando fórceps do plexo coroide. Nota: O plexo coroide aparece como um tecido claro membranoso localizado na superfície dos ventrículos cerebrais.</li>
	<li>Delicadamente, achatar o tecido cerebral e remover restantes meninges e bulbos olfatórios usando fórceps.</li>
	<li>Coloque o tecido cortical cerebral em um almofariz de vidro refrigerados. Adicione 5,0 mL de cocktail contendo inibidor da protease BMB a argamassa.</li>
	<li>Usando um homogenizador eléctricas aéreas, homogeneizar o tecido cerebral usando 15 subindo e descendo traçados a 3.700 rpm. Realize a homogeneização usando um moedor de tecido de 10 mL almofariz e pilão. Entre a homogeneização de cada amostra individual, limpe o pilão usando etanol a 70%. Nota: Homogeneização traços devem ser consistentes em termos de ritmo e magnitude.</li>
	<li>Despeje o homogeneizado em tubos de centrífuga rotulada.</li>
</ol>4. centrifugação passos
<ol><li>Adicione 8,0 mL da solução de dextran de 26% para cada tubo de centrifugação rotulado que contém o cérebro homogeneizado.</li>
	<li>Inverter o tubo duas vezes e então cuidadosamente a amostra de vórtice. Realizar a utilização do Vortex de cada amostra usando vários ângulos para assegurar uma mistura completa da solução de homogeneizado de cérebro com solução de dextran de 26%.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 5.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Nota: Para algumas análises, é útil comparar o cérebro microvessels com parênquima cerebral. Deve ser a avaliação da expressão da proteína em células de parênquima cerebral necessária, o sobrenadante desta etapa de centrifugação (ou seja, cérebro parenquimatosa fração) pode ser recolhido e armazenado a-80 ° C para uso futuro.</li>
	<li>Remover o sobrenadante usando um aspirador a vácuo e pipetas de vidro. Nota: O cuidado deve ser tomado para não perturbar a pelota. Caso contrário, a quantidade do cérebro microvessels coletados será reduzida, que diminuirá significativamente o rendimento de proteína deste procedimento.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 5,0 mL de BMB contendo inibidor da protease cocktail (ou seja, 1,0 μL inibidor da protease cocktail por 1,0 mL de tampão BMB). A pelota para assegurar uma mistura completa de vórtice.</li>
	<li>Adicione 8,0 mL de dextrano de 26% para cada tubo de centrifugação e vórtice, conforme descrito nas etapas 4.1-4.2 do presente protocolo.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 5.000 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Usando um balão de vácuo e pipeta de vidro, aspirar o sobrenadante e garantir aquela pelota contendo microvessel do cérebro não é interrompida. Nota: Excesso material que está aderido à parede do tubo não contém microvessels e deve ser cuidadosamente limpos e removido.</li>
	<li>Repita as etapas 4.5 a 4.8 um adicional duas vezes.</li>
	<li>Uma vez 4 dextrano centrifugação as etapas foram concluídas, adicionar 5,0 mL de BMB cada pellet e vórtice para Ressuspender a amostra. Nota: Após a conclusão da etapa 4.10, toda microvessels podem ser coletados para a análise da localização da proteína. Isso pode ser feito tomando um 50 μL alíquota de pelota microvessel re-suspensas e manchas em um vidro de microscópio. Microvessels são, então, calor-corrigido a 95 ° C por 10 min em um bloco de aquecimento seguido de fixação em etanol gelado para um adicional de 10 min. de Slides podem ser armazenados a 4 ° C até necessária para estudos de imagem.</li>
</ol>5. ultracentrifugação para preparar amostras de cérebro Total Microvascular membranas
<ol><li>Transferi as amostras para o homogeneizador copo gelado...</li>
	<li>Usando um homogenizador eléctricas aéreas, homogeneizar o tecido cerebral usando 8-10 e descer traçados a 3.000 rpm. Homogeneização é realizada usando um moedor de tecido de 10 mL almofariz e pilão. Limpe o pilão usando etanol a 70% após a homogeneização de cada amostra individual.</li>
	<li>Transferi as amostras para limpar os tubos se. Número e pesar cada tubo individual. Equilíbrio e emparelhar os tubos previamente ao seu embarque para o rotor se. Nota: Todos os pesando emparelhamento dos tubos se devem proceder e com as tampas para garantir uma medição precisa de pesos de tubo.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 150.000 x g durante 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Usando um balão de vácuo e vidro pipeta Pasteur, aspirar o sobrenadante usando o cuidado para não perturbar a pelota de membrana capilar.</li>
	<li>Baseado no tamanho da pelota, adicione um volume adequado de buffer de armazenamento, que é composta de água desionizada e BMB na proporção de 1:1 (v/v). Normalmente, as pelotas são resuspended em 400-500 μL de tampão de armazenamento. Adicione o cocktail de inibidor de protease para o buffer de armazenamento na proporção de 1,0 μL por 1,0 mL de buffer de armazenamento.</li>
	<li>Amostras de vórtice para resuspenda o pellet em buffer de armazenamento.</li>
	<li>Usando um pipeta Pasteur de vidro, transferi amostras de membrana capilar para um tubo de microcentrifugadora rotulado de 1,5 mL.</li>
	<li>Amostra de passagem através de uma agulha seringa 5 x para garantir que a amostra fique bem misturada e que não agregados celulares existem.</li>
	<li>Armazenar as amostras a-80 ° C até necessária para análise. Nota: O conteúdo de proteína de cada amostra de membrana microvessel é medido usando o método de Bradford.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste artigo, é descrito um método simples e eficaz de preparação de amostras de proteínas de membrana de microvessels recentemente isolada do tecido de cérebro de rato. Várias abordagens para isolamento de microvessels de cérebro de rato e/ou geração de preparações de membrana da microvasculatura isolada têm sido relatadas na literatura13,20,21,22 , 24. embor...

A barreira hemato - encefálica (BBB) existe na interface entre o sistema nervoso central (SNC) e a circulação sistêmica e desempenha um papel essencial na manutenção da homeostase do cérebro. Especificamente, as funções BBB para precisamente controle soluto concentrações no fluido extracelular de cérebro e eficientemente fornecer os nutrientes necessários para atender as demandas metabólicas consideráveis do CNS1pelo tecido cerebral. Essas funções implicam que o BBB, que existe principalmente no nível da célula endotelial microvascular, deve possuir mecanismos discretos que permitem que algumas substâncias acessar o parênquima cerebral, garantindo simultaneamente que xenobióticos potencialmente prejudiciais não pode se acumulam. Com efeito, as células endoteliais microvascular do cérebro não são fenestradas e exibem pinocitose limitado, que garante uma falta de permeabilidade não-seletivo2. Além disso, as células endoteliais do cérebro microvessel expressam apertado junção aderente junção proteínas e que agem para formar um físico "selar" entre células endoteliais adjacentes e restringir consideravelmente paracellular difusão de substâncias pelo sangue para o cérebro parênquima. Com efeito, permeabilidade seletiva de substâncias endógenas e exógenas requer expressão funcional de captação e efluxo de transportadores3. Globalmente, apertados cruzamentos, entroncamentos adherens e transportadores trabalham em conjunto para manter as propriedades de barreira exclusivo do BBB.
O BBB é uma barreira dinâmica que responde a estímulos fisiológicos, fisiopatológicos e farmacológicos. Por exemplo, estresse de hipóxia/reoxigenação foi mostrado para modular a expressão de proteínas críticas junção apertada (i.e., occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), que está associado com aumento paracellular permeabilidade para marcadores vasculares tais como sacarose4,5,6. Observações semelhantes foram feitas no BBB no cenário do de lesão cerebral traumática7 e dor inflamatória periférica8,9. Essas mesmas doenças também podem modular os mecanismos de transporte para o BBB10,11,12,13,14. De fato, lesão hipóxia/reoxigenação aumenta a expressão funcional de ânion orgânico transportando polipeptídeo 1a4 (Oatp1a4) no BBB, que pode levar a aumentos significativos no transporte de sangue-cérebro de substratos de transporte Oatp específicos tais como taurocholate e atorvastatina13. Propriedades BBB também podem ser alteradas por farmacoterapia em si, um mecanismo que pode servir de base para as duas mudanças profundas na eficácia da droga no cérebro e para interações medicamentosas. Por exemplo, paracetamol alvos receptor nuclear mecanismos de sinalização nas células endoteliais microvascular cerebral, aumenta a expressão funcional do transportador efluxo crítico P-glicoproteína (P-gp) e modifica a analgesia dependente do tempo conferidos pela morfina, uma droga analgésica opioide e P-gp estabelecida transportam substrato15. Uma compreensão completa das alterações BBB, que pode ser induzida por doenças ou drogas, também requer a identificação e caracterização de mecanismos regulamentares específicos que controlam estas modificações. Com efeito, as vias de sinalização discretas foram identificadas nas células endoteliais microvascular do cérebro que controlam a expressão molecular de junção apertada proteínas16,17 e transportadores15, 18,19. Tomados em conjunto, estas observações indicam que vias moleculares complexas estão envolvidas na regulação de junções apertadas de BBB e transportadores na saúde e na doença.
Um desafio significativo no estudo do BBB é a exigência absoluta de um método simples e eficaz para isolamento de microvessels de derivados de animais experimentais e posterior preparação de amostras de membrana de tecido cerebral. Estas amostras devem estar preparadas para que eles são ambos enriquecidos em células endoteliais microvascular do cérebro e limitados na presença de outros tipos de células. Ao longo dos últimos anos, várias metodologias para isolamento da microvasculatura do cérebro de roedor têm sido relatadas na literatura científica13,20,21,22. Este artigo descreve um simples, robusto e o método reprodutível para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para preparação das amostras endoteliais de membrana-enriquecido que pode ser usado para a análise da expressão da proteína. Uma vantagem deste protocolo de isolamento de microvessel é a capacidade de obter preparações de amostras de alta qualidade e com rendimento de proteína suficiente de um animal experimental individual. Isto permite a consideração de animal para animal variabilidade na expressão da proteína. Tal adiantamento neste protocolo melhorou extremamente a robustez dos estudos do BBB porque sobreavaliação (ou Under estimativa) a verdadeira amplitude das alterações de proteína no BBB agora pode ser evitada. Além disso, a inclusão de várias etapas de centrifugação com dextran permite melhor enriquecimento de microvessels em amostras experimentais facilitando a remoção dos constituintes celulares indesejados como os neurônios.

<table><tbody><tr><td>Coquetel de inibidores de protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8340</td><td>Componente do tampão de microvasos cerebrais</td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M4125</td><td>Componente do tampão de microvasos cerebrais</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#E3889</td><td>Componente do tampão de microvasos cerebrais</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T1503</td><td>Componente do tampão de microvasos cerebrais</td></tr><tr><td>Dextrano (MW 75.000)</td><td>Spectrum Chemical Mftg Corp</td><td>#DE125</td><td>Dextrano usado em etapas de centrifugação para separar microvasos do parênquima</td></tr><tr><td>cerebral Zetamina</td><td>MWI Animal Health</td><td>#501072</td><td>Anestésico geral</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Western Medical Supply</td><td>#5530</td><td>Anestésico geral</td></tr><tr><td>solução salina a 0,9%</td><td>Western Medical Supply</td><td>N/A</td><td>Anestésico geral diluente</td></tr><tr><td>Papel de filtro (12,5 cm de diâmetro)</td><td>VWR</td><td>#28320-100</td><td>Usado para remoção de meninges do tecido cerebral Tubos de</td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Sarstedt</td><td>#60.540.386</td><td>Tubos descartáveis usados para etapas de centrifugação de dextrano</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Ensaio Coomassie Plus (Bradford)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23236</td><td>Medição da concentração de proteína em preparações de membrana</td></tr><tr><td>Wheaton Overhead Power Homogeneizer</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#903475</td><td>Necessário para homogeneização de amostras</td></tr><tr><td>10,0ml de almofariz de vidro e moedor de tecido de pilão</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#358039</td><td>Necessário para homogeneização de amostras</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H1758</td><td>Necessário para ajuste de pH de tampões</td></tr><tr><td>Albumina de</td> soro bovino <td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23210</td><td>Padrão de proteína para pinça padrão de ensaio de Bradford</td></tr> Ferramentas <tr><td></td><td>de ciência fina</td><td>#91100-12</td><td>Usado para dissecação de tecido cerebral Ferramentas de</td></tr><tr><td>ciência fina</td> <td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>#16020-14</td><td>Usado para abrir o crânio para isolar o cérebro</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de 50 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#352070</td><td>Usado para coleta de tecido cerebral após isolamento</td></tr><tr><td>Pipetas de vidro Pasteur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#13-678-20C</td><td>Usado para aspiração de detritos celulares após spins de dextrano</td></tr><tr><td>Etanol, anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#459836</td><td>Usado para limpeza de moedor de tecidos; diluído a 70% com água</td></tr> <tr><td>destiladaTubos de ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>#41121703</td><td>Usado para ultracentrifugação de amostras</td></tr></tbody></table>

um método simples e reprodutível para preparar amostras de membrana de microvessels de cérebro de rato recém isoladas

A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

A barreira hemato - encefálica (BBB) é um tecido dinâmico barreira que responde a vários estímulos fisiopatológicos e farmacológicos. Tais alterações resultantes destes estímulos podem grandemente modulam a entrega da droga para o cérebro e, por extensão, causam consideráveis desafios no tratamento do sistema nervoso central (CNS) doenças. Muitas mudanças BBB que afetam a farmacoterapia, envolvem as proteínas que são localizadas e expresso a nível das células endoteliais. Com efeito, tal conhecimento sobre fisiologia do BBB na saúde e na doença gerou considerável interesse no estudo destas proteínas de membrana. Do ponto de vista de pesquisa de ciência básica, isto implica uma exigência para um método simples mas robusto e reprodutível para isolamento de microvessels de tecido cerebral, colhido em animais experimentais. Para preparar amostras de membrana de microvessels recentemente isolada, é essencial que os preparativos da amostra ser enriquecidos em células endoteliais mas limitados na presença de outros tipos de células da unidade neurovascular (i.e., astrócitos, micróglia, neurônios, pericitos). Um benefício adicional é a capacidade para preparar amostras de animais individuais, a fim de capturar a verdadeira variabilidade da expressão da proteína em uma população experimental. Neste manuscrito, detalhes a respeito de um método que é utilizado para isolamento de microvessels de cérebro de rato e preparação de amostras de membrana são fornecidos. Enriquecimento de Microvessel, de amostras derivadas, é conseguido usando quatro etapas de centrifugação onde dextrano é incluído no buffer de amostra. Este protocolo pode facilmente ser adaptado por outros laboratórios para suas próprias aplicações específicas. Amostras geradas a partir deste protocolo foram mostradas para produzir robustos dados experimentais de experimentos de análise de proteína que podem ajudar muito a compreensão das respostas BBB a estímulos fisiológicos, fisiopatológicos e farmacológicos.

O fluxo experimental para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana de microvessel é mostrado na Figura 1. Usando o procedimento aqui apresentado, é demonstrado sucesso isolamento de microvessels intacto de cérebro de rato (Figura 2A). Estes navios foram obtidos após a conclusão de centrifugação com dextran e imediatamente antes de iniciar a ultracentrifugação para preparar amostras...

Aqui, um método para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana é descrito. Este protocolo tem a clara vantagem de produzir microvessel enriquecido amostras com proteína aceitável de rendimento de animais individuais. Amostras podem ser usadas para as análises de proteína robusto no endotélio microvascular cerebral.

Um método simples e reprodutível para preparar amostras de membrana de Microvessels de cérebro de rato recém isoladas

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar microvasos cerebrais do cérebro de ratos para estudos bioquímicos destinados a entender as características moleculares da barreira hematoencefálica de mamíferos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na fisiologia da barreira hematoencefálica e neurofarmacologia, como regulação, localização e expressão de proteínas de junção apertada e transportadores endógenos na saúde e na doença. A principal vantagem dessa técnica é que podemos isolar um número suficiente de microvasos de alta qualidade de um animal individual, levando em consideração a variabilidade natural na expressão de proteínas entre animais individuais.Demonstrando essa técnica estará Bianca Reilly, uma excelente estudante de graduação do meu laboratório. Depois de sacrificar e decapitar um rato Sprague-Dawley de acordo com o protocolo de texto, use uma tesoura cirúrgica para ressecar a pele do crânio do rato, fazendo um único corte transversal. Usando rongeurs, remova cuidadosamente a placa do crânio e exponha o cérebro.Em seguida, com uma espátula, remova o órgão. Retire o cérebro e coloque o tecido cerebral isolado em um tubo cônico de 50 mililitros com cinco mililitros de BMB e 5,0 microlitros de coquetel inibidor de protease. Para processar o tecido, transfira-o para uma placa de Petri limpa.Em seguida, usando uma pinça, role suavemente o cérebro em um papel de filtro de 12,5 centímetros de diâmetro para remover as meninges externas, que estão frouxamente aderidas ao córtex cerebral. Durante esta etapa, deve-se tomar cuidado para garantir que todo o tecido meníngeo tenha sido removido da amostra de tecido cerebral. As meninges podem ser visualizadas como um tecido membranoso claro que pode ser facilmente afastado do tecido cerebral.Pressione suavemente o tecido cerebral contra o papel de filtro e enrole o tecido novamente, girando o papel de filtro com frequência durante esta etapa. Em seguida, usando uma pinça, separe o plexo coróide dos hemisférios cerebrais. Em seguida, alise suavemente o tecido cerebral novamente e use uma pinça para remover os bulbos olfatórios adjacentes à substância branca.Coloque o tecido cerebral cortical em uma argamassa de vidro gelada. Em seguida, adicione cinco mililitros de BMB com coquetel inibidor de protease. Usando um homogeneizador de potência aérea, insira um pilão no almofariz e homogeneize o tecido cerebral usando 15 movimentos para cima e para baixo a 3.700 rpm.Em seguida, despeje o homogeneizado em tubos de centrífuga rotulados. Entre as amostras, use etanol 70% para limpar o pilão. Para realizar a centrifugação, adicione 8,0 mililitros de solução de dextrano a 26% a cada tubo de centrífuga rotulado contendo homogeneizado cerebral.Inverta o tubo duas vezes e, em seguida, vortex completamente a amostra. Conduza o vórtice de cada amostra usando vários ângulos para garantir uma mistura completa da solução homogeneizada do cérebro com a solução de dextrano a 26%. Centrifugar as amostras a 5 000 g e a quatro graus Celsius durante 15 minutos.Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5,0 mililitros de BMB com coquetel de inibidor de protease. Em seguida, vortex o pellet para garantir uma mistura completa. Em seguida, adicione 8,0 mililitros de 26% de dextrano a cada tubo de centrífuga e vórtice como acabamos de demonstrar.Em seguida, centrifugue novamente as amostras. Usando um frasco de vácuo e uma pipeta de vidro, aspire o sobrenadante e certifique-se de que o pellet contendo o microvaso cerebral não seja interrompido. Ressuspenda o pellet em BMB com inibidor de protease e, em seguida, 26% de dextrano mais duas vezes.Após a centrifugação final, adicione 5,0 mililitros de BMB a cada pellet e vórtice para ressuspender a amostra. Usando o protocolo demonstrado neste vídeo, foi realizado o isolamento bem-sucedido de microvasos intactos do cérebro de ratos. Nesta imagem, o microvaso é corado usando um anticorpo contra Oatp1a4, um transportador que é bem expresso na membrana plasmática das células endoteliais microvasculares cerebrais.Conforme demonstrado pelo western blot, as preparações de membrana de microvasos colhidos de ratos Sprague-Dawley fêmeas foram enriquecidas em PECAM-1, também conhecido como CD31, uma proteína marcadora da microvasculatura cerebral. Durante a otimização deste protocolo, o enriquecimento de PECAM foi observado em amostras de membrana preparadas usando duas e quatro etapas de centrifugação com dextrana. Conforme determinado pelo ensaio de proteína de Bradford e listado nesta tabela, as preparações de membrana normalmente produzem concentrações de proteína que variam entre 5,0 miligramas por mililitro e 10,0 miligramas por mililitro.Os valores de proteína foram determinados com base em uma curva padrão que foi gerada usando BSA como padrão. Mostrado aqui, é um western blot para a proteína de transporte BBB Glut1. Bandas simples claras a 54 kilodaltons foram detectadas para esta proteína BBB altamente expressa em cada amostra de membrana.Este gráfico ilustra uma maior expressão de Glut1 na BHE em ratos machos versus fêmeas. Não foi observada diferença na expressão da ATPase de sódio/potássio entre animais machos e fêmeas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a 2 horas e meia se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todas as amostras no gelo durante todo o protocolo e tomar cuidado ao aspirar o sobrenadante do pellet de microvasos após as etapas de centrifugação. Após esse procedimento, outros métodos, como a análise de co-imunoprecipitação, podem ser realizados em amostras de microvasos para responder a perguntas adicionais, como a associação de diferentes proteínas dentro do mesmo complexo proteico na barreira hematoencefálica. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da fisiologia da barreira hematoencefálica e neurofarmacologia explorarem as características moleculares da barreira hematoencefálica na saúde e em modelos de roedores de doenças neurológicas.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar microvasos de alta qualidade do cérebro de ratos para seus próprios estudos da biologia da barreira hematoencefálica na saúde e na doença.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo apresenta o isolamento de microvasos de um cérebro de rato usando uma combinação de centrifugação de gradiente de densidade e métodos de digestão enzimática. Os microvasos isolados podem ser cultivados em frasco de cultura pré-revestido com matriz de colágeno e fibronectina para obtenção de colônias de células endoteliais.

Cultura de células endoteliais de microvasos cerebrais de ratos: um procedimento para isolar e cultivar células endoteliais de microvasos de cérebro de ratos

Este vídeo demonstra o isolamento de vasos intactos do cérebro de um camundongo que constituem a barreira hematoencefálica (BBB) junto com neurônios e células gliais. Os vasos isolados podem ser usados como um modelo in vitro para estudar seu papel na manutenção da homeostase cerebral.

Isolando vasos cerebrais de camundongos: um protocolo para isolar vasos intactos de amostras de cérebro murino

Este vídeo demonstra um método para isolar e cultivar microglia de cérebros de ratos. Envolve a separação da microglia de outras células neuronais e não neuronais usando placas revestidas com um anticorpo monoclonal específico para a microglia.

Isolamento e cultura de microglia de cérebros de ratos usando meios sem soro

Este vídeo demonstra o processo de isolamento de microvasos cerebrais de ratos sacrificados. Inclui a dissecção do cérebro, limpeza do tecido e digestão mecânica, seguida de centrifugação repetida para isolar a fração pura dos microvasos.

Um método para o isolamento de unidades neurovasculares do cérebro de ratos

Este vídeo demonstra a dissociação do tecido cerebral de rato congelado em uma suspensão unicelular usando digestão enzimática e trituração mecânica. As células preparadas são fixadas e permeabilizadas com etanol para aplicações a jusante, como citometria de fluxo ou análise de expressão gênica.

Obtenção de uma suspensão unicelular de tecido cerebral de rato congelado

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

Descrevemos um protocolo que permite a purificação do compartimento vascular do cérebro do camundongo. Os vasos cerebrais isolados incluem células endoteliais ligadas por junções apertadas e cercadas por uma lâmina basal contínua, pericitos, células musculares lisas vasculares, bem como membranas astrogliais perivasculares.

Purificação de embarcações do cérebro do rato

Demonstrado aqui são protocolos para isolar (1) recém endoteliais cerebrais intactos "tubos" e medições (2) simultâneas de cálcio endotelial e potencial durante o endotélio-derivado hiperpolarização de membrana. Além disso, esses métodos permitem a otimização farmacológica de cálcio da célula endotelial e sinalização eléctrica como variáveis experimentais individuais ou interativas.

Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Nós descrevemos procedimentos para processar o tecido recém-nascido do cérebro do rato para obter micrografias de elétron high-resolution para a Análise morfométrica da distribuição sináptica do vesícula em terminais do nervo. As micrografias obtidas com esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia de uma série de outros componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais.

Preparação do tecido cerebral de rato recém-nascido para Análise morfométrica ultraestrutural da distribuição de vesículas sinápticas em terminais nervosos

O objetivo deste protocolo é isolar microvasos de várias regiões do sistema nervoso central de vertebrados lissencefálicos e girofálicos.

Isolamento confiável de micronavios do sistema nervoso central em cinco grupos de vertebrados

Apresentamos um protocolo para a extração de pericitos cerebrais murina. Baseado em uma extração pericyte orientada para enriquecimento livre de antibióticos, este protocolo é uma ferramenta valiosa para estudos in vitro que fornecem alta pureza e alto rendimento, diminuindo assim o número de animais experimentais usados.

Um método de alta saída para isolar pericites cerebrais do rato

Aprenda a isolar microvasos cerebrais de ratos para estudos bioquímicos da barreira hematoencefálica. Este método permite análises proteicas de alta qualidade em animais individuais, facilitando pesquisas em neurofarmacologia.

Um método simples e reprodutível para preparar amostras de membrana de Microvessels de cérebro de rato recém isoladas

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