Avaliação da viabilidade de um consórcio bacteriano sintético na Interface Host-micróbio em Vitro Gut

Este modelo é o próximo passo na definição de microdireções do hospedeiro para o trato digestivo superior. Está permitindo abordar questões de pesquisa mecanicista e oferece muitas oportunidades para a indústria alimentícia, farmacêutica e nutracêutica e também toxicologia. A principal vantagem dessa técnica é que ela combina um modelo do sistema gastrointestinal com a microinterface do hospedeiro, incluindo uma comunidade microbiana complexa.

É muito aplicável e também muito flexível. Essa metodologia pode ser adotada usando outros tipos de células para avaliar a viabilidade do patógeno e informações subsequentes. As alterações também podem ser usadas para auxiliar a capacidade de colonização de misturas probióticas e, finalmente, o efeito potencial das bactérias na circulação sistêmica.

Para começar, autoclave o meio e, em seguida, adicione cinco microgramas por mililitro de hemen e um micrograma por mililitro de menadiona. Dispense nove mililitros do meio em tubos Hungate e feche os tubos com uma rolha de borracha e uma tampa de alumínio. Em seguida, lave os tubos com uma mistura de 90% de nitrogênio e 10% de dióxido de carbono.

Use a seringa para recuperar um mililitro de meio anaeróbico e transfira-o para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Escolha colônias únicas de cada espécie bacteriana e ressuspenda-as no meio. Em seguida, transfira as colônias para o BHI modificado anaeróbico e incube-as a 37 graus Celsius por 48 horas.

Após a incubação, use PBS esterilizado filtrado para diluir as culturas para 10 a quinta células por mililitro. Em seguida, use a citometria de fluxo com a coloração de iodeto de propídio verde cibernético para medir o número de células. Avaliar a composição e viabilidade da comunidade do microbioma é essencial para evitar vieses em nosso experimento.

Remova o meio de cultura de células dos frascos e use cinco mililitros de PBS sem cálcio ou magnésio para lavar as células uma vez. Adicione dois mililitros de solução de tripsina EDTA às células. Distribuir a solução movendo suavemente o balão.

Em seguida, remova 1,5 mililitros da solução de tripsina e incube o frasco a 37 graus Celsius por 10 minutos. Depois de verificar ao microscópio se as células se desprenderam, adicione cinco mililitros de meio de cultura de células suplementado ao frasco para inativar a tripsina e pipete para cima e para baixo para obter uma suspensão homogênea de célula única. Misture imediatamente uma alíquota de 50 microlitros da suspensão celular com solução estéril de azul de tripano a 0,4% em uma proporção de volume a volume de 1:1 para células KCO2 para um volume de 1:5 para HT29MTX.

Misturar pipetando e colocar a suspensão numa câmara de contagem antes de contar as células ao microscópio. Depois de preparar as suspensões de células KCO2 e HT29MTX de acordo com o protocolo de texto, homogeneizar as suspensões e adicionar o volume correspondente de células KCO2 e HT29MTX a um recipiente estéril pré-preenchido com meio de cultura celular suplementado. Aspirar o meio pré-incubado do lado apical da câmara previamente preparada.

Misture suavemente a suspensão celular por pipetagem e transfira 1,5 mililitros para o compartimento apical das inserções da câmara, misturando a suspensão celular a cada um ou três poços para garantir uma homogeneização constante. Mova suavemente as placas para frente e para trás e depois da direita para a esquerda para espalhar uniformemente as células no poço. Transfira as placas para a incubadora e repita o movimento das placas.

A localização das células precisa ser feita com homogeneização constante da suspensão celular para garantir uma distribuição uniforme no poço. Para medir a integridade da barreira epitelial antes de iniciar o ASA, certifique-se de que o equipamento da camada esteja totalmente carregado antes de iniciar as medições. Desconecte o equipamento da fonte de alimentação e cubra com um saco plástico de autoclave.

Faça um furo no saco para introduzir o eletrodo na porta de entrada do medidor. Em seguida, pulverize o saco com etanol 70% antes de transferir o equipamento de camada para o gabinete de fluxo. Para desinfetar o eletrodo, mergulhe as pontas do eletrodo em etanol a 70% por 15 minutos.

Deixe as pontas secarem ao ar por 15 segundos e, em seguida, use meio de cultura de células para enxaguar o eletrodo. Deixe as células atingirem a temperatura ambiente dentro do gabinete de fluxo. Certifique-se de que o medidor esteja desconectado do carregador, coloque a chave de modo em Ohms e ligue a chave liga/desliga.

Meça a resistência da célula imergindo o eletrodo com a ponta mais curta no inserto e a ponta mais longa fora do poço. Mantenha o eletrodo em um ângulo de 90 graus em relação ao inserto da placa. Para simular a digestão oral, transfira três mililitros da comunidade bacteriana em um tubo estéril de 50 mililitros e misture com três mililitros de fluido de saliva simulado ou SSF.

Adicione 75 unidades por mililitro de alfa-amilase da saliva humana tipo 9A e dois gramas por litro de mucina do estômago suíno tipo 2. Incube a mistura a 37 graus Celsius e 100 RPM por dois minutos. Colete uma amostra de dois mililitros para extração de DNA e quantificação por citometria de fluxo.

Para simular a digestão gástrica, adicione quatro mililitros de fluido gástrico simulado ou SGF a três mililitros da bactéria. Use um HCl molar para ajustar o pH para três, se necessário. Incubar a amostra a 37 graus Celsius e 100 RPM por dois minutos.

Em seguida, colete uma amostra de dois mililitros. Para digestões do intestino delgado, adicione quatro mililitros de fluido intestinal simulado ou SIF às bactérias. Use hidróxido de sódio para ajustar o pH, se necessário.

Em seguida, incube a amostra a 37 graus Celsius e 100 RPM por dois minutos. E colete uma amostra de dois mililitros. Depois de lavar e ajustar a densidade celular da digestão do intestino delgado de acordo com o protocolo de texto, remova o meio apical do sistema transwell e adicione 1,5 mililitros da suspensão bacteriana.

Co-cultura do sistema em condições gerais de cultura de células por duas horas. Após a incubação, meça os valores de nível para avaliar a integridade da barreira epitelial, conforme demonstrado anteriormente no vídeo. Adicione 0,5 mililitros de n-acetilcisteína 10 milimolares e HPSS para solubilizar o muco produzido pelo HT29MTX e recuperar as bactérias aderidas.

Incubar as placas a 37 graus Celsius durante uma hora sob agitação. Recupere o NAC HPSS em um tubo de microcentrífuga e use um mililitro de DPBS para lavar as células duas vezes. Adicione 0,5 mililitros de 0,5% triton-x100 em cima das monocamadas e interrompa as células pipetando.

Em seguida, recupere rapidamente o líquido em vórtice por um minuto. A velocidade é crucial para evitar danificar as células bacterianas com o detergente. Analise as amostras de acordo com o protocolo de texto.

Conforme relatado aqui, as contagens de células intactas de cepas individuais eram de aproximadamente 10 a oitava células por mililitro antes da criação da comunidade sintética, enquanto o microcosmo multiespécie continha mais de 90% de células viáveis durante o estabelecimento da comunidade. Com base na quantificação de mortos-vivos, a viabilidade bacteriana diminui após cada etapa da digestão como resultado do pH ácido durante a passagem gástrica e dos bio-sais contidos nos fluidos de digestão do intestino delgado. As condições adversas da digestão do estômago e do intestino delgado podem transformar as bactérias em células viáveis, mas não em células cultiváveis, que são bactérias vivas que não crescem ou se dividem.

Conforme demonstrado nesta figura, as células viáveis recuperadas da interface mucosa são coloridas em azul no gráfico de citometria de fluxo. No entanto, nenhum crescimento foi observado quando essas amostras de muco estavam em plaqueamento. A fração em que as bactérias apresentam maiores taxas de viabilidade são os detritos celulares revelados pela contagem de placas.

O número de colônias pode ser variável, mas a presença de bactérias metabolicamente ativas é encontrada nas amostras menos diluídas. Após esse desenvolvimento, essa técnica poderá ser utilizada por pesquisadores das áreas de nutrigenômica ou farmacomicrobiômica para estudar microcosmicamente o hospedeiro. Seguindo este protocolo, outras técnicas como transcriptoma ou análise metabólica podem ser realizadas para obter compreensão mecanicista no processo de colonização bem-sucedido de acordo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como estabelecer um modelo in vitro complexo representativo dos processos digestivos, incluindo a conversa cruzada entre as células hospedeiras e o resto do microbioma. Não se esqueça de que trabalhar com bactérias patogênicas pode ser extremamente perigoso e é importante considerar as precauções de biossegurança.