Name: Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a automatizar a análise da linha germinativa de Caenorhabditis elegans para estudar distribuição de núcleos, proteínas e citoesqueleto. Este método reduz tempo de análise e erros humanos.

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Agradecemos seu apoio técnico Monash Microimaging. Algumas cepas foram fornecidas pelo centro de genética Caenorhabditis , que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Este trabalho foi apoiado por Monash University biomedicina descoberta Fellowship, NHMRC Project Grant (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) e bolsa de inovação veski: 23-VIF Roger Pocock.

1. preparação e criação de minhoca
Nota: Consulte a Tabela de materiais para todas as informações do produto.
<ol><li>Cultura de Escherichia coli OP50: cultura OP50 bactérias em caldo lisogenia (LB) (triptona 1%, 0,5% de fermento, 0,5% de NaCl, pH 7.0) durante a noite a 37 ° C, sem antibióticos.</li>
	<li>Semente 400 µ l de bactérias OP50 para placas de mídia (NGM) de crescimento de nematoides (1,5 g de NaCl, 8,5 g de ágar-ágar, 1,25 g de peptona, 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de colesterol de 5 mg/mL em etanol, 1ml de 1m MgSO4 e 25 mL de tampão de4 de KPO 1 M) e o ar seco as bactérias por 48 h.</li>
	<li>Pegar vermes nas placas NGM semeadas e incubar a 15 ° C ou 20 ° C.<ol>
<li>Para a análise do germline adulto hermafrodita, escolher bem alimentados vermes L4 para o gramado bacteriano e incubar durante uma noite a 20 ° C.</li>
		<li>Para marcar o número de espermatozoides em hermafroditas, incube L4 vermes a 20 ° C, durante 12 h até os vermes atinjam o molt L4/adulto. Para sincronizar os vermes para a fase de L4, prepare ovos escolhendo vermes adultos com um monte de ovos em solução de água sanitária (1 M de NaOH e água sanitária na proporção 1:1). Permitir que os ovos eclodem e escolher animais de L4 para o experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare lâminas de microscópio de Teflon colocando 25 µ l de solução de poli-L-lisina no slide e espalhar a solução, usando a ponta da pipeta. Depois de retirar o excesso poli-L-lisina com toalha de papel, permitir que os slides secar ao ar e a incubar a 65 ° C por 15-20 min.</li>
</ol>2. Germline dissecção e coloração6,13
<ol><li>Spot 10 µ l de tetramisole 0,01% (anestésico) sobre uma lamela de 22 × 22 mm e escolher um dias de idade vermes adultos dentro dele.</li>
	<li>Dissecar o verme na cauda, como torna-se sedado usando uma seringa (5 mL) e uma agulha (24 "x 1") e certifique-se de que a linha germinativa não está danificada. Nota: A dissecação deve ser efectuada antes o verme torna-se totalmente paralisado para que a pressão negativa no verme e o movimento de verme ajuda a ejeção da da linha germinal. Para marcar o esperma, devem ser tomadas precauções para não danificar a espermateca pela agulha durante a dissecção. Evite tocar o germline com a agulha, exceto o ponto de dissecação após a espermateca. Se não há quebra no compartimento do germline ou qualquer descarga do germline é observada, o germline não deve ser usado para análise.</li>
	<li>Coloca a lamela invertida em um slide revestido de poli-L-lisina, mantendo o germline dissecado no slide.</li>
	<li>Remova o excesso de líquido sob a lamínula colocando uma torre de papel em um canto da lamela, então lugar o slide em nitrogênio líquido para 1 min. remover rapidamente a lamela usando uma agulha com a germlines no slide.</li>
	<li>Transferir os slides em metanol de-20 ° C por 30-60 s numa câmara e, em seguida, incube durante 30 min em solução recentemente preparada de fixação (1x tamponado fosfato salino (PBS) contendo 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM de MgSO4, 0,8 mM. o glicol de etileno-bis(beta-aminoethyl éter)-N, N, N', N'-tetraacetic ácido (EGTA) e 3,7% paraformaldeído) à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as lâminas, colocando em uma câmara contendo 1X PBS, pH 7,4 com 0.1% Tween-20 por 10 min. Repita este passo uma vez.</li>
	<li>Bloquear o germlines com 30 µ l de solução de bloqueio (30% de soro de cabra preparado pela adição de 900 µ l de soro de cabra em 1700 µ l de água destilada H2O e 300 µ l de PBS de x 10) em uma câmara húmida preparada colocando toalha de papel molhada em uma caixa de plástico em temperatura ambiente por 30 min.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de solução-anticorpo REC-8 em 30% de soro de cabra em uma proporção 1: 300 para cada amostra. Incubar durante uma noite a 4° C.</li>
	<li>Lave as lâminas, colocando em uma câmara contendo 1X PBS com 0.1% Tween-20 por 10 min. Repita a etapa uma vez e retire o excesso de líquido, colocando uma toalha de papel no canto do slide.</li>
	<li>Prepare a solução de anticorpo secundário diluindo fluoróforo verde (488 nm de emissão de onda) anticorpo secundário conjugado (1: 1000), faloidina (mancha de actina, 1:4000) e DAPI (DNA mancha, 1:4000) em 30% de soro de cabra normal.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de solução anticorpo secundário para o slide.</li>
	<li>Encube por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar as lâminas duas vezes, colocando em uma câmara contendo 1X PBS com 0.1% Tween-20 por 10 min. Limpe o excesso de líquido.</li>
	<li>Adicionar 30 µ l de reagente para o slide de fixação e coloque um de 12 mm2 x 1,5 µm lamela em cima e secar as lâminas a 4 ° C durante a noite.</li>
</ol>3. Confocal da microscopia
<ol><li>Ligue o microscópio confocal, laser, scanner de ressonância e software microscópio confocal. Coloque os slides com germlines manchado no suporte do slide acima o objetivo X 63.</li>
	<li>Localize uma linha germinativa, foco na parte superior da linha germinativa e marcá-lo usando o software do microscópio confocal. Da mesma forma, concentrar-se na parte inferior do germline e marcá-lo para estabelecer a espessura total da linha germinal.</li>
	<li>O germline inteira definindo a espessura de cada fatia até 0,5 µm. Mark o germline completa e iniciar a aquisição de imagem. Digitalizar cada fatia 8 vezes e a média de valores para melhorar a qualidade de imagem. O scanner de ressonância permitirá a verificação rápida para evitar o branqueamento durante a imagem latente. Se o microscópio não tem um scanner de ressonância, reduzir o número de exames a quatro para evitar descoramento.</li>
</ol>4. post análise de núcleos de imagem número e distribuição
Nota: Referem-se a complementar a Figura 1 para screenshots do software ferramentas e botões usados.
<ol><li>Importe a imagem para hottie 8.4.1 ou versões posteriores do software.</li>
	<li>Defina região mitótica, zona de transição, região meiótica, região do oócito e espermateca do germline, identificando a morfologia nuclear em cada região.</li>
	<li>Use o botão de função de superfície (Figura complementar 1A) do software para selecionar a região de interesse.</li>
	<li>Cancelar o assistente de criação de superfície automática e manualmente, desenhar a região de interesse, o primeiro e o último pedaço da imagem da pilha tridimensional.</li>
	<li>Clique em criar superfície. Nota: O software automaticamente irá desenvolver as pilhas entre a primeira e a última pilha.</li>
	<li>Máscara de todos os canais exceto DAPI clicando o botão de canal de máscara (Complementar a figura 1B-C).</li>
	<li>Defina parâmetros de tamanho nuclear usando o botão de ponto de função (complementar figura 1A). Para a região mitótica, defina um diâmetro XY de 2 µm, deixando o diâmetro Z indefinido. Para a zona de transição, defina o diâmetro XY de 2 µm de diâmetro de Z como 1,5 µm. (complementar a Figura 1). Nota: Solucione os diâmetros de acordo com a ampliação e especificações do microscópio. Para o protocolo atual, o objetivo utilizado foi 63 X e forneceu um extra de ampliação de 1,70 vezes durante a imagem latente. Se o objetivo for alterado, por exemplo 40 X, os diâmetros devem ser alterados em conformidade. Solução de problemas deve ser realizada com sua germlines para estabelecer os parâmetros corretos. A região mitótica de um braço do germline de tipo selvagem tem aproximadamente 250 núcleos. O diâmetro deve ser modificado para alcançar esse valor. Use pelo menos 15 germlines para determinar o valor ideal para o diâmetro. Uma abordagem semelhante deve ser usada para calibrar a zona de transição (núcleos de 150-170) e a região meiótica (núcleos de 600-700).</li>
	<li>Limite a detecção de manchas, definindo o limite mínimo (complementar figura 1E). Uso DAPI manchados tipo selvagem germlines para estabelecer o limite mínimo, aumentando o limiar mínimo de renderização tridimensional até que a mancha aparece fora da linha germinativa.</li>
	<li>Salve a imagem e obter o número de núcleos da tabela gerada automaticamente pelo software. Exporte as imagens como arquivos TIF.</li>
</ol>5. publicar a análise de imagem para marcar o esperma e o número de cromossomos
<ol><li>Execute a renderização tridimensional, selecionando a espermateca como a região de interesse. Para detectar cada espermatozoide, definir o diâmetro do ponto entre 0,75 - 1,0 µm para X e Y-eixo, enquanto o diâmetro Z permanece indefinido. Use o botão de função de pontos, como mostrado na Figura complementar 1.</li>
	<li>Subtrair o fundo marcando fundo subtraia caixa e usando valores de correção de fundo calculados pelo software (complementar a Figura 1). Nota: O software de hottie escolhe pontos de alta intensidade primeiro, portanto, o efeito de fundo é mínimo, enquanto não há diferença significativa entre a região de interesse e o fundo. Um segundo método é definir a correção de fundo manualmente, se for caso disso, valores pode ser dado para o plano de fundo. Correção de fundo manual será adequada se a intensidade de amostras independentes precisa de comparação.</li>
	<li>Ajuste o limite de renderização tridimensional para detectar todos os DAPI manchado de esperma na espermateca (complementar figura 1E).</li>
	<li>Para a contagem de cromossomas, definir o diâmetro do ponto < 0,75 µm para X e Y-eixo antes de desenvolver modelos tridimensionais.</li>
	<li>Salve a imagem e exportar como arquivo TIF.</li>
</ol>6. análise de imagem para a reconstrução do citoesqueleto do Germline de postar
<ol><li>Identificar a região de interesse no germline e mascarar todos os canais exceto faloidina clicando botão máscara canais .</li>
	<li>Defina um detalhes da superfície de 0,25 µm usando o botão de função de superfície (complementar a Figura 1). Nota: Isto significa que cada 0,25 µm será processado em modelos tridimensionais. Detalhes da superfície podem ser constante para qualquer região do germline onde um modelo de superfície tridimensional será criado para cada 0,25 µm. No entanto, para a região do oócito, detalhes da superfície podem ser aumentada para 0,35 - 0,5 µm, devido à presença de fibras de actina bem definidas nesta região.</li>
	<li>Subtrair o fundo marcando fundo subtraia caixa e usando valores de correção de fundo calculados pelo software (complementar a Figura 1).</li>
	<li>Ajuste o limite de renderização tridimensional dependendo da estrutura que exigem análise (complementar figura 1E).</li>
	<li>Salve a imagem tridimensional desenvolvida e exportar como um arquivo TIF.</li>
</ol>

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<li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li>
<li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li>
<li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li>
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</ol>

Os autores declaram não há conflito de interesses.

O objetivo do presente protocolo é melhorar a precisão e reduzir o tempo necessário para a análise da linha germinal. Após preparação padrão de germlines dissecado, um modelo tridimensional do germline núcleos é preparado por processamento computacional. Permitindo a observação da distribuição de núcleos germline no espaço, renderização tridimensional calcula o número de núcleos em regiões específicas da da linha germinal. O aspecto crítico do nosso método é uma definição precisa dos parâmetros de tamanho e forma dos núc...

A conservação de sinalização com mamíferos vias faz c. elegans , um excelente modelo para o estudo de vários processos biológicos1,2. Em nosso laboratório, usamos o c. elegans germline para estudar o desenvolvimento de células-tronco, apoptose e expressão gênica. Enquanto o germline é uma estrutura tridimensional, muitos estudos são duas dimensões devido à natureza demorada e trabalhosa de análise tridimensional. É altamente provável que a análise bidimensional pode deturpar na vivo eventos no germline. O hermafrodita de adultos de c. elegans tem dois braços da linha germinal, cada um deles abriga uma célula somática ponta distal (DTC) que mantém distais células germinativas num estado indiferenciado3,4. Estas células germinativas começam a diferenciar como movem-se longe do DTC, escapar de sua influência e tornar-se oócitos e esperma como atingem a extremidade proximal da da linha germinal. Durante este processo, núcleos de células germinativas sofrem mitose, antes de fazer a transição para a meiose5,6. Produção de espermatozoides é completada pelo estágio larval 4 (L4) do desenvolvimento, após o qual os oócitos são produzidos durante a idade adulta. Os espermatozoides são armazenados na espermateca onde eles fertilizam oócitos para gerar embriões.
Existem vários fatores genéticos e ambientais que podem influenciar o desenvolvimento do germline em c. elegans , resultando em mudanças no número de núcleos, o número de eventos de apoptotic, dinâmica do cromossoma e expressão de proteínas e/ou localização7 ,8,9,10,11. A análise desses eventos requer a identificação de cada etapa de diferenciação com base na distribuição e morfologia nuclear. Para analisar com precisão esses parâmetros manualmente com um tamanho de amostra grande é trabalhosa e demorada. Para contornar estes inconvenientes e permitir a consistência da análise, desenvolvemos um método automatizado para análise tridimensional do c. elegans germline para núcleos contando, distribuição de núcleos, expressão de proteínas e do citoesqueleto estrutura. Combinando a microscopia confocal com renderização tridimensional, geramos parâmetros de tamanho e forma, para a identificação de cada estágio da diferenciação de células germinativas. Além disso, esse método permite a contagem de esperma e de núcleos de células germinativas, mais Pontuação do número de cromossomos em cada oócito.
Uma estrutura crucial do germline é o citoesqueleto, que fornece a estabilidade para o compartimento da linha germinal, SIDA a ciclose e proteção germline núcleos12. Usando processamento computacional, realizamos a reconstrução tridimensional do citoesqueleto germline e identificado características distintas do citoesqueleto, dentro da linha germinativa. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para ilustrar a análise computacional como combinado com confocal de imagem permite uma análise abrangente do germline c. elegans .
Propomos um método rápido de análise tridimensional de c. elegans germline (Figura 1). Usando a análise tridimensional, é possível estudar a distribuição tridimensional do germline núcleos (Figura 2 e Figura 3), automatizada contagem de células (Figura 2), reconstrução do germline citoesqueleto ( Figura 3), distribuição de proteínas (Figura 4) e marcar o número de espermatozoides na espermateca e cromossomos em oócitos (Figura 5). O método não só permite a quantificação fácil e precisa do germline mas identifica fenótipos fisiologicamente relevantes.

<table><tbody><tr><td>C. elegans cepas: tipo selvagem (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&nbsp; </td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli bactérias</td><td>Placas caseiras</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>meios de crescimento de nematóides (NGM)</td><td></td> Coelho policlonal caseiro <td></td><td></td></tr><tr><td>anti-REC-8&nbsp;</td><td>SDIX</td><td>29470002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 anticorpo conjugado criado em cabra</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>Corante citoesquelético faloidina&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-12380</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific&nbsp;</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES buffer, pH 7.4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0887</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1389</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído a 37%</td><td>Merck Millipore</td><td>1040031000</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td> Reagente de fixação de fluoroshield <td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>1009832511</tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>20&deg; C & 25&deg; CIncubadora&nbsp;</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal&nbsp; &nbsp;</td><td>Qualquer marca (Leica, Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computador equipado com Imaris suit 8.4.1 ou versão posterior, licença completa para usar o software e o software Matlab.</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phospho tamponado com solução salina, pH 7.4</td><td>Lâminas de microscópio Teflon caseiras</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Tekdon&nbsp;</td><td>&nbsp; Telefone: 941-322-8288</td><td></td></tr></tbody></table>

análise computacional do germline caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

O germline Caenorhabditis elegans (c. elegans) é usada para estudar vários processos biologicamente importantes, incluindo a dinâmica de desenvolvimento, apoptose e cromossomo de células-tronco. Enquanto o germline é um excelente modelo, a análise é frequentemente duas dimensões devido ao tempo e o trabalho necessário para análise tridimensional. Grandes leituras em tais estudos são a posição/número de núcleos e distribuição da proteína dentro da linha germinativa. Aqui, apresentamos um método para executar a análise automatizada do germline usando microscopia confocal e abordagens computacionais para determinar o número e posição dos núcleos em cada região do germline. Nosso método também analisa a distribuição de proteína germline que permite o exame tridimensional da expressão da proteína em diferentes origens genéticas. Além disso, nosso estudo mostra variações na arquitetura do citoesqueleto em distintas regiões do germline que podem acomodar requisitos específicos de desenvolvimento espaciais. Finalmente, nosso método permite que a contagem automatizada do esperma na espermateca de cada linha germinativa. Tomados em conjunto, nosso método permite a análise fenotípica rápida e reprodutível do germline c. elegans .

Figura 1 indica o tempo necessário para análise tridimensional da linha germinal. Hermafroditas L4 incubadas a 20 ° C foram dissecadas para isolar germlines e coradas com DAPI, faloidina e anticorpos contra as proteínas da linha germinal. Germlines são fotografadas usando microscopia confocal. Microscopia confocal e coloração requer aproximadamente 24 h. análise computacional para o germline completa exige 10-15 min para contar o número e a posição dos núcleo...

Apresentamos um método automatizado para reconstrução tridimensional do germline Caenorhabditis elegans . Nosso método determina o número e a posição de cada núcleo dentro da linha germinativa e distribuição de proteína germline análises e estrutura do citoesqueleto.

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

O objetivo geral deste método é automatizar a análise de uma linha germinativa de Caenorhabditis elegans para estudar seus núcleos, proteínas e distribuição do citoesqueleto. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo de C.Elegans sobre o número de núcleos e espermatozoides, distribuição nuclear e estrutura do citoesqueleto da linha germinativa. As principais vantagens desta técnica são reduzir o tempo de análise, aumentar o tamanho da amostra e eliminar o erro humano associado à análise manual.Para obter imagens das amostras, coloque lâminas com linhas germinativas coradas no suporte de lâminas acima da objetiva 63X de um microscópio confocal e localize uma linha germinativa. Concentre-se no topo da linha germinativa e marque-a com o software do microscópio confocal. Quando a espessura total da linha germinativa for estabelecida, defina a espessura de cada fatia até 0,5 micrômetros e marque a linha germinativa completa.Em seguida, inicie a aquisição, digitalizando cada fatia oito vezes e calculando a média dos valores para melhorar a qualidade da imagem. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, importe-as para um programa de software de análise de imagem apropriado e use a ferramenta de função de superfície para selecionar a região mitótica. Uma imagem da extremidade distal da linha germinativa aparecerá.Cancele o assistente de criação automática de superfície e desenhe manualmente uma região de interesse ao redor da região mitótica na primeira e na última fatia da imagem da pilha tridimensional. Clique em Criar superfície, seguido de Canal de máscara, para mascarar todos os canais, exceto o canal DAPI. Usando a ferramenta de função de ponto, defina os parâmetros de tamanho da região mitótica com um diâmetro XY de dois micrômetros e com o diâmetro Z indefinido.Clique em subtrair plano de fundo para subtrair o plano de fundo. Para definir o limite mínimo, aumente o limite mínimo de renderização 3D em uma linha germinativa do tipo selvagem corada com DAPI até que o primeiro ponto apareça fora da linha germinativa e gere um modelo 3D para cada região. Depois de salvar as imagens, clique na tabela para visualizar o número de núcleos, conforme gerado automaticamente pelo software, e exporte as imagens como arquivos TIFF.Para a zona de transição, crie a superfície conforme explicado anteriormente. Em seguida, clique em Mascarar canal para mascarar todos os canais, exceto o canal DAPI. Usando a função de ponto, defina um diâmetro XY de dois micrômetros e um diâmetro Z de 1,5 micrômetros e clique em subtrair o plano de fundo para subtrair o plano de fundo.Para definir o limite mínimo, aumente o limite mínimo de renderização 3D em uma linha germinativa do tipo selvagem corada com DAPI até que o primeiro ponto apareça fora da linha germinativa e gere um modelo 3D para cada região. Depois de salvar as imagens, clique na tabela para visualizar o número de núcleos, conforme gerado automaticamente pelo software, e exporte as imagens como arquivos TIFF. Para pontuar o número de espermatozoides, selecione a espermateca como a região de interesse, conforme demonstrado para as regiões dos núcleos, e use a ferramenta de função pontual para definir o diâmetro XY entre 0,75 e um micrômetro com um diâmetro Z indefinido para detectar cada espermatozóide.Selecione a caixa Subtrair plano de fundo e use os valores de correção de plano de fundo calculados pelo software para subtrair o plano de fundo. Em seguida, ajuste o limite de renderização 3D para detectar todos os espermatozoides corados com DAPI na espermateca. Para contagem de cromossomos nos oócitos, selecione os oócitos e defina o diâmetro XY como inferior a 0,75 micrômetros e defina o limite antes de desenvolver os modelos 3D.Em seguida, salve as imagens para exportação como arquivos TIFF. Para a reconstrução da linha germinativa do citoesqueleto, identifique a região mitótica de interesse na linha germinativa e crie uma máscara de superfície conforme demonstrado anteriormente. Clique em Mascarar canais para mascarar todos os canais, exceto o canal de faloidina, e use a ferramenta de função de superfície para definir um detalhe de superfície de 0,25 micrômetros.Depois de subtrair o plano de fundo, ajuste o limite de renderização 3D para salvar a imagem 3D desenvolvida para exportação como um arquivo TIFF. A distribuição dos núcleos depende do estágio de diferenciação. Por exemplo, na região mitótica, a actina interna aparece como uma massa sólida sobre a qual os núcleos são organizados.Em uma linha germinativa do tipo selvagem, a região mitótica contém aproximadamente 250 núcleos e está bem compactada com núcleos em comparação com o resto da linha germinativa. À medida que os núcleos se afastam da extremidade distal, no entanto, eles parecem mais próximos da circunferência da linha germinativa, com a mudança na distribuição começando na zona de transição e terminando quando os núcleos entram no terceiro estágio da prófase na meiose. Na zona de transição, a actina interna da linha germinativa assume uma estrutura mais cilíndrica, tornando-se um cilindro oco ao atingir o paquiteno.A segunda camada de actina cobre a camada interna, dando forma à linha germinativa. Este cilindro dentro de uma estrutura de actina cilíndrica desaparece em direção à região do oócito, ponto em que a actina aparece como fibras espessas cobrindo os oócitos. Na espermateca, a actina também se forma em feixes espessos de fibras, embora essas fibras pareçam estar mais próximas do que na região do oócito.A renderização tridimensional da extremidade proximal da linha germinativa, conforme demonstrado, revela uma média de 151 espermatozóides em cada espermateca. Uma vez dominada, essa análise pode ser concluída em 10 minutos por linha germinativa. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de definir os parâmetros de análise de acordo com a ampliação da objetiva usada para visualizar a linha germinativa em seu experimento.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma análise automática de uma linha germinativa e estudar a estrutura do citoesqueleto e pontuar o número de núcleos dentro da linha germinativa.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

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