Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

O objetivo geral deste método é automatizar a análise de uma linha germinativa de Caenorhabditis elegans para estudar seus núcleos, proteínas e distribuição do citoesqueleto. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo de C.Elegans sobre o número de núcleos e espermatozoides, distribuição nuclear e estrutura do citoesqueleto da linha germinativa. As principais vantagens desta técnica são reduzir o tempo de análise, aumentar o tamanho da amostra e eliminar o erro humano associado à análise manual.

Para obter imagens das amostras, coloque lâminas com linhas germinativas coradas no suporte de lâminas acima da objetiva 63X de um microscópio confocal e localize uma linha germinativa. Concentre-se no topo da linha germinativa e marque-a com o software do microscópio confocal. Quando a espessura total da linha germinativa for estabelecida, defina a espessura de cada fatia até 0,5 micrômetros e marque a linha germinativa completa.

Em seguida, inicie a aquisição, digitalizando cada fatia oito vezes e calculando a média dos valores para melhorar a qualidade da imagem. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, importe-as para um programa de software de análise de imagem apropriado e use a ferramenta de função de superfície para selecionar a região mitótica. Uma imagem da extremidade distal da linha germinativa aparecerá.

Cancele o assistente de criação automática de superfície e desenhe manualmente uma região de interesse ao redor da região mitótica na primeira e na última fatia da imagem da pilha tridimensional. Clique em Criar superfície, seguido de Canal de máscara, para mascarar todos os canais, exceto o canal DAPI. Usando a ferramenta de função de ponto, defina os parâmetros de tamanho da região mitótica com um diâmetro XY de dois micrômetros e com o diâmetro Z indefinido.

Clique em subtrair plano de fundo para subtrair o plano de fundo. Para definir o limite mínimo, aumente o limite mínimo de renderização 3D em uma linha germinativa do tipo selvagem corada com DAPI até que o primeiro ponto apareça fora da linha germinativa e gere um modelo 3D para cada região. Depois de salvar as imagens, clique na tabela para visualizar o número de núcleos, conforme gerado automaticamente pelo software, e exporte as imagens como arquivos TIFF.

Para a zona de transição, crie a superfície conforme explicado anteriormente. Em seguida, clique em Mascarar canal para mascarar todos os canais, exceto o canal DAPI. Usando a função de ponto, defina um diâmetro XY de dois micrômetros e um diâmetro Z de 1,5 micrômetros e clique em subtrair o plano de fundo para subtrair o plano de fundo.

Para definir o limite mínimo, aumente o limite mínimo de renderização 3D em uma linha germinativa do tipo selvagem corada com DAPI até que o primeiro ponto apareça fora da linha germinativa e gere um modelo 3D para cada região. Depois de salvar as imagens, clique na tabela para visualizar o número de núcleos, conforme gerado automaticamente pelo software, e exporte as imagens como arquivos TIFF. Para pontuar o número de espermatozoides, selecione a espermateca como a região de interesse, conforme demonstrado para as regiões dos núcleos, e use a ferramenta de função pontual para definir o diâmetro XY entre 0,75 e um micrômetro com um diâmetro Z indefinido para detectar cada espermatozóide.

Selecione a caixa Subtrair plano de fundo e use os valores de correção de plano de fundo calculados pelo software para subtrair o plano de fundo. Em seguida, ajuste o limite de renderização 3D para detectar todos os espermatozoides corados com DAPI na espermateca. Para contagem de cromossomos nos oócitos, selecione os oócitos e defina o diâmetro XY como inferior a 0,75 micrômetros e defina o limite antes de desenvolver os modelos 3D.

Em seguida, salve as imagens para exportação como arquivos TIFF. Para a reconstrução da linha germinativa do citoesqueleto, identifique a região mitótica de interesse na linha germinativa e crie uma máscara de superfície conforme demonstrado anteriormente. Clique em Mascarar canais para mascarar todos os canais, exceto o canal de faloidina, e use a ferramenta de função de superfície para definir um detalhe de superfície de 0,25 micrômetros.

Depois de subtrair o plano de fundo, ajuste o limite de renderização 3D para salvar a imagem 3D desenvolvida para exportação como um arquivo TIFF. A distribuição dos núcleos depende do estágio de diferenciação. Por exemplo, na região mitótica, a actina interna aparece como uma massa sólida sobre a qual os núcleos são organizados.

Em uma linha germinativa do tipo selvagem, a região mitótica contém aproximadamente 250 núcleos e está bem compactada com núcleos em comparação com o resto da linha germinativa. À medida que os núcleos se afastam da extremidade distal, no entanto, eles parecem mais próximos da circunferência da linha germinativa, com a mudança na distribuição começando na zona de transição e terminando quando os núcleos entram no terceiro estágio da prófase na meiose. Na zona de transição, a actina interna da linha germinativa assume uma estrutura mais cilíndrica, tornando-se um cilindro oco ao atingir o paquiteno.

A segunda camada de actina cobre a camada interna, dando forma à linha germinativa. Este cilindro dentro de uma estrutura de actina cilíndrica desaparece em direção à região do oócito, ponto em que a actina aparece como fibras espessas cobrindo os oócitos. Na espermateca, a actina também se forma em feixes espessos de fibras, embora essas fibras pareçam estar mais próximas do que na região do oócito.

A renderização tridimensional da extremidade proximal da linha germinativa, conforme demonstrado, revela uma média de 151 espermatozóides em cada espermateca. Uma vez dominada, essa análise pode ser concluída em 10 minutos por linha germinativa. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de definir os parâmetros de análise de acordo com a ampliação da objetiva usada para visualizar a linha germinativa em seu experimento.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma análise automática de uma linha germinativa e estudar a estrutura do citoesqueleto e pontuar o número de núcleos dentro da linha germinativa.