Name: Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Aprenda a realizar imagem de cálcio ex vivo em cérebros de Drosophila para estudar respostas neuronais a sinais endócrinos. Este método permite analisar efeitos diretos de hormônios no cérebro separados de outros tecidos.

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Este trabalho foi apoiado pelo Grants-in-Aid para pesquisa científica (15K 07147, 17K 07419) de JSPS (para Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), uma bolsa de investigação Inamori Foundation (para HI) e o programa de centro de uso/pesquisa conjunta para medicina do desenvolvimento, em o Instituto de embriologia Molecular e genética, Universidade de Kumamoto (para HS). Agradecemos o Dr. Azusa Kamikouchi e Sr. Daichi Yamada por sua ajuda na utilização do sistema de imagem.

1. preparação do cérebro Larval explantes
<ol><li>Fazer uma câmara de imagens. Nota: A gravação estável requer que os explantes de cérebro estar amarrados. Aqui, uma câmara de imagem de baixo custo, feito à mão é usada no Ca2 + sistema de imagem.<ol>
<li>Usando fórceps, arranhe o fundo centro de um prato de cultura plástico (35 x 10 mm) para criar um dente para o gânglio ventral do cérebro larval tornando a montagem mais fácil (etapa 1.3, Figura 1).</li>
		<li>Com um palito de dente, coloque uma pequena gota de cola em ambos os lados do dent e anexar uma vareta de tungstênio (0,125 mm de diâmetro, 6 a 7 mm de comprimento) para a colagem.</li>
		<li>Usando um pequeno pedaço de massa-como adesivo reutilizável, fazer uma parede circular (10 mm de diâmetro e 3 mm de altura) ao redor do dente (Figura 1). Nota: O espaço dentro da parede será posteriormente preenchido com solução salina tamponada fosfato (PBS; 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M PO4-3, pH 7,4 ± 0,05 a 25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de animais Nota: Para a imagem latente de cálcio, um indicador de cálcio, GCaMP6s, é expressa no tipo de célula de interesse, que é comumente alcançado usando combinações de tecido-específica GAL4 e UAS-GCaMP6s. Para garantir que o sinal é mediado pelo receptor de candidato, GCaMP6s também é expresso em um mutante com defeito no receptor.<ol>
<li>Quando comparações experimentais para genótipos diferentes tais como o tipo selvagem e mutantes são necessárias, larvas de teste de partida de idade para evitar GCaMP6 expressão nível de variações e diferenças fisiológicas devido aos estádios de desenvolvimento.</li>
		<li>Espantar moscas parentais (30 moscas para cada sexo) em um frasco de cultura contendo o padrão alimentar voar para 8 h permitir que a postura de ovos na superfície do alimento. Larvas de cultura de massa, sob um ciclo claro-escuro de 12-h em 25 ° C e 60-70% de umidade relativa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissecação do cérebro larval<ol>
<li>A 90-120 h após (AEL) de postura de ovos, coletar larvas e lavá-los pelo menos 3 vezes com água destilada para remover os resíduos de comida aderentes.</li>
		<li>Lugar uma larva em um vidro de relógio quadrado 1,5 polegadas cheio de gelo frio PBS. Nota: Nas duas próximas etapas são realizadas neste vidro de relógio sob o microscópio de dissecação.</li>
		<li>Use pinças para agarrar delicadamente o parte do meio da larva. Use outra pinça para agarrar os ganchos da boca e puxar os ganchos de boca suavemente para separar a parte anterior da larva que contém o cérebro do resto do corpo. Nota: Como alternativa, uma tesoura cirúrgica pode ser usada.</li>
		<li>Segure a ponta anterior por fórceps e virar do avesso a larva. Remova tecido externos conectado ao cérebro, como discos imaginária, corpos de gordura e glândula de anel. Suavemente separa o aparelho bucal do cérebro.</li>
		<li>Aplicam-se 200 µ l de PBS no interior do anel feito de massa de vidraceiro, como adesivo reutilizável na câmara de imagens. Chupar suavemente o cérebro dissecado com PBS para uma pipeta Pasteur e então transferi-lo para a câmara de imagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configuração do cérebro para a câmara de imagem<ol>
<li>Use a pinça para pegar fibras musculares, estendendo-se desde os gânglios ventrais. O cérebro suavemente Insira o dente debaixo do fio de tungstênio.</li>
		<li>Usando outra pinça, puxe o fio de tungstênio ligeiramente até colocar o cérebro na posição correta para a imagem (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. aquisição de imagens de fluorescência do Ca2 +
Nota: Explantes cérebro imergidos em PBS são fotografadas usando um microscópio de fluorescência, equipado com uma lente objetiva de imersão de água de 20x (N.A. = 0,5). PBS não ativa as células do cérebro. Se forem necessárias imagens do eixo z, a lente objetiva é montada com um motor de lente piezoelétrico ativado. Uma cabeça confocal de disco giratório é usada para aumentar o tempo de resolução. Para a imagem latente de pouca luz, um elétron multiplicando o dispositivo de carga acoplada câmera é montado no microscópio. A imagem latente de fluorescência GCaMP6s (excitação/emissão: 488/509 nm) requer um laser de 488 nm para a excitação com um divisor de feixe dicroicas e um filtro de emissão (ex., 528 filtro de passa-banda de banda ± 38 nm).
<ol><li>Coloque a câmara de imagem que contém o cérebro explante sob o microscópio.</li>
	<li>Baixe a lente objetiva até que toca a PBS. Sob a iluminação de campo claro, posicione o cérebro e trazê-lo em foco. Interruptor de luz fluorescente e ajustar o foco sobre as células GCaMP6s-rotulados. Nota: A fluorescência verde basal do GCaMP6s deve ser visível.</li>
	<li>Iniciar a aquisição de 250 ms/moldura em uma resolução de 512 × 512 pixels no modo Water-cooled, usando o software de aquisição apropriado (ex., µManager). Ajuste o tempo de exposição para obter valores de fluorescência dentro do intervalo dinâmico da câmera CCD, mas não inferior a 1000 (unidades arbitrárias), com imagens de 16 bits (0-65.535 de gama dinâmica). Nota: Um tempo de exposição baixo deve ser usado para minimizar a foto-branqueamento do GCaMP6s. Tempo de exposição deve ser otimizado em cada experimento, pois depende dos níveis de expressão de GCaMP6 e a sensibilidade do sistema de detecção. Foi a 100 ms em nosso experimento usando dilp2 > GCaMP6s. Quando z-seções são necessárias para uma determinada profundidade de imagem, várias imagens de z-seção podem ser adquiridas dependendo os intervalos de tempo e quadro de exposição. Se a câmera tem suficiente resolução espacial, o tamanho binning (número de registros no chip que vai ser guardado em um pixel digital) deve ser aumentado para reduzir o tempo de exposição.</li>
	<li>Uma vez que os parâmetros de imagem são determinados, com imagens para 1 min antes da administração de peptídeo para detectar intensidades de sinal de linha de base (F0).</li>
	<li>Aplicar o teste de peptídeo; para isso, dissolver 100 µ l de solução de peptídeo em PBS e pipetar isso diretamente para o banho larval para produzir uma concentração ideal. Nota: A solução de peptídeo deve ser injetada lentamente (por exemplo, fluxo taxa 20 µ l/s) para a solução de banho com uma pipeta. Independente peptídeo sintético dissolvido em PBS é usado como um controle negativo.</li>
	<li>Registro da emissão de GCaMP6s por alguns minutos.</li>
</ol>3. análise de dados
Nota: Dados de imagem são analisados off-line com o ImageJ. Durante a lapso de tempo de imagem, pipetagem faz com que o cérebro larval mover. Portanto, aberrações posicionais das imagens seriais devem ser corrigidas antes da análise. A correção pode ser realizada usando um ImageJ plug-in, TurboReg da seguinte maneira.
<ol><li>Abra o software de análise e usar o primeiro quadro (antes da aplicação do peptide) como uma imagem de referência.</li>
	<li>Selecione Plugins | Registo | TurboReg.</li>
	<li>Escolha o arquivo de imagem serial como a fonte e a imagem de referência como o alvo.</li>
	<li>Verifique Corpo rígido (paralelo deslocamento e rotação de imagens) e precisos ("Rápido" é grosseiro mas rápida análise em vez disso) para o método de processamento e qualidade, respectivamente.</li>
	<li>Clique em lotes para iniciar o processamento de imagem.</li>
	<li>Selecione várias regiões de interesse (ROIs) usando Analyze | Ferramentas | Gerente de ROI no ImageJ.</li>
	<li>Medir a intensidade do pixel clicando mais | Medida de multi | Okey na janela Gerenciador de ROI.</li>
	<li>Calcular ΔF/F0 = (F - F0) f0, onde F é a intensidade ROI no momento do estímulo, e F0 é a intensidade em uma janela de tempo imediatamente antes de um evento experimental particular (por exemplo, 30 frames precedendo o aparecimento de estímulo).</li>
	<li>Repita a experiência usando várias amostras de cérebro, realizando o tratamento estatístico para obter a média e o erro padrão da média (SEM) em cada ponto de tempo.</li>
</ol>

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<li>Sabado, V. aN., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Resolution+Fluorescence+Live+Imaging+of+Drosophila+Circadian+Clocks+in+Larval+Brain+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 131, e57015(2018).</li>
<li>Apostolopoulou, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193(2016).</li>
<li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li>
<li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O Ca2 + imagem método descrito aqui é um sistema útil para testar o funcionamento dos hormônios no cérebro. In vivo, o cérebro recebe hormônios de vários órgãos do sistema endócrino. Além disso, o cérebro constantemente vê crescente de informações sensoriais, que provoca a ativação neuronal espontânea. Este sistema ex vivo elimina tal ruído e produz uma relação sinal/ruído melhor do que na vivo de imagem. Neste sistema, as moléculas podem ser testadas isoladamente ou em combinação. A...

Órgão-órgão-a comunicação é uma estratégia evolutivamente conservada para manter a homeostase para lidar com as mudanças ambientais. Em humanos, uma variedade de arereleased de hormônios das glândulas endócrinas na circulação. Muitos desses hormônios como alvo o hipotálamo do cérebro, que regula os processos metabólicos e comportamentos fundamentais tais como alimentação1,2. Muitos hormônios foram descobertos usando modelos de mamíferos. No entanto, os mecanismos de sua ação, especialmente as redes interorgan, em que participem, permanecem em grande parte obscuro.
Drosophila melanogaster emergiu como um modelo útil para estudar órgão-para-órgão comunicação. Em insetos, muitos processos fisiológicos são controlados pelos hormônios. Primeiros estudos centrada no crescimento e metamorfose usado grandes insetos. Nesses estudos, a remoção ou transplante de órgãos específicos previu a existência de moléculas sinalizadoras órgãos inter; mais tarde, hormônio juvenil (JH), hormônio Prothoracicotropic (PTTH) e isoinokosterone foram bioquimicamente purificada3,4,5. Uma grande família de peptídeos de sinalização intercelulares é pensada para ser envolvido em vários eventos fisiológicos durante o ciclo de vida de inseto6,7. A maioria destes peptídeos atuam sobre G-receptores (GPCRs), embora os GPCRs específicos foram inicialmente difícil identificar abordagens convencionais. A publicação do genoma de Drosophila sequência8 foi a descoberta que permitiu a identificação de peptídeos bioativos de Drosophila baseada sua homologia aos encontrados em outros insetos. Além disso, identificaram-se os receptores para vários péptidos de GPCRs previstos no genoma usando ensaios de ligação GPCR-ligante cell-cultura-based. Em seguida, as análises de expressão previram os caminhos de órgão-para-órgão eliciados estes peptídeos e receptores. Notavelmente, muitos dos receptores de peptídeos putativos são expressos no cérebro, sugerindo que o cérebro é um alvo principal do peptídeo hormônios9. Além disso, as ferramentas avançadas de genéticas em Drosophila têm contribuído para a identificação de funções fisiológicas das combinações de peptídeo-GPCR. Por exemplo, a GAL4 e LexA-baseado sistemas binários transcriptional permitem knockdown do gene ou superexpressão de forma controlada espacial e temporalmente. GAL4, um fator de transcrição identificado no fermento, vincula-se a uma sequência de cis-regulamentação específica denominada sequência de ativação Upstream (UAS). No sistema GAL4/UAS, linha excitador fornece tecido-específica ou expressão de GAL4 estágio específico e a linha de respondente carrega UAS montante do gene de interesse ou a construção, a expressão de shRNA de unidade. LexA/LexAop sistema é baseado em um mecanismo semelhante. Análise fenotípica de animais de GPCR-nocaute de peptídeo-knockdown e tecido-específica de tecido-específica pode revelar informações sobre modo do peptídeo-GPCR sinalização e local de ação. No entanto, as conclusões que podem ser alcançadas apenas por dados genéticos são limitadas. Por outro lado, uma vez que o alvo putativo de um hormônio peptídeo específico é reduzido a um tipo de tecido ou célula, cálcio ex vivo de imagem em explantes de órgão pode ser usado para elucidar a órgão-para-órgão comunicação mediada por sinalização de peptídeo-GPCR. Após a ativação de um GPCR Gq-acoplado, a concentração intracelular de Ca2 + é aumentada devido à liberação de Ca2 + do ER10. No cérebro, ativação neural também eleva os níveis intracelulares de Ca2 + . Tais aumentos de Ca2 + podem ser detectados por um sensor de cálcio, GCaMP, que sofre mudanças conformacionais na presença de Ca2 + resultando em emissão de fluorescência11.
Neste artigo, é descrito um método de imagem usando o cérebro de Drosophila explants de cálcio. Para testar a capacidade de um peptídeo para ativar os neurônios específicos, um peptídeo de teste é aplicado para o explante cérebro GCaMP-expressando, e mudanças de fluorescência são monitoradas pela microscopia confocal. O envolvimento do GPCR é então confirmado, realizando o mesmo ensaio usando um cérebro mutante falta GPCR. Esta combinação de genética e de imagem fornece informações precisas sobre o órgão-para-órgão de comunicação por peptídeos-GPCRs. possíveis modificações e aplicações do presente protocolo são também discutidas.

<table><tbody><tr>Sistemas A-M <td>de haste de tungstênio</td><td>, Sequim, WA, EUA</td><td>717000</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik, Paris, França</td><td>3049100</td><td>adesivos reutilizáveis semelhantes a massa</td></tr><tr><td>Vidro de relógio, quadrado, 1 5/8 in</td><td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, EUA</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japão</td><td>T900</td><td>Sais tamponados fosfatados</td></tr><tr><td>CCHa2</td><td>SCRUM Inc., Tóquio, Japão</td><td></td><td>Peptídeo sintetizado por Custum</td></tr><tr><td>Ghrerin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japão</td><td>4372-s</td><td></td></tr><tr><td>Nociceptin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japão</td><td>4313-v</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager A2</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha</td><td>Axio Imager A2</td><td>microscópio de fluorescência</td></tr><tr><td>Objetiva W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha</td><td>420957-9900-000</td><td>lente objetiva de imersão em água</td></tr><tr><td>P-725 PIFOC scanner de objetiva com longo alcance de deslocamento</td><td>Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemanha</td> N<td>/A</td> unidade de scanner confocal de <td>motor de lente ativada piezoelétrica</td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Tóquio, Japão</td><td>Cabeça confocal de disco giratório</td><td>CSU-W1</td></tr><tr><td>ImagEM C9100-13</td><td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japão</td><td>C9100-13</td><td>Câmera EM-CCD</td></tr><tr><td>OBIS 488 nm LS 60 mW</td><td>Coherent, Santa Clara, CA, EUA</td><td>1178770</td><td>laser de 488 nm</td></tr><tr><td>488/568/647 nm Yokogawa dicroico dicroico diquetímetro</td><td>Semrock, Rochester, NY, EUA</td><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0,5</td><td>divisor de feixe dicróico</td></tr><tr><td>528/38 nm BrightLine filtro passa-banda de banda única</td><td>Semrock, Rochester, NY, EUA</td><td>FF01-528/ Filtro de Emissão 38-25</td><td></td></tr><tr><td>&micro; Gerente</td><td>Open Imaging, Inc.</td><td>N/A</td><td>https://micro-manager.org</td></tr><tr><td>ImageJ</td> U<td>. S. National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>TurboReg</td><td>Philippe Th&eacute; venaz, Grupo de Imagens Biomédicas, Instituto Federal Suíço de Tecnologia de Lausanne</td><td>N/A</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr></tbody></table>

ex vivo imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Órgão-órgão-a comunicação por sinalização endócrina, por exemplo, da periferia para o cérebro, é essencial para manter a homeostase. Como um animal de modelo para a investigação do sistema endócrino, Drosophila melanogaster, que tem sofisticadas ferramentas genéticas e informação do genoma, está sendo usado cada vez mais. Este artigo descreve um método para o tratamento de imagens de cálcio de explantes de cérebro de Drosophila . Esse método permite a detecção da sinalização direta de um hormônio no cérebro. É sabido que muitos Hormônios peptídicos agem através de receptores G-proteína-acoplados (GPCRs), cuja ativação causa um aumento na concentração Ca2 +intracelular. Ativação neural também eleva intracelular Ca2 + níveis, do influxo de Ca2 + e a liberação de Ca2 + armazenados no retículo endoplasmático (ER). Um sensor de cálcio, GCaMP, pode monitorar essas mudanças de Ca2 + . Neste método, o GCaMP é expresso nos neurônios de interesse, e o cérebro larval GCaMP-expressando é dissecado e culta ex vivo. O teste de peptídeo é então aplicado ao explante cérebro, e as alterações fluorescentes em GCaMP são detectadas usando um microscópio confocal de fiação disco equipado com uma câmera CCD. Usando este método, qualquer molécula solúvel em água pode ser testada, e diversos eventos celulares associados a ativação neural podem ser fotografados usando os indicadores fluorescentes apropriados. Além disso, modificando a imagem da câmara, este método pode ser usado para a imagem de outros órgãos de drosófila ou os órgãos de outros animais.

Usando este protocolo, a ativação do cérebro células produtoras de insulina (IPCs) pelo hormônio peptídeo, CCHa2, foi examinada. IPCs do selvagem-tipo cérebro foram rotulados com GCaMP6s usando uma combinação de dilp2 -GAL412 (um presente do Dr. Rulifson) e UAS-GCaMP6s13 (um presente do Dr. Kim). Larval cérebro explantes foram tratados com um peptídeo sintético de CCHa2, e a fluorescência de GCaMP6s foi gravada em tempo rea...

Este artigo descreve um protocolo para a ex vivo cálcio imagem latente do cérebro drosófila . Neste método, compostos naturais ou sintéticos podem ser aplicados para o buffer para testar sua capacidade de ativar neurônios particulares do cérebro.

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da endocrinologia, bem como no campo da neurociência, como nossa pesquisa para revisar as respostas do cérebro aos sinais endócrinos. A principal vantagem dessa técnica é que você pode examinar os efeitos diretos dos sinais endócrinos no cérebro separados de outros tecidos. Para iniciar este procedimento, use uma pinça para arranhar o centro inferior de uma placa de cultura de plástico para criar um amassado para facilitar a montagem do gânglio ventral do cérebro larval após a dissecção.Com um palito de dente, coloque uma pequena gota de supercola em ambos os lados do amassado e prenda uma haste de tungstênio na cola. Em seguida, usando um pequeno pedaço de adesivo reutilizável semelhante a massa, faça uma parede circular ao redor do amassado. Para dissecar o cérebro larval, 90 a 120 horas após a postura dos ovos, colete as larvas e lave-as pelo menos três vezes com água destilada para remover os restos de comida aderentes.Em seguida, coloque uma larva em um vidro de relógio quadrado de uma polegada e meia cheio de PBS gelado. Use uma pinça para agarrar suavemente a parte do meio da larva. Use outro par de pinças para ag

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos uma técnica estabelecida para medir e analisar odor evocadas respostas de cálcio no lobo antenal de...

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

Este vídeo descreve imagens de cálcio in vivo em neurônios de Drosophila usando GCaMP. O clipe de protocolo em destaque mostra como registrar alterações na fluorescência do GCaMP dos neurônios do corpo do cogumelo durante um experimento de condicionamento olfativo.

Drosophila In Vivo Imagem de cálcio: um método para imagem funcional da atividade neuronal

Este vídeo demonstra um método para imagens de cálcio in vivo usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em moscas. Ele descreve as etapas para preparar as moscas para microscopia, conduzir o condicionamento olfativo e visualizar o influxo de cálcio induzido por odor.

in vivo Imagens de cálcio usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em Drosophila melanogaster

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Este vídeo demonstra imagens de cálcio para estudo Drosophila respostas cerebrais a neuropeptídeos. Os neurônios que expressam um indicador fluorescente de cálcio revelam a dinâmica do cálcio intracelular e as respostas funcionais às moléculas de sinalização.

Imagens de cálcio ex vivo para estudar as respostas cerebrais de Drosophila a neuropeptídeos

Fonte: Lark, A. R., et. al., Abordagem de imagem cerebral funcional in vivo baseada no indicador de cálcio bioluminescente GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra imagens em tempo real da dinâmica do cálcio usando Green bioluminescência de proteína fluorescente-aequorina em Drosophila estruturas cerebrais profundas.

Imagem de bioluminescência para estudar transientes de cálcio em estruturas cerebrais de Drosophila

As patas dianteiras e a tromba de Drosophila contêm um rico repertório de neurônios sensoriais gustativos. Aqui, apresentamos um método usando imagens de cálcio para medir as respostas fisiológicas de neurônios sensoriais na perna dianteira e na tromba de moscas vivas após a aplicação exógena de um feromônio gustativo.

Medindo respostas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios sensoriais para Lipid feromonas Usando Imagem de cálcio ao vivo

Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Este artigo descreve um protocolo adaptável ex vivo para a visualização de Ca2 + durante a ativação do ovo em Drosophila.

Imagens de cálcio na<em&gt; Drosophila</em&gt; At Activation Egg

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos com Drosophila através de imagens ex vivo de cálcio, permitindo a exploração dos potenciais mecanismos de epilepsia em nível celular.

Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Apresentamos protocolos de imagem de cálcio para um neurônio olfatório larval de Drosophila , usando um adesivo tecidual tópico para imobilização. Este método aumenta a estabilidade, facilitando experimentos in vivo e ex-vivo confiáveis. Os scripts R personalizados analisam os sinais de cálcio, fornecendo uma plataforma eficiente para pesquisas neurofisiológicas detalhadas.

Imagem de cálcio in vivo e ex-vivo de um neurônio do circuito olfatório na larva de Drosophila melanogaster de terceiro ínstar

Aprenda a realizar imagem de cálcio ex vivo em cérebros de Drosophila para estudar respostas neuronais a sinais endócrinos. Este método permite analisar efeitos diretos de hormônios no cérebro separados de outros tecidos.

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

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