Um método simples e reprodutível para preparar amostras de membrana de Microvessels de cérebro de rato recém isoladas

O objetivo geral deste procedimento é isolar microvasos cerebrais do cérebro de ratos para estudos bioquímicos destinados a entender as características moleculares da barreira hematoencefálica de mamíferos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na fisiologia da barreira hematoencefálica e neurofarmacologia, como regulação, localização e expressão de proteínas de junção apertada e transportadores endógenos na saúde e na doença. A principal vantagem dessa técnica é que podemos isolar um número suficiente de microvasos de alta qualidade de um animal individual, levando em consideração a variabilidade natural na expressão de proteínas entre animais individuais.

Demonstrando essa técnica estará Bianca Reilly, uma excelente estudante de graduação do meu laboratório. Depois de sacrificar e decapitar um rato Sprague-Dawley de acordo com o protocolo de texto, use uma tesoura cirúrgica para ressecar a pele do crânio do rato, fazendo um único corte transversal. Usando rongeurs, remova cuidadosamente a placa do crânio e exponha o cérebro.

Em seguida, com uma espátula, remova o órgão. Retire o cérebro e coloque o tecido cerebral isolado em um tubo cônico de 50 mililitros com cinco mililitros de BMB e 5,0 microlitros de coquetel inibidor de protease. Para processar o tecido, transfira-o para uma placa de Petri limpa.

Em seguida, usando uma pinça, role suavemente o cérebro em um papel de filtro de 12,5 centímetros de diâmetro para remover as meninges externas, que estão frouxamente aderidas ao córtex cerebral. Durante esta etapa, deve-se tomar cuidado para garantir que todo o tecido meníngeo tenha sido removido da amostra de tecido cerebral. As meninges podem ser visualizadas como um tecido membranoso claro que pode ser facilmente afastado do tecido cerebral.

Pressione suavemente o tecido cerebral contra o papel de filtro e enrole o tecido novamente, girando o papel de filtro com frequência durante esta etapa. Em seguida, usando uma pinça, separe o plexo coróide dos hemisférios cerebrais. Em seguida, alise suavemente o tecido cerebral novamente e use uma pinça para remover os bulbos olfatórios adjacentes à substância branca.

Coloque o tecido cerebral cortical em uma argamassa de vidro gelada. Em seguida, adicione cinco mililitros de BMB com coquetel inibidor de protease. Usando um homogeneizador de potência aérea, insira um pilão no almofariz e homogeneize o tecido cerebral usando 15 movimentos para cima e para baixo a 3.700 rpm.

Em seguida, despeje o homogeneizado em tubos de centrífuga rotulados. Entre as amostras, use etanol 70% para limpar o pilão. Para realizar a centrifugação, adicione 8,0 mililitros de solução de dextrano a 26% a cada tubo de centrífuga rotulado contendo homogeneizado cerebral.

Inverta o tubo duas vezes e, em seguida, vortex completamente a amostra. Conduza o vórtice de cada amostra usando vários ângulos para garantir uma mistura completa da solução homogeneizada do cérebro com a solução de dextrano a 26%. Centrifugar as amostras a 5 000 g e a quatro graus Celsius durante 15 minutos.

Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5,0 mililitros de BMB com coquetel de inibidor de protease. Em seguida, vortex o pellet para garantir uma mistura completa. Em seguida, adicione 8,0 mililitros de 26% de dextrano a cada tubo de centrífuga e vórtice como acabamos de demonstrar.

Em seguida, centrifugue novamente as amostras. Usando um frasco de vácuo e uma pipeta de vidro, aspire o sobrenadante e certifique-se de que o pellet contendo o microvaso cerebral não seja interrompido. Ressuspenda o pellet em BMB com inibidor de protease e, em seguida, 26% de dextrano mais duas vezes.

Após a centrifugação final, adicione 5,0 mililitros de BMB a cada pellet e vórtice para ressuspender a amostra. Usando o protocolo demonstrado neste vídeo, foi realizado o isolamento bem-sucedido de microvasos intactos do cérebro de ratos. Nesta imagem, o microvaso é corado usando um anticorpo contra Oatp1a4, um transportador que é bem expresso na membrana plasmática das células endoteliais microvasculares cerebrais.

Conforme demonstrado pelo western blot, as preparações de membrana de microvasos colhidos de ratos Sprague-Dawley fêmeas foram enriquecidas em PECAM-1, também conhecido como CD31, uma proteína marcadora da microvasculatura cerebral. Durante a otimização deste protocolo, o enriquecimento de PECAM foi observado em amostras de membrana preparadas usando duas e quatro etapas de centrifugação com dextrana. Conforme determinado pelo ensaio de proteína de Bradford e listado nesta tabela, as preparações de membrana normalmente produzem concentrações de proteína que variam entre 5,0 miligramas por mililitro e 10,0 miligramas por mililitro.

Os valores de proteína foram determinados com base em uma curva padrão que foi gerada usando BSA como padrão. Mostrado aqui, é um western blot para a proteína de transporte BBB Glut1. Bandas simples claras a 54 kilodaltons foram detectadas para esta proteína BBB altamente expressa em cada amostra de membrana.

Este gráfico ilustra uma maior expressão de Glut1 na BHE em ratos machos versus fêmeas. Não foi observada diferença na expressão da ATPase de sódio/potássio entre animais machos e fêmeas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a 2 horas e meia se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todas as amostras no gelo durante todo o protocolo e tomar cuidado ao aspirar o sobrenadante do pellet de microvasos após as etapas de centrifugação. Após esse procedimento, outros métodos, como a análise de co-imunoprecipitação, podem ser realizados em amostras de microvasos para responder a perguntas adicionais, como a associação de diferentes proteínas dentro do mesmo complexo proteico na barreira hematoencefálica. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da fisiologia da barreira hematoencefálica e neurofarmacologia explorarem as características moleculares da barreira hematoencefálica na saúde e em modelos de roedores de doenças neurológicas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar microvasos de alta qualidade do cérebro de ratos para seus próprios estudos da biologia da barreira hematoencefálica na saúde e na doença.