Uma abordagem Microfluidic gotículas e amplificação por PCR-microesfera para Single-Stranded DNA Amplicons

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na técnica combinatória do sistema microfluido e no campo da biotecnologia molecular, como dispositivos microfluidos e método de assimetria PCR. As principais vantagens desta técnica são a geração eficiente de microesferas altamente homogeneizadas e a produção de DNA mono-encalhado sem quaisquer etapas adicionais de separação. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico ou terapia de várias doenças.

Como a geração de DNA de uma única cadeia é a chave para ensaios ap-ta-mo-sis, ele pode ser usado para detecção e tratamento. Embora este método possa fornecer insights sobre o sistema microfluido tridimensional no MEMS, ele também pode ser aplicado a outros sistemas usados para detecção e tratamento de doenças. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão para controlar adequadamente os fluidos de fluir na direção inversa.

A demonstração visual deste método é fundamental para observar a formação da microesfera na geometria de foco de fluxo e solidificação das microesferas geradas. Primeiro, prepare 20 mililitros de PDMS líquido pré-polímero misturando polímero base e catalisador em uma proporção de 10 para um. Despeje 10 mililitros do PDMS líquido em um molde SU-8 preparado em um wafer de silício para a parte superior da rede microfluida.

Para a parte plana inferior, despeje o mesmo volume de PDMS líquido no wafer de silício sem uma estrutura de molde. Coloque dois wafers de silício revestidos com pré-polímero PDMS líquido em uma placa de aquecimento pré-aquecido e cure a 75 graus Celsius por 30 minutos. Na sequência, retire manualmente a camada PDMS curada do molde SU-8.

Alinhe uma ferramenta de perfuração redonda de furos redondo de 1,5 milímetros de diâmetro à porta de óleo na rede microfluida replicada para interligar canais de fluxo de micron com as amostras de macroe fluidos. Em seguida, furar manualmente o buraco. Depois de repetir o processo de perfuração três vezes, realize o tratamento de superfície hidrofílica nas camadas PDMS superior e inferior usando um tratado de corona portátil por vários segundos por amostra.

Empilhe duas camadas PDMS tratadas com plasma e aqueça a 90 graus Celsius por 30 minutos em uma placa de aquecimento para o processo de ligação PDMS-PDMS. Vórtice e centrifugar brevemente uma sonda padrão de acridite de DNA de um único fio e uma solução de estoque de acrilamida bis de 19 para um. Prepare a solução um misturando 25 microlitadores de 40% solução bis de acrilamida, 10 microliters de DNA mono-encalhado, 10 microliters de tampão 5X TBE e cinco microliters de água.

Prepare a solução dois com 50 microliters de 20% de persulfito de amônio. Prepare duas seringas preenchidas individualmente com a solução um e a solução dois e monte-as na bomba de seringa para introduzir fluxos de solução na plataforma microfluida. Prepare o óleo mineral misturado com 0,4% TEMED para solidificação superficial da microsfera.

Depois de encher uma garrafa de vidro com o óleo mineral, insira dois tubos nas portas pneumáticas e fluidas na tampa da garrafa de vidro como um reservatório microfluido. Conecte tubos entre a garrafa de vidro e a porta de óleo no dispositivo microfluido. Conecte os tubos às duas portas de solução no dispositivo microfluido, a fim de fornecer as duas soluções das bombas de seringa.

Em seguida, insira os tubos na porta de saída, a fim de transferir a microesfera gerada para o béquer. Em seguida, defina a taxa de fluxo da bomba de seringa para 0,4 a 0,7 mililitros por hora. Ajuste a pressão de ar comprimido do compressor usando um regulador.

Coloque um béquer de vidro com barra de mexida magnética em uma placa quente e afina a velocidade de rotação. Opere a bomba de seringa e forneça o ar comprimido gerado por um compressor externo na garrafa de vidro usando o controle on-off de uma válvula eletromagnética. Usando um microscópio digital, observe a formação de microesferas na geometria de foco de fluxo e solidificação das microesferas geradas no béquer de vidro.

Observar a formação de microesferas é uma das etapas mais críticas porque é um processo importante neste estudo produzir microesferas e sistema microfluido. Depois disso, transfira 100 microlitadores das microesferas para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Em seguida, remova o supernatante através de centrifugações suaves e pipetação.

Resuspende a cianotina modificada de sonda gratuita-3 usando 100 microliters de tampão 1X TE, a fim de alcançar uma concentração final de 100 micromolar. Em seguida, adicione 100 micromlameados de cianeina-3 modificada por sonda complementar a um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro estéril contendo microesferas copolímeras AP. Toque no tubo algumas vezes para misturar e incubar à temperatura ambiente no escuro por uma hora.

Após a incubação, descarte o supernasciente e remova o tampão residual através da pipetação. Em seguida, enxágue três vezes com 500 microliters de tampão de TE. Coloque as microesferas em um deslizamento de vidro de 75 por 50 milímetros e cubra com papel alumínio antes da imagem.

Obtenha aproximadamente 25 microesferas através da contagem microscópica usando um microscópio leve com ampliação de 40X. Na sequência, combine todos os reagentes conforme descrito no protocolo de texto. Coloque as amostras em um termociclador e inicie o PCR assimétrico nas condições apropriadas.

A coleta de um PCR supernante após assimétrico é um dos passos mais críticos porque é um processo importante para gerar DNA de uma única cadeia com microesfera. Após a amplificação, adicione oito microliters de tampão de carregamento 6X a cada amostra. Carregue 15 microliters de cada amostra em gel de 2%agarose.

Em seguida, realize a eletroforese a 100 volts por 35 minutos em tampão TAE 1X. Coloque as microesferas hibridizadas em um suporte e conecte o suporte ao estágio de um microscópio confocal. Selecione o laser e ligue-o no controle de laser.

Selecione a lente objetiva no controle do microscópio. Em seguida, selecione o filtro desejado para cianeto-3 e canalize no controle de configuração. Finalmente, inicie o experimento e observe a amostra.

A plataforma microfluida fabricada à base de gotículas poliméricas consiste em duas camadas PDMS. Três tipos de redes de canais microfluidos são usados para gerar microesferas, que são geometria com foco de fluxo, um canal serpentino para misturar soluções um e dois, e um canal de polimerização para solidificação da microesfera. Um sistema de controle pneumático baseado em laboratório para fluxo contínuo do óleo mineral e duas bombas de seringa para o fluxo da solução foram utilizados para a geração de microesferas na plataforma microfluidica.

Se as microesferas forem corretamente funcionais com a sonda de DNA de acridite de cinco primos, elas devem resultar na cobertura da atividade fluorescente na superfície durante o experimento de hibridização, como mostrado nessas imagens fluorescentes. Se a copolymerização não ocorrer corretamente, a imagem da microesfera óptica exibiria contaminação interna dentro das microesferas. Manipular a superfície 3D de microesferas com uma sonda oligo-de-DNA é um processo muito mais rápido e uma plataforma de síntese de microesferas no fluxo pode fornecer uma ferramenta para amplificação e purificação de DNA de um único fio.

O AP de cinco primes inicialmente copolímeros fornece uma extremidade hidroxile de três primes para polimerização de DNA depois de se ressarcir ao seu modelo complementar. Contaminantes de DNA de duplar foram observados no experimento assimétrico pcr. O DNA de uma única faixa acumulado a partir da microsfera PCR foi demonstrado em comparação com os marcadores de tamanho sintético através da análise de eletroforese de gel.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o conhecimento prévio de protocolos e ajustes que são comumente necessários para otimizar experimentos de PCR são necessários para obter o ciclo de amplificação, a temperatura de ressarcimento e a sequência da sonda neste método. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de diagnóstico e terapia conectarem duas regiões em biotecnologia molecular e biomedicina. Não se esqueça que trabalhar com solução de acrilamida pode ser perigoso e precauções como o uso de luvas e jalecos devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.