Fazendo induzida por conjugação fluorescentes peguilado vírus-como partículas pela química do bissulfeto de Dibromomaleimide
27 de maio de 2018
Aqui, apresentamos um procedimento para funcionalizar fluorescente os dissulfetos na Qβ VLP com dibromomaleimide. Descrevemos Qβ expressão e purificação, a síntese de moléculas de dibromomaleimide-acrescida e a reação de conjugação entre dibromomaleimide e Qβ. A partícula de conjugado fluorescente amarela resultante pode ser usada como uma sonda de fluorescência no interior das células.
O objetivo geral deste método de bioconjugação é funcionalizar fluorescentemente partículas semelhantes a vírus contendo dissulfetos. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a reação de bioconjugação para partículas semelhantes a vírus que possuem um número limitado de resíduos de aminoácidos passíveis de funcionalização. A principal vantagem desta técnica é que, utilizando uma única reação, novos grupos funcionais podem ser introduzidos e fluoróforos induzidos pela conjugação podem ser formados simultaneamente. Além do Q-Beta, acreditamos que esta reação possa ser aplicada a quaisquer partículas semelhantes a vírus que possuam ligações dissulfeto.
Antes de iniciar o procedimento para expressar o bacteriófago Q-Beta, limpe a área da bancada com uma solução de hipoclorito de sódio:etanol na proporção 1:1. Em um ambiente asséptico, prepare dois cultivos iniciais de três mililitros adicionando colônias isoladas de E. coli BL21 em meio SOB. Incube os cultivos durante a noite em sala a 37 graus Celsius e umidade relativa de 0%, sob agitação a 250 rpm. No dia seguinte, retire os dois cultivos iniciais de três mililitros do agitador e, em ambiente asséptico, transfira cada cultivo inicial para um frasco Erlenmeyer de dois litros com barbatanas contendo um litro de meio SOB fresco. Coloque os dois frascos com meio inoculado no agitador a 250 rpm, na sala a 37 graus Celsius e umidade relativa de 0%. Incube as bactérias até que atinjam uma densidade óptica a 600 nanômetros (OD 600) entre 0,9 e 1,0. Isso geralmente leva cerca de cinco horas. Quando os cultivos atingirem a OD 600 desejada, utilize uma pipeta P1000 para adicionar um mililitro de IPTG um-molar a cada frasco, a fim de induzir a expressão proteica. Deixe os frascos no agitador na sala aquecida durante a noite.
Na manhã seguinte, retire os frascos do agitador, transfira o conteúdo de cada frasco para uma garrafa de um litro e centrifugue a 20.621 ×g a quatro graus Celsius por uma hora para colher as células. Após a conclusão da centrifugação, descarte o sobrenadante vertendo-o em um frasco com cerca de cinco mililitros de hipoclorito para matar as bactérias.
Para coletar o pellet celular, use uma espátula para raspar o pellet celular do fundo do frasco de centrífuga e transfira o pellet para um tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Para iniciar o procedimento de purificação do Q-Beta, re-suspenda cada pellet celular com 20 a 30 mililitros de tampão de fosfato de potássio 0,1 molar, pH 7. Certifique-se de que a re-suspensão não contenha grumos. Lisar as células utilizando um processador microfluidizador de acordo com o protocolo do fabricante. Realize a lise celular pelo menos duas vezes para aumentar o rendimento das partículas. Transfira os lisados para frascos de centrífuga de 250 mililitros e centrifugue a 20.621 × g a quatro graus Celsius por uma hora. Meça o volume do sobrenadante em mililitros. Multiplique esse valor por 0,265 e, em seguida, adicione ao sobrenadante essa quantidade em gramas de sulfato de amônio. Adicione uma barra de agitação e agite em um agitador magnético a 200 rpm a quatro graus Celsius por pelo menos uma hora para precipitar a proteína. Centrifugue em frascos de 250 mililitros a 20.621 × g a quatro graus Celsius por uma hora. Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet com cerca de 40 mililitros de tampão de fosfato de potássio 0,1 molar, pH 7. Adicione ao amostra bruta volumes iguais de clorofórmio:n-butanol na proporção 1:1 e misture por vortexagem por alguns segundos. Transfira a mistura para um tubo de 38 mililitros. Centrifugue a 20.621 × g a quatro graus Celsius por 30 minutos. Utilize uma pipeta para recuperar a camada aquosa superior. Tenha cuidado para não coletar qualquer parte da camada gelatinosa que se formou entre as camadas aquosa e orgânica.
Em seguida, descongele gradientes de sacarose pré-fabricados de 65 a 40%. Aplique cerca de dois mililitros do extrato em cada gradiente.
Ultra-centrifugue a 99.582 × g a quatro graus Celsius por 16 horas com desaceleração livre. Quando a ultra-centrifugação estiver concluída, ilumine com uma luz de diodo emissor de luz sob cada tubo para confirmar a visibilidade de uma faixa azul. Utilize uma seringa com agulha longa para recuperar essas partículas. Ultra-centrifugue as partículas a 370.541 × g a quatro graus Celsius por 2,5 horas. O pellet resultante de partículas purificadas deve ser transparente. Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet com tampão de fosfato de potássio 0,1-molar, pH 7.
Este esquema mostra a conjugação que será demonstrada. Utilizam-se 10 equivalentes de tris(2-carboxietil)fosfina ou TCEP em relação aos dissulfetos em um miligrama de Q-Beta para reduzir todos os dissulfetos e gerar os capsídeos de Q-Beta reduzidos à temperatura ambiente em uma hora. Pouco antes da redução dos dissulfetos no Q-Beta, prepare uma solução fresca de TCEP.
Dissolva 0,002 gramas de TCEP e um mililitro de água ultra-pura para preparar uma solução estoque 100X. Adicione 200 microlitros de Q-Beta a cinco miligramas por mililitro em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução estoque 100X de TCEP ao tubo de microcentrífuga. Incube à temperatura ambiente por uma hora.
Enquanto isso, prepare a solução de polietilenoglicol dibromomaleimida ou DB-PEG para a reação posterior de reconstituição de dissulfetos reduzidos. Dissolva 0,0017 gramas de DB-PEG em 100 microlitros de dimetilformamida. Adicione 680 microlitros de solução de fosfato de sódio 10 milimolar, pH 5. Em seguida, adicione o Q-Beta reduzido à solução de DB-PEG e observe o processo de mistura sob uma lâmpada de luz ultravioleta portátil de 365 nanômetros. Após a mistura, uma fluorescência amarela brilhante deve tornar-se imediatamente visível. Deixe a reação prosseguir durante a noite à temperatura ambiente em agitação rotativa.
Na manhã seguinte, purifique a mistura de reação por meio de filtro centrífugo utilizando PBS 1X a 3.283 ×g a quatro graus Celsius por 20 minutos. Por fim, monitore a conjugação por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS não redutora e eletroforese em gel de agarose nativa.
A conjugação de DB-PEG no Q-Beta foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS não redutora sob luz UV e coloração com azul de Coomassie. Todas as bandas fluorescentes co-localizaram-se com a coloração azul de Coomassie, indicando uma conjugação bem-sucedida. A integridade dos conjugados Q-Beta-PEG foi confirmada por eletroforese em gel de agarose nativa e microscopia eletrônica de transmissão.
O micrografia superior mostra Q-Beta-maleimida ou Q-Beta-M e a micrografia inferior mostra Q-Beta-PEG. A espectroscopia de fluorescência de Q-Beta-M e Q-Beta-PEG em tampão fosfato de potássio 0,1 molar apresentou um máximo de excitação em torno de 400 nanômetros e um máximo de emissão entre aproximadamente 540 e 550 nanômetros. Quando Q-Beta-PEG foi incubado com células de macrófago de camundongo em meio DMEM sem soro, seguido por coloração nuclear, as imagens de co-localização mostram que partículas fluorescentes amarelas foram internalizadas pelas células e podem ser rastreadas após quatro horas de incubação.
Em contraste, as partículas semelhantes a vírus Q-Beta não funcionalizadas apresentam fluorescência desprezível.
Este protocolo pode ajudar pesquisadores a purificar o Q-Beta em quatro dias e realizar a reação de conjugação com reenlaçamento noturno. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a reação de conjugação funciona melhor em condições ácidas, como pH 5.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar o VLP do Q-Beta e religar as ligações dissulfeto com compostos dibromo-maleimida para produzir um VLP marcado com fluorescência. Após seu desenvolvimento, esta técnica forneceu aos pesquisadores uma alça funcional adicional que pode ser usada para dual-funcionalizar a superfície externa do bacteriófago Q-Beta.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método de bioconjugação para funcionalizar fluorescentemente partículas semelhantes a vírus contendo dissulfeto, especificamente VLPs de Qβ. A técnica permite a introdução de novos grupos funcionais e a formação de fluoróforos induzidos por conjugação em uma única reação.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Conjugação bioquímica
- Partículas semelhantes a vírus
- Marcação fluorescente
Antecedentes
- As ligações dissulfeto em partículas semelhantes a vírus limitam as opções de funcionalização.
- As sondas fluorescentes são essenciais para estudos celulares.
- O bacteriófago Qβ serve como modelo para este método.
- As técnicas assépticas são cruciais para experimentos bem-sucedidos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para funcionalizar dissulfetos em VLPs de Qβ.
- Permitir o estudo de reações de bioconjugação em partículas semelhantes a vírus.
- Criar sondas fluorescentes para aplicações celulares.
Métodos Utilizados
- Expressão e purificação do bacteriófago Qβ.
- Síntese de moléculas funcionalizadas com dibromomaleimida.
- Reação de conjugação entre dibromomaleimida e Qβ.
- Uso de técnicas assépticas na preparação de culturas iniciadoras.
Resultados Principais
- Funcionalização fluorescente bem-sucedida de VLPs de Qβ.
- Formação de partículas conjugadas fluorescentes amarelas.
- Aplicação potencial do método a outras partículas semelhantes a vírus.
- Demonstração de uma única reação introduzindo múltiplos grupos funcionais.
Conclusões
- O método rotula efetivamente com fluorescência partículas semelhantes a vírus que contêm dissulfetos.
- Essa técnica pode aprimorar o estudo da bioconjugação em virologia.
- Aplicações futuras podem se estender a diversas partículas semelhantes a vírus que possuem ligações dissulfeto.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a bifuncionalização de partículas semelhantes a vírus mediante a introdução de ligantes sintéticos e a geração de fluorescência intrínseca em uma única etapa, solucionando as limitadas opções de bioconjugação em VLPs ricos em dissulfetos. As sondas fluorescentes resultantes permitem estudos de captação celular e o rastreamento em tempo real in vitro, aprimorando a validação de alvos e os fluxos de trabalho de desenvolvimento de ensaios. Ao ampliar o conjunto de ferramentas químicas para modificação de VLPs, a técnica aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de entrega de cargas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da funcionalização específica de sítios em ligações dissulfeto expostas ao solvente em VLPs.
- Valor Operacional: Combina a fixação de ligantes e a geração de fluoróforos em uma única reação, simplificando a síntese de sondas para estudos de interação com alvos.
- Valor Preditivo: Gera VLPs fluorescentes rastreáveis que permitem ensaios de internalização celular e modelagem de biodistribuição.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz lotes padronizados de partículas virais pseudotipadas (VLP) marcadas com fluorescência, adequados para triagem de alto conteúdo e ensaios de ligação.
- Valor Operacional: Utiliza conjuntos de filtros comercialmente disponíveis (excitação ~400 nm, emissão 540–550 nm) para detecção fácil, sem necessidade de instrumentação personalizada.
- Escalabilidade: Permite a preparação de bibliotecas de sondas para estudos de relação estrutura-atividade em interações ligante-receptor.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: VLPs fluorescentes demonstram captação celular em modelos de macrófagos, apoiando o perfil de biodistribuição e farmacocinética.
- Redução de Riscos: Permite a avaliação de modificações na superfície quanto à estabilidade do VLP e reconhecimento imune antes de estudos in vivo.
- Alinhamento de Biomarcadores: Facilita a correlação da localização do VLP com marcadores celulares em fluxos de trabalho de imagem de co-localização.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a produção de partículas tipo vírus até a identificação de compostos líderes, permitindo a geração rápida de sondas funcionalizadas para triagem subsequente e estudos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a modificação dual de VLPs com grupos rastreáveis e terapêuticos.
- Triagem: Gera VLPs fluorescentes padronizados para ensaios quantitativos de ligação e internalização.
- Análises: Fornece leituras baseadas em fluorescência para quantificar interações entre VLPs e células e a eficiência de conjugação.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico por meio da avaliação comprovada da captação por macrófagos e da estabilidade.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma modular para funcionalização de VLPs aplicável a múltiplos sistemas contendo dissulfetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao permitir sondas VLP precisas e rastreáveis para estudos do mecanismo de ação.
- Valor Operacional: Padroniza a conjugação em condições ácidas definidas (pH 5) para garantir reprodutibilidade entre lotes.
- Valor Estratégico: Reduz a necessidade de etapas separadas de marcação e purificação, melhorando a eficiência de capital no desenvolvimento de sondas.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer dados funcionais precoces sobre construtos baseados em VLP.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em expressão proteica, purificação e manipulação anaeróbica de proteínas contendo dissulfetos.
- Exige acesso a microfluidizadores, ultracentrífugas e sistemas de detecção de fluorescência com conjuntos de filtros apropriados.
- Exige técnica asséptica e conhecimento sobre endotoxinas para aplicações celulares.
- Pode ser necessária otimização ao estender o método a VLPs com acessibilidade de dissulfetos ou carga superficial variáveis.
- Limitação prática: A eficiência depende da manutenção de condições redutoras durante o reenlaçamento de dissulfetos e da prevenção de degradação oxidativa.
