Name: Uma abordagem Microfluidic gotículas e amplificação por PCR-microesfera para Single-Stranded DNA Amplicons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Aprenda a fabricar plataformas microfluídicas baseadas em gotículas usando microesferas de poliacrilamida para amplificação por PCR-microesfera. Este método permite gerar amplicons de DNA fita simples sem etapas adicionais de separação.

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Este estudo é apoiado por um projeto intitulado "cooperativa programa de pesquisa para agricultura Science & Technology Development (projeto n. º PJ0011642) "financiado pela administração do Desenvolvimento Rural, República da Coreia. Esta pesquisa foi também parcialmente suportada por um fundo (NRF-2017R1A2B4012253), do programa de pesquisa de ciência básica através da Fundação Nacional pesquisa (NRF), financiado pelo Ministério da ciência, TIC & planejamento futuro, República da Coreia. Esta pesquisa também foi apoiada por uma bolsa (N0000717) do programa de educação para criativo e convergência industriais financiados pelo Ministério do comércio, indústria e energia, República da Coreia.

1. fabricação de uma plataforma de Microfluidic PDMS
<ol><li>Prepare-se 20 mL de líquido pré-polímero PDMS pela mistura de polímero base e catalisador em uma relação de volume de 10:1. Despeje 10 mL do líquido PDMS em um molde de SU-8 preparado em uma bolacha de silício para a parte superior da rede microfluidic. Para a parte inferior plana, despeje o mesmo volume de líquido PDMS na bolacha de silicone sem uma estrutura de molde. Nota: A rede microfluídicos é projetada em um programa de CAD e então convertida em uma Fotomáscara para fabricar um mestre usando o processo de fotolitografia típico (veja as Figuras suplementar). Este mestre é composto do molde negativo fotorresiste SU-8 sobre a bolacha de silício11.</li>
	<li>Coloque dois wafers de silício revestidos com líquido pré-polímero PDMS na chapa quente e cura a 75 ° C por 30 min.<ol>
<li>Manualmente, retire a camada PDMS curada do molde SU-8. Alinhe um 1,5 mm de diâmetro redondo buraco ferramenta de perfuração para o porto de óleo na rede microfluidic replicada para interfaceamento canais de fluxo mícron-escala com as amostras de fluido de macro. Um soco do através de-furo manualmente.</li>
		<li>Repeti este processo três vezes para a formação de duas soluções e a abertura de saída de perfuração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar o tratamento de superfície hidrofílico no superior e camadas PDMS de fundo usando um Hand-Held corona tratador12 durante vários segundos por exemplo.<ol>
<li>Pilha de dois tratados com plasma camadas PDMS e calor a 90 ° C por 30 minutos usando uma chapa quente para o processo de ligação de PDMS-para-PDMS. Fornecer a água pressurizada usando a bomba de seringa nas três portas de entrada para a colagem estrutural e teste de vazamento do dispositivo fabricado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. produção de poliacrilamida Oligo-microesferas
<ol><li>Prepare o grânulo-mistura detalhada na tabela 1.</li>
	<li>Vórtice e brevemente centrifugar o acrydite ssDNA padrão rotulado sonda (Ap, 100 μM) e acrylamide:bis (19:1) solução.</li>
	<li>Preparar a solução eu misturando 25 μL de 40% do acrilamido bis solução, 10 μL de ssDNA (sonda de acrydite), 10 μL de tampão de x TBE 5 (1,1 M Tris borato de 900 mM; 25 mM EDTA) e 5 μL de água. Prepare a solução II com 50 μL de persulfato de amónio de 20%.</li>
	<li>Preparar duas seringas individualmente preenchido com solução eu e a solução II e montá-los para a bomba de introduzir a plataforma microfluidic fluxos de solução. Preparar o óleo mineral misturado com 0,4% TEMED para solidificação da superfície da microesfera. Nota: TEMED é conhecido como um estabilizador de radicais livres. Os radicais livres pode acelerar a taxa de formação do polímero com persulfato de amónio (APS) a fim de catalisar a polimerização da acrilamida.</li>
	<li>Encha a garrafa de vidro com 4 mL de óleo mineral para gerar um fluxo contínuo.</li>
	<li>Inserir dois tubos para duas portas na tampa da garrafa de vidro como um reservatório de microfluidic: porta pneumática para aplicação de ar comprimido para o frasco de vidro para o compressor de ar e o porto de fluido para o fornecimento de óleo pressurizado para a rede de micro canal a garrafa de vidro. Conecte os tubos entre o frasco de vidro e o porto de óleo no dispositivo microfluidic.<ol>
<li>Conecte os tubos para as portas de duas solução no dispositivo microfluidic para suprir as duas soluções de bombas de seringa. Inserir os tubos à porta de saída a fim de transferir a microesfera gerada para o copo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina a taxa de fluxo da bomba de seringa para 0,4 - pressão de ar comprimido de ajuste de 0,7 mL/h. o compressor usando um regulador (82-116 kPa). Defina a velocidade de rotação (500 rpm) da barra de agitador magnético no copo de vidro em uma chapa quente. Acione a bomba de seringa e fornecer o ar comprimido gerado por um compressor externo para o frasco de vidro usando o controle ON/OFF de uma válvula eletromagnética13.</li>
	<li>Observe a formação de microesferas na geometria de fluxo-foco e solidificação de microesferas geradas no copo de vidro com um microscópio digital. Nota: A velocidade de produção e tamanho da microesfera dependem do caudal de soluções e a pressão aplicada para o fluxo de óleo mineral (tabela 2).
</li>
</ol>3. realização de poliacrilamida Oligo-microesferas conta
<ol><li>Para quantificação de hemocytometer, tomar uma pequena quantidade (aproximadamente 100 μL) de solução aquosa de poliacrilamida oligo-microesferas e coloque sobre o vidro hemocytometer e preencher suavemente a microesfera suspensão até o poço da câmara de contagem. Nota: Para obter mais detalhes, consulte http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.</li>
	<li>Use um microscópio e mão contador de contagem para contar microesferas em um conjunto de 16 quadrados. Em seguida, mover a hemocytometer para o próximo conjunto de câmara e continue contando até que todos os quatro conjuntos de 16 cantos são contados.</li>
	<li>Determinar a contagem média microesfera e calcular o número de microesferas a suspensão original do grânulo.</li>
	<li>Transferi 100 μL de microesferas para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Remova o sobrenadante com centrifugação (400 x g) suave e pipetagem.</li>
</ol>4. realização de hibridização de DNA na superfície do Polyacrylamide Oligomicrosphere
Nota: Uma idêntico DNA sonda com uma 5'-NH2-grupo em vez de 5'-acrytide modificação é adicionado na solução e testado para Ap-contendo microesferas em paralelo. Hibridização de DNA é mostradas na Figura 2. A solução de sondas (cAp) de Cy3-rotulado complementares do oligonucleotide deve ser colocada em um quarto escuro.
<ol><li>Resuspenda Cy3-cAp usando 100 μL de tampão de 1xTE (tampão TE: 10 mM Tris e 1μM EDTA, pH 8.0) para atingir uma concentração final de 100 μM. Por exemplo, resuspenda 1 pmol de cAp em 100 mL de tampão TE e transferir para um tubo de microcentrifugadora coberto com papel alumínio. Nota: Para sequências de vertente, consulte a tabela 3.</li>
	<li>Adicione 100 μM de Cy3-cAp para um tubo de microcentrifugadora estéril de 1,5 mL contendo microesferas de Ap-copolymerized.</li>
	<li>Bater os tubos algumas vezes para misturar e incubar a temperatura ambiente no escuro durante 1 h.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e remover o buffer residual através de pipetagem.</li>
	<li>Lavar três vezes com 500 μL de tampão TE.</li>
	<li>Resuspenda microesferas tocando suavemente o tubo de microcentrifugadora. Em seguida, repita a etapa 4.4.</li>
	<li>Coloque microesferas sobre a lâmina de vidro (75 x 50 mm) e cubra com folha de alumínio antes da imagem latente.</li>
</ol>5. assimétrica PCR para amplificação ssDNA
<ol><li>Prepare uma mistura de reagente PCR assimétrica para amplificar ssDNA para ser analisado. Descongele os reagentes no quadro 4 no gelo. Não mantenha a enzima de Taq polimerase (50 U / µ l) no gelo, mas prefiro guardá-la a-20 ° C até ser necessário.</li>
	<li>Vórtice delicadamente todos os reagentes e brevemente centrifugar tubos a 10.000 x g por 10 s.</li>
	<li>Combine todos os reagentes como descrito no tabela 4.
</li>
	<li>Colocar as amostras em um thermocycler e começar o PCR assimétrico nas seguintes condições: 25 ciclos (95 ° C por 30 s, 52 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s), 85 ° C por 5 min, segure a 4 ° C.</li>
</ol>6. micro-PCR para a amplificação ssDNA
Nota: Esta seção descreve o protocolo para amplificar ssDNA em um tubo de reação de PCR. Reações de microesfera-PCR foram realizadas em 50 μL de volume de reação. As sequências detalhadas usadas para amplificar ssDNA estão listadas na tabela 5. Neste caso, Ap na superfície das microesferas pode anneal para modelos aleatórios de DNA de forma complementar. Este é um passo muito importante para a produção de DNA complementar (cadeia de DNA antisentida, Figura 3). O DNA estendido é usado como um modelo para amplificação por PCR-microesfera.
<ol><li>Prepare a mistura de reagente microesfera-PCR. Descongele os reagentes na tabela 6 no gelo; no entanto, não mantenha a enzima de Taq polimerase no gelo. Armazená-lo a-20 ° C até ser necessário.</li>
	<li>Vórtice delicadamente todos os reagentes e brevemente centrifugar tubos a 10.000 x g por 10 s.</li>
	<li>Obter cerca de 25 ~ microesferas através de contagem microscópica. Nota: O número de microesferas no tubo de uma reação é calculado utilizando um microscópio com ampliação de 40 X. Cerca de 25 ~ microesferas são utilizadas para amplificação por PCR-microesfera. Informações mais detalhadas é na etapa 3.</li>
	<li>Combine todos os reagentes como descrito no tabela 6.
</li>
	<li>Colocar as amostras em um thermocycler e começar o PCR assimétrico nas seguintes condições: 25 ciclos (95 ° C por 30 s, 52 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s), 85 ° C por 5 min, segure a 4 ° C.</li>
	<li>Amplificação de seguir, adicionar 8 μL de 6 x tampão de carregamento e carregar 15 μL de cada amostra em gel de agarose 2%. Em seguida, executar eletroforese a 100 V por 35 min em 1 x TAE (Tris-Acetato-EDTA, 40 mM Tris Acetato, EDTA 1 mM, pH 8,2) reserva.</li>
</ol>7. confocal microscopia aquisição
Nota: Os resultados da hibridização da sonda de microesfera-DNA são imagens de um microscópio confocal. Análise de imagem é executada usando o ImageJ.
<ol><li>Corrigi hibridizadas microesferas para o palco do microscópio em um suporte.</li>
	<li>Selecione o laser (laser de hélio/Neon, linha de 543 nm) e ligá-lo no controle do laser.</li>
	<li>Selecione a lente objetiva no controle do microscópio.</li>
	<li>Selecione o filtro desejado para Cy3 e canal de controle de configuração.</li>
	<li>Começar o experimento e observar a amostra. Configurações para o microscópio confocal estão resumidas na tabela 7.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li>
<li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+%28AIRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li>
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<li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li>
<li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li>
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<li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1537519">Formation of dispersions using &#34;flow focusing&#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045793014002217">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).</li>
<li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li>
<li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Electrochemical+Society%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li>
<li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6(2003).</li>
<li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Contaminantes de dsDNA são um grande problema no ssDNA amplificação. Continua a ser difícil minimizar dsDNA amplificação em PCR amplificação assimétrica convencional15. Além disso, apesar de melhorias técnicas para gerar ssDNA permitiram-na aumentar a eficiência da taxa de transferência de amostra, ssDNA isolamento ainda é problemático devido a seus elevados custos e rendimentos de purificação incompleta.
PCR assimétrico é um dos métodos mais desafiadores usados quando ...

Single-stranded DNA (ssDNA) tem sido amplamente considerado como um elemento de reconhecimento molecular (ERM) devido a suas propriedades intrínsecas para hibridação de DNA-DNA1,2. O desenvolvimento de sistemas sintéticos ssDNA pode levar a aplicações biológicas, tais como o DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnóstico e detecção molecular integrada com base em interações complementares4,5.
Até à data, as partículas de polímero do micrômetro-escala tem sido com sucesso demonstradas usando dispositivos microfluídicos. Várias técnicas de microfluidic tem sido provadas para ser poderoso para produzir altamente homogêneas microesferas em fluxo contínuo no ambiente microchannel6,7.
No estudo de Lee et al . 8, uma plataforma baseada em gotículas microfluidic para a síntese de microfluidic de amplificação oligo-microesfera e ssDNA copolymerizable foi relatado. A plataforma microfluidic consiste de duas camadas PDMS (polidimetilsiloxano): uma parte superior com uma rede de canais microfluídicos para gerar microesfera e um parte plana de fundo. Estes consistem de três tipos de canais fluídico PDMS: 1) um fluxo de focagem canal para geração de gotículas, 2) é um canal de serpentino para misturar as duas soluções e 3) um canal de polimerização sequencial para solidificação de microesfera. Uma vez que dois fluxos imiscíveis são introduzidos em um único canal PDMS fluídico, os fluxos podem ser forçados através da estrutura de orifício estreito. Os comportamentos de fluxo como geometria do canal, taxa de fluxo e viscosidade afetam o tamanho e morfologia da microesfera. Portanto, o principal fluxo de líquido pode ser dividido em microescala monospheres9,10.
Aqui, um protocolo detalhado microesfera-PCR é fornecido para a amplificação do ssDNA. Em primeiro lugar, um processo de design do dispositivo baseado em gotículas microfluidic é descrito. Então, a maneira na qual poliacrilamida microesferas podem ser acrescidas com modelo de DNA aleatório de modo complementar, é explicada. Finalmente, um protocolo de microesfera-PCR para amplificação ssDNA é mostrado.

<table><tbody><tr><td>polidimetilsiloxano líquido, PDMS</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>Componentes do chip</td></tr><tr><td>40% Acrilamida: solução bis (19: 1)</td> <td>Bio-rad</td><td></td><td>1610140 Componentes de persulfato de amônio oligo-microesfera copolimerizável</td></tr><tr><td>, APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Endurecedor de acrilamida: solução bis</td></tr><tr><td>N, N, N&prime;, N&prime; -Tetrametiletilenodiamina, TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Catalisador de persulfato de amônio</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5904</td><td>Tabela 1. Solução III. Componente de reagentes de microesferas</td></tr><tr><td>Cy3 marcadas com sondas de oligonucleotídeos complementares</td><td>Bioneer</td><td>sintetizado</td><td>Tabela 3. Informações de sequência&nbsp;</td></tr><tr><td>sonda marcada com acridita ssDNA</td><td>Bioneer</td><td>sintetizada</td><td>Tabela 1. Solução I. Componente de reagentes de microesferas</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biosesang</td><td>&nbsp; T1016</td><td>Componentes do tampão TE, solução tampão de pH</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>Componentes do tampão TE, remoção de íons (Ca2+)</td></tr><tr><td>Ex taq</td><td>Takara</td><td>RR001A</td><td>amplificação de ssDNA</td></tr><tr><td>Microscópio confocal&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Identificando oligonucleotídeos exposição da superfície da microesfera</td></tr><tr><td>Microscópio de luz</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>eclipse 80i</td><td>Número de microesferas</td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td>amplificação de ssDNA Tratada</td></tr><tr><td>Corona portátil</td><td>Electro-Technic</td><td>BD-20AC Laboratório Corona Treater</td><td>Tratamento de superfície hidrofílico</td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>Como uma</td> placa <td>de aquecimento HI-1000</td><td>para cura de líquido PDMS</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>kd Scientific</td><td>78-1100</td><td>Fluxo uniforme do compressor da solução I e da solução II</td></tr><tr><td></td><td>Kohands</td><td>KC-250A</td><td>Controle de fluxo do</td></tr><tr><td>hemacitômetro de linha brilhante</td> da solução III <td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Número de microesferas</td></tr></tbody></table>

uma abordagem microfluidic gotículas e amplificação por pcr-microesfera para single-stranded dna amplicons

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Baseado em gotículas microfluídica permite a produção confiável de microesferas homogêneas no canal microfluídicos, fornecendo controlado tamanho e morfologia da microesfera obtida. Uma microesfera copolymerized com uma sonda de acrydite-DNA foi fabricada com sucesso. Diferentes métodos como PCR, digestão do exonuclease e isolamento em grânulos magnéticos streptavidin-revestido assimétrica podem ser usados para sintetizar o DNA de cadeia simples (ssDNA). No entanto, estes métodos eficientemente não utilizam grandes quantidades de ssDNA altamente purificado. Aqui, descrevemos um protocolo de microesfera-PCR detalhando como ssDNA pode ser eficientemente amplificado e separado do dsDNA simplesmente por pipetagem de um tubo de reação de PCR. A amplificação do ssDNA pode ser aplicada como reagentes potenciais para a DNA microarray e processos de DNA-SELEX (evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial).

A plataforma fabricada poliméricos baseados em gotículas microfluidic consiste de duas camadas PDMS (Figura 1a). Três tipos de redes de canais microfluídicos são usados para a geração de microesferas: geometria 1) fluxo de focagem como mostrado na Figura 1b, 2) é um canal de serpentino para misturar a solução, eu e a solução II e 3) um canal de polimerização para microesfera solidificação. A altura de todos os canais era 60 μm. O...

Este trabalho fornece um método para a fabricação de plataformas baseadas em gotículas microfluidic e a aplicação de microesferas de poliacrilamida para amplificação por PCR-microesfera. O método de PCR-microesfera torna possível obter single-stranded DNA amplicons sem separar o DNA de cadeia dupla.

Uma abordagem Microfluidic gotículas e amplificação por PCR-microesfera para Single-Stranded DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na técnica combinatória do sistema microfluido e no campo da biotecnologia molecular, como dispositivos microfluidos e método de assimetria PCR. As principais vantagens desta técnica são a geração eficiente de microesferas altamente homogeneizadas e a produção de DNA mono-encalhado sem quaisquer etapas adicionais de separação. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico ou terapia de várias doenças.Como a geração de DNA de uma única cadeia é a chave para ensaios ap-ta-mo-sis, ele pode ser usado para detecção e tratamento. Embora este método possa fornecer insights sobre o sistema microfluido tridimensional no MEMS, ele também pode ser aplicado a outros sistemas usados para detecção e tratamento de doenças. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão para controlar adequadamente os fluidos de fluir na direção inversa.A demonstração visual deste método é fundamental para observar a formação da microesfera na geometria de foco de fluxo e solidificação das microesferas geradas. Primeiro, prepare 20 mililitros de PDMS líquido pré-polímero misturando polímero base e catalisador em uma proporção de 10 para um. Despeje

a-droplet-based-microfluidic-approach-microsphere-pcr-amplification

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Bioengineering

Bioengenharia

Gota plataformas baseadas microfluídicos são candidatos promissores para a experimentação de alto rendimento, uma vez que são capazes de gerar picolitros, auto-compartimentada vasos barata a taxas kHz. Através da integração com rápido, sensível e de alta resolução de fluorescência métodos espectroscópicos, a grande quantidade de informações geradas nesses sistemas podem ser eficientemente extraído, aproveitada e utilizada.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

Neste vídeo, apresentamos um procedimento passo a passo para gerar nanogotículas emulsionadas para detectar ácidos nucléicos alvo por reação em cadeia da polimerase digital ou dPCR.

Reação em cadeia da polimerase digital de gotículas: um método para gerar reações de PCR de nanogotículas para detectar mutações tumorais raras

Este vídeo descreve a técnica de amplificação de DNA de fita simples usando microesferas de polímero revestidas com oligonucleotídeos em uma reação de tubo único. Este processo produz DNA puro de fita simples, que pode ser usado posteriormente para sequenciamento de DNA e análise de microarray.

Reação em cadeia da polimerase da microesfera para amplificar o DNA de fita simples

Este vídeo demonstra a técnica de reação em cadeia da polimerase por gotículas multiplex para a quantificação simultânea de regiões de DNA metilado em diferentes populações de glóbulos brancos como um biomarcador precoce para diagnóstico clínico e prognóstico.

Reação em cadeia da polimerase de gotículas multiplex para detectar metilação do DNA em leucócitos

Este vídeo demonstra a utilidade da PCR digital em um formato chip-in-a-tube para a detecção de variações de nucleotídeo único em amostras de DNA. Uma única reação de PCR é particionada em câmaras que atuam como reações de PCR independentes, e a detecção de sinais de fluorescência dos alvos amplificados nas câmaras é usada para calcular a frequência do alelo variante na amostra.

PCR digital baseado em chip em tubo para quantificação de variantes de nucleotídeo único

Descrevemos um ensaio digital de ponto final para quantificar ácidos nucléicos com uma leitura simplificada (analógica). Medimos a fluorescência em massa de ensaios digitais baseados em gotículas usando uma máquina de qPCR padrão em vez de instrumentação especializada e confirmamos nossos resultados por microscopia.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Sequenciamento de célula única revela a heterogeneidade genotípica em sistemas biológicos, mas as tecnologias atuais não têm a produtividade necessária para a criação de perfil profundo de função e composição da Comunidade. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho microfluidic para sequenciamento &gt; 50.000 monocelulares genomas de diversas populações de células.

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar com precisão a múltiplas alterações genéticas de uma região de destino em uma única reação usando ddPCR de entrega e um único par de testes de hidrólise.

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Marcadores epigenéticos são usados para subtipagem de glóbulos brancos (WBC) através da quantificação dos padrões de metilação de DNA. Este protocolo apresenta um método de reação em cadeia de polimerase de gotícula multiplex (mdPCR) usando um dispositivo microfluido baseado em elastômero termoplástico (TPE) para geração de gotículas permitindo quantificação de alvo específica e multiplex específica da contagem diferencial WBC.

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR usando dispositivo gerador de gotícula de polímero para diagnósticos hematológicos

Ensaios de gotículas de água em óleo são úteis para química analítica, evolução enzimático e análise de células únicas, mas normalmente requerem microfluidos para formar as gotículas. Aqui, descrevemos a emulsificação de modelos de partículas, uma abordagem microfluida livre para realizar ensaios de gotículas.

Emulsificação de modelos de partículas permite ensaios de gotículas livres de microfluídicos

Aprenda a fabricar plataformas microfluídicas baseadas em gotículas usando microesferas de poliacrilamida para amplificação por PCR-microesfera. Este método permite gerar amplicons de DNA fita simples sem etapas adicionais de separação.

Uma abordagem Microfluidic gotículas e amplificação por PCR-microesfera para Single-Stranded DNA Amplicons

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