Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da endocrinologia, bem como no campo da neurociência, como nossa pesquisa para revisar as respostas do cérebro aos sinais endócrinos. A principal vantagem dessa técnica é que você pode examinar os efeitos diretos dos sinais endócrinos no cérebro separados de outros tecidos. Para iniciar este procedimento, use uma pinça para arranhar o centro inferior de uma placa de cultura de plástico para criar um amassado para facilitar a montagem do gânglio ventral do cérebro larval após a dissecção.

Com um palito de dente, coloque uma pequena gota de supercola em ambos os lados do amassado e prenda uma haste de tungstênio na cola. Em seguida, usando um pequeno pedaço de adesivo reutilizável semelhante a massa, faça uma parede circular ao redor do amassado. Para dissecar o cérebro larval, 90 a 120 horas após a postura dos ovos, colete as larvas e lave-as pelo menos três vezes com água destilada para remover os restos de comida aderentes.

Em seguida, coloque uma larva em um vidro de relógio quadrado de uma polegada e meia cheio de PBS gelado. Use uma pinça para agarrar suavemente a parte do meio da larva. Use outro par de pinças para agarrar e puxar os ganchos da boca suavemente para separar a parte anterior da larva que contém o cérebro do resto do corpo.

Em seguida, segure a ponta anterior com a pinça e vire a larva do avesso. Remova os tecidos estranhos ligados ao cérebro, como discos imaginários, corpos gordurosos e glândula anelar. Separe suavemente o cérebro das partes da boca.

Em seguida, aplique 200 microlitros de PBS no interior do anel adesivo preparado anteriormente na câmara de imagem. Sugue suavemente o cérebro dissecado com PBS em uma pipeta Pasteur e transfira-o para a câmara de imagem. Na câmara de imagem, pegue as fibras musculares que se estendem dos gânglios ventrais e insira o cérebro suavemente no dente sob o fio de tungstênio.

Em seguida, puxe o fio de tungstênio ligeiramente para cima para colocar o cérebro na posição correta para a imagem. Para adquirir imagens de fluorescência de cálcio, coloque a câmara de imagem contendo o explante cerebral sob o microscópio. Abaixe a lente objetiva até que ela toque o PBS e, sob iluminação de campo claro, posicione o cérebro e coloque-o em foco.

Mude para luz fluorescente e ajuste o foco nas células marcadas com sucesso GCaMP. Inicie a aquisição a 250 ms/quadro, com resolução de 512 x 512 pixels no modo refrigerado a água. Em seguida, ajuste o tempo de exposição para obter os valores de fluorescência dentro da faixa dinâmica da câmera CCD, mas não inferior a 1000 unidades arbitrárias com imagens de 16 bits.

Uma vez que os parâmetros de imagem são determinados, tire as imagens por um minuto antes da administração do peptídeo para detectar intensidades de sinal basais. Em seguida, aplique o peptídeo de teste diretamente, pipetando 100 microlitros da solução peptídica preparada no banho larval. Registre a emissão de sucesso do GCaMP por alguns minutos.

Para analisar os dados, abra o software de análise e use o primeiro quadro que estava antes da aplicação do peptídeo como imagem de referência. Em seguida, selecione Plugins, TurboReg. Escolha o arquivo de imagem serial como Origem e a imagem de referência como Destino.

Em seguida, verifique Corpo Rígido e Preciso para o método de processamento e qualidade, respectivamente. Em seguida, clique em Lote para iniciar o processamento da imagem. Selecione várias regiões de interesse usando Analisar, Ferramentas, Gerenciador de ROI, na bandeja de imagens.

Em seguida, meça a intensidade do pixel clicando em Mais, Multimedida, OK, na janela ROI Manager. Neste experimento, o cérebro do tipo selvagem foi exposto a CCHa2, grelina e nociceptina, enquanto o cérebro mutante do receptor CCHa2 foi exposto a CCHa2. Os sinais de GCaMP6 em células produtoras de insulina foram detectados por microscopia confocal a 250 ms / quadro, e aqui estão as imagens estáticas de pontos de tempo selecionados.

A razão entre a mudança da intensidade do ROI e a intensidade do sinal da linha de base em cada ponto de tempo foi plotada. As ROIs foram definidas em corpos celulares que foram detectados no mesmo plano focal. As linhas sólidas indicam a média de cinco a 10 amostras, e as linhas pontilhadas marcam os limites superior e inferior do erro padrão da média.

As áreas sombreadas indicam a variação dos sinais nos experimentos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em uma hora, se for pré-executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar a amostra de cérebro rapidamente, para evitar danos a ela.

Este procedimento pode ser combinado com a genética para responder a perguntas adicionais, como a especificidade do receptor. O sistema utilizado neste protocolo é fácil de preparar e reutilizável. Assim, este protocolo será útil para, como na triagem.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de endocrinologia e neurociência explorarem redes hormonais que controlam a função cerebral em Drosophila.