Name: Fazendo induzida por conjugação fluorescentes peguilado vírus-como partículas pela química do bissulfeto de Dibromomaleimide (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprenda a funcionalizar fluorescentemente partículas semelhantes a vírus contendo dissulfeto usando química de dibromomaleimida. Este método permite introduzir novos grupos funcionais e formar fluoróforos induzidos por conjugação em uma única reação.

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J.J.G. reconhece a Fundação Nacional de ciência (DMR-1654405) e câncer prevenção Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) pelo seu apoio.

1. preparação
<ol><li>Fazer o ágar-ágar lisogenia caldo (LB) e despeje placas12.</li>
	<li>
Transforme o BL21(DE3) com um plasmídeo pET28 que contém a sequência de proteínas de revestimento wtQβ.
	<ol>
<li>Descongele células competentes de Escherichia coli BL21(DE3) em um banho de gelo. Colocar 50 μL de células em um tubo de microcentrifugadora.</li>
		<li>Adicionar 2 μL do plasmídeo em um tubo e agite suavemente o tubo. Então incube no gelo por 30 min.</li>
		<li>Calor-choque as células para 45 s num banho de água que é exatamente a 42 ° c. Coloque o tubo de volta no banho de gelo imediatamente após calor-choque e incubar durante 5 min.</li>
		<li>Adicione 950 μL de LB mídia que não contenha qualquer antibiótico.</li>
		<li>Agite a cultura a 200 rpm por 60 min a 37 ° C.</li>
		<li>Placa 100 μL da cultura em placas de ágar LB (com canamicina) e incube a placa durante a noite a 37 ° C. Selecione colônias brancas quando necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Faça mídia Super ideal caldo (SOB).
	<ol>
<li>Autoclave dois 2 L confusos Erlenmeyers num ciclo superdry.</li>
		<li>Em um ambiente asséptico, pesar e adicionar 20,0 g de triptona, extrato de 5,0 g de levedura, 2,469 g de sulfato de magnésio anidro, 0,584 g de cloreto de sódio e 0,186 g de cloreto de potássio para cada balão.</li>
		<li>Trazer o volume de 1 L com água ultrapura em cada balão e autoclave ao ciclo de líquido.</li>
		<li>Uma vez que a mídia SOB alcançou a temperatura após a autoclavagem, adicionar 1 mL de canamicina (100mg/mL) para cada litro de mídia e armazenar a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fazer o tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
	<ol>
<li>Fazer 1 M potássio monobásico solução dissolvendo-se 68,045 g de potássio monobásico em 500 mL de água ultrapura.</li>
		<li>Fazer 1 M potássio dibásico solução dissolvendo 87,09 g de potássio dibásico em 500 mL de água ultrapura.</li>
		<li>Adicione 38,5 mL de solução de potássio monobásico e 61,5 mL de potássio dibásico para uma garrafa de 1 L.</li>
		<li>Ajustar o pH a 7.00, se necessário e trazer para um volume de 1 L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Faça 5 – 40% gradientes de sacarose em tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
	<ol>
<li>Em tubos de centrífuga de 50 mL, prepare soluções com sacarose 5 – 40% (aumentando em incrementos de 5%) dissolvido em tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).</li>
		<li>Depósito 3,3 mL da solução de sacarose 5% na parte inferior de um tubo de fundo redondo de policarbonato 38 mL utilizando uma seringa de agulha longa e repita isto para cinco outros tubos.</li>
		<li>Depositar cuidadosamente 3,3 mL da solução de sacarose 10% na parte inferior do tubo e Retire cuidadosamente a agulha como para não incomodar o gradiente. Repita para os outros cinco tubos. 
		 </li>
	</ol>
</li>
	<li>Continue a depositar camadas 3,3 mL das soluções de sacarose, aumento de 15% para 40% em cada tubo, enquanto sendo cuidadoso para não perturbar o gradiente.</li>
	<li>Quando completo, cobrir os topos dos gradientes com papel alumínio e armazene a-80 ° C.</li>
</ol>2. a expressão de Qβ
<ol><li>Limpe a área com água sanitária de 1:1 (etanol) banco.</li>
	<li>Faça dois fermentos de 3 mL em um ambiente asséptico adicionando única colônias de Escherichia coli BL21(DE3) em 3 mL de mídia SOB um ambiente asséptico.</li>
	<li>Cresce num agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% de umidade relativa (rH) durante a noite.</li>
	<li>
Inocule a cultura em mídia SOB:
	<ol>
<li>Tire o agitador ambos os fermentos de 3 mL e, em um ambiente asséptico, despeje cada cultura starter em um dos dois 2L perplexo Erlenmeyers com 1 L de mídia de soluço fresca em cada um.</li>
		<li>Coloque a mídia inoculada num agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% rH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cresce a bactéria num agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% rH até OD600 atinge 0,9 – 1.0.</li>
	<li>Adicione 1 mL de 1 M isopropílico β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) usando uma pipeta P1000 para induzir a expressão da proteína.</li>
	<li>Deixe a mídia no agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% rH durante a noite.</li>
	<li>Remova mídia de agitador da manhã seguinte e centrífuga usando garrafas de 1000ml a 20.621 × g por 1 h a 4 ° C para colher as células.</li>
	<li>
Desprezar o sobrenadante e coletar o centrifugado.
	<ol>
<li>Despeje o sobrenadante para um balão com cerca de 5 mL de água sanitária para matar as bactérias. Isso é lixo.</li>
		<li>Use uma espátula para raspar o centrifugado do fundo da garrafa centrífuga e colocar a pelota em um tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. purificação de Qβ
<ol><li>Ressuspender as células com ~ 20 a 30 mL de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).</li>
	<li>Verifique se a ressuspensão tem sem pedaços e lisar as células usando um processador de microfluidizer de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de materiais). Lise as células pelo menos duas vezes para aumentar o rendimento das partículas.</li>
	<li>Centrifugue o lisado em garrafas de 250 mL centrífuga a 20.621 x g durante 1 hora a 4 ° C.</li>
	<li>Descartar a pelota e medir o volume de sobrenadante em mL. Multiplique esse valor por 0,265 e adicionar essa quantidade de g de sulfato de amônio para o sobrenadante.</li>
	<li>Misture a 4 ° C, durante pelo menos 1 h em um prato misture a 200 rpm para precipitar-se a proteína.</li>
	<li>Centrifugue em frascos de 250 mL a 20.621 x g, durante 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com cerca de 10 mL de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).</li>
	<li>Adicione volumes iguais de clorofórmio/n-butanol de 1:1 para a amostra bruta e mistura num Vortex durante alguns segundos.</li>
	<li>Centrifugue em tubos de 38 mL a 20.621 × g por 30 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Recupere a camada aquosa superior utilizando uma pipeta Pasteur. Seja cauteloso para não tomar qualquer do gel como camada que se formou entre a camada aquosa e orgânica.</li>
	<li>Descongelar o seis gradientes de sacarose pré-fabricados de 5-40% e carregar cerca de 2 mL do extrato para cada um.</li>
	<li>Se a 99.582 x g, durante 16 h a 4 ° C, com desaceleração livre.</li>
	<li>Brilha uma luz emitindo luz de diodo (LED) em cada tubo e uma faixa azul deve tornar-se visível. Recupere essas partículas com uma seringa de agulha longa.</li>
	<li>Ultrapellet as partículas a 370.541 x g, durante 2,5 h a 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender o transparente de partículas purificadas com tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).</li>
</ol>4. quantificação e confirmação do produto
<ol><li>Use o ensaio de Bradford para quantificar o produto13.</li>
	<li>Reduzindo a execução e não de redução de sódio Dodecil sulfato de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para confirmar o produto14. Nota: Reduzir SDS-PAGE é usado para confirmar o peso molecular da proteína do revestimento; não-reduzir SDS-PAGE é para confirmar a estrutura de ordem superior.</li>
</ol>5. conjugação DB compostos em Qβ
<ol><li>
Reduza a dissulfetos na Qβ.
	<ol>
<li>Dissolver 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) (TCEP) de fosfina em 1 mL de água ultrapura, tornar-se uma solução estoque de 100 x. Nota: Prepare TCEP fresco antes da redução.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de Qβ (5 mg/mL) em um tubo de microcentrifugadora.</li>
		<li>Siga pela adição de 20 µ l de solução-mãe de 100 x TCEP.</li>
		<li>Incube a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Re-ponte dissulfeto reduzido usando dibromomaleimide polietileno glicol (PEG-DB).
	<ol>
<li>Dissolva 0,0017 g de dibromomaleimide-polietileno glicol (PEG-DB) em 100 µ l de DMF.</li>
		<li>Adicione 680 µ l de solução de fosfato de sódio de 10 mM (pH 5,00).</li>
		<li>Adicionar reduzida Qβ na solução de DB-PEG e observar o processo de mistura sob uma lâmpada de UV 365 nm. A fluorescência amarela brilhante pode ser visualizada imediatamente com um 365 nm portátil UV lâmpada em cima da mistura.</li>
		<li>Deixe a reação prosseguir durante a noite em temperatura ambiente (RT) em um espeto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificar a mistura de reação pelo filtro centrífugo (COMW = 10 kDa) três vezes usando 1X PBS a 3.283 x g por 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Monitore a conjugação, não reduzindo SDS-PAGE e eletroforese em gel de agarose nativo. Nota: VIPs executar como partículas intactas em gel de agarose nativo, e eles são separados com base em sua carga, tamanho e forma.</li>
</ol>

<ol><li>Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Virus-Based+Polymer-Protein+Nanoparticles+by+Atom+Transfer+Radical+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).</li>
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<li>Castaneda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mild+Synthesis+of+N-functionalised+Bromomaleimides%2C+Thiomaleimides+and+Bromopyridazinediones%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Lett%22%5BJournal%5D)">A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones.</a> Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).</li>
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<li>Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functionalized+Bacteriophage+Q%CE%B2+as+a+Photocaged+Drug+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier.</a> Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Comparado a purificação de proteínas menor, um único passo na purificação do bacteriófago Qβ é a centrifugação gradiente de sacarose. Após a etapa de extração de clorofórmio/n-butanol, Qβ ainda mais purified usando gradientes de sacarose 5-40%. Durante a centrifugação, as partículas são separadas com base em seus tamanhos. Partículas maiores viajam à região de densidade mais elevada, enquanto que partículas menores fica na região da baixa densidade. Qβ viaja para o terço inferior do gradiente e permanece lá enquanto impu...

Usar capsids virais nanométricas emergiu como um campo excitante, que visa alargar o âmbito de aplicações em pesquisa biomédica1,2,3. Recombinantes expressas partículas vírus-like (VLP) são estruturalmente derivadas de vírus, mas falta-lhes o material genético viral original tornando-os não-infecciosa nanopartículas proteicas. Como as características de superfície são geneticamente programadas e cada capsídeo é expressa forma idêntica aos antes e depois dela, é possível saber a localização e o número de cadeias de lado reativo dos aminoácidos com precisão atomística. Em muitos casos, ambas as superfícies exteriores e interiores possuem muitos tipos de solvente expostas aminoácidos, que podem ser viável acrescidos através de reações de bioconjugation - reações que formam ligações covalentes entre uma biomolécula e sintético molécula de4,5.
Reações de Bioconjugation ajudam biomoléculas de interesse têm as mais diversas funcionalidades de uma forma relativamente simples. Moléculas de interesse, tais como drogas terapêuticas6, etiquetas fluorescentes7 e polímeros8,9 podem ser pre-sintetizadas e caracterizadas antes de que estão ligados na superfície de VIPs. Um VIP particularmente comum em biomedicina e pesquisa de biomateriais foi o VIP com base em Qβ do bacteriófago, que, como recombinantes expressas, são 28 nm icosahedral capsídeo viral10. Os locais mais comuns de reação em Qβ são lisinas por uma larga margem, embora nós comunicaram recentemente a conjugação bem sucedida11 de compostos dibromomaleimide para os dissulfetos reduzidos que revestem os poros da Qβ através de uma reação de Haddleton-Baker. A reação procede com bom rendimento e, igualmente importante, sem perder a estabilidade térmica das partículas. Ao mesmo tempo, esta reação gera fluorescência induzida por conjugação, que pode ser usada para rastrear a absorção destas partículas em células. Neste trabalho, demonstramos a conjugação de polietileno glicol (PEG) sobre a superfície da Qβ através da reação de Haddleton-Baker, que resulta em um fluoróforo amarelo brilhante. Estas partículas podem ser rastreadas então como eles estão tomados por células. O protocolo aqui ajudará pesquisadores gerar novo peguilado fluorescente nanopartículas proteicas baseadas em Qβ, apesar de seus princípios são aplicáveis a um dos muitos outros VIPs contendo solventes dissulfetos expostos.

<table><tbody><tr><td>Caldo LB (Miller)&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Triptona, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Levedura, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio anidro</td><td>P212121</td><td>CI-06808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio (ACS cristalino / certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Elga PURELAB Flex 3 Sistema de purificação de água</td><td>Fisher Scientific</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico anidro Fisher</td><td>Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>S25590B</tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>096-041053</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Amônio</td><td>P212121</td><td>KW-0066-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Alfa Aesar</td><td>32614-M6</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td></td></tr><tr><td>SW 28 Ti Rotor, Balde Oscilante, Alumínio</td><td>Beckman Coulter</td><td>342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Conjunto</td><td></td>de Balde</tr><tr><td>Tipo 70 Ti Rotor, Ângulo Fixo, Titânio, 8 x 39 mL,</td> <td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Ensaio de Proteína</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23200</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Hydrochloride</td><td>Research Products International</td><td>T60050-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63734-AC</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Tris(2-carboxietil)fosfina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>2 3-Dibromomaleimida 97%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>553603-5G</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol</td><td>Alfa Aesar</td><td>41561-22</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424375000</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida / bis-Acrilamida</td><td>P212121</td><td>RP-A11310-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771-100G</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-100</td><td></td></tr><tr><td>FV3000 microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>FV3000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Revólver Labnet Ajustável Rotator&nbsp;</td><td>Thomas Scientific&nbsp;</td><td>1190P25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de Alto Desempenho Sorvall de 1000 mL, PC, com Tampa de Alumínio&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>010-1459</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de Centrífuga Nalgene com Tampas, Copolímero de Polipropileno</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0250</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Tubos de fundo redondo; 38 mL; PC</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380</td><td></td></tr><tr><td>2 L Frascos Erlenmeyer de boca estreita com borda resistente</td> Unidades de filtro centrífugo <td>Pyrex</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>M-110P Microfluidizer Materials Processor</td><td>Microflufluidics</td><td>M-110P</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Tubos de centrífuga de fundo redondo de policarbonato de alta velocidade</td><td>Thermo Garrafa Scientific</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>, com Montagem de Tampa, Policarbonato</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro, Graduado - Polipropileno 250 mL</td><td>Esterilizadores a Vapor da Série PolyLab</td><td>80005</td><td></td></tr><tr><td>533LS-E</td><td>Getinge</td><td>533LS-E</td><td></td></tr><tr><td>TrueLine, Placa de Cultura de Células, Tratada, PS, 96 Poços, com Tampa</td><td>LabSource</td><td>D36-313-CS</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga Cônica Falcon 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Microcentifuge: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>VWR Os-500 Agitador Orbital</td><td>VWR Scientifc Products</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Handcast systems</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td></td></tr><tr><td>Polipropileno, 250 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofluorômetro NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3300</td><td></td></tr><tr><td>Long Needle&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>7693</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Seringas de 5 a 6 cc Luer Lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-46</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>P100 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipetman</td><td>Gilson</td><td></td><td></td>F144802</tr><tr><td>Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance</td> Tecnologia <td>de Ponderação Inteligente</td><td>IWT_PM100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubo de Centrífuga Cônica de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 poços, 50 &micro; l</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1084</td><td></td></tr></tbody></table>

fazendo induzida por conjugação fluorescentes peguilado vírus-como partículas pela química do bissulfeto de dibromomaleimide

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

A ascensão recente em partículas vírus-like (VLP) em biomédica e pesquisa de materiais pode ser atribuída à sua facilidade de biossíntese, tamanho discreto, programação genética e biodegradabilidade. Enquanto eles são altamente favoráveis para reações de bioconjugation para a adição de ligantes sintéticos em sua superfície, o intervalo em metodologias de bioconjugation sobre estes capsids nascidos aquosas é relativamente limitado. Para facilitar a direção da pesquisa de biomateriais funcionais, devem considerar-se reações de bioconjugation não-tradicionais. A reação descrita neste protocolo usa dibromomaleimides para introduzir a nova funcionalidade no solvente dissulfeto expostas de um VIP com base em Qβ do bacteriófago. Além disso, o produto final é fluorescente, que tem a vantagem de gerar uma sonda controlável em vitro , usando um conjunto de filtro disponíveis comercialmente.

Os derivados do dibromomaleimide podem ser sintetizados através da reação de condensação entre anidrido dibromomaleimide e aminas primárias15. Como alternativa, um método sintético suave16 usando N-metoxicarbonil ativado 3,4-dibromomaleimide aqui foi explorada por reagir com methoxypolyethylene glicol (PEG) de rendimento DB-PEG (Figura 1). NMR foi usado para identificar a estrutura de compostos (<strong class="x...

Aqui, apresentamos um procedimento para funcionalizar fluorescente os dissulfetos na Qβ VLP com dibromomaleimide. Descrevemos Qβ expressão e purificação, a síntese de moléculas de dibromomaleimide-acrescida e a reação de conjugação entre dibromomaleimide e Qβ. A partícula de conjugado fluorescente amarela resultante pode ser usada como uma sonda de fluorescência no interior das células.

Fazendo induzida por conjugação fluorescentes peguilado vírus-como partículas pela química do bissulfeto de Dibromomaleimide

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

O objetivo geral deste método de bioconjugação é funcionalizar fluorescentemente partículas semelhantes a vírus contendo dissulfetos. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a reação de bioconjugação para partículas semelhantes a vírus que possuem um número limitado de resíduos de aminoácidos passíveis de funcionalização. A principal vantagem desta técnica é que, utilizando uma única reação, novos grupos funcionais podem ser introduzidos e fluoróforos induzidos pela conjugação podem ser formados simultaneamente. Além do Q-Beta, acreditamos que esta reação possa ser aplicada a quaisquer partículas semelhantes a vírus que possuam ligações dissulfeto.Antes de iniciar o procedimento para expressar o bacteriófago Q-Beta, limpe a área da bancada com uma solução de hipoclorito de sódio:etanol na proporção 1:1. Em um ambiente asséptico, prepare dois cultivos iniciais de três mililitros adicionando colônias isoladas de E. coli BL21 em meio SOB. Incube os cultivos durante a noite em sala a 37 graus Celsius e umidade relativa de 0%, sob agitação a 250 rpm. No dia seguinte, retire os dois cultivos iniciais de três mililitros do agitador e, em ambiente asséptico, transfira cad

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Nanopartículas de plantas virais (VNPs) são promissoras plataformas para aplicações em biomedicina. Aqui, descrevemos os procedimentos para a propagação de plantas VNP, purificação, caracterização e bioconjugação. Por fim, mostramos a aplicação de VNPs para homing tumor e de imagem usando um modelo de xenoenxerto mouse e imagens de fluorescência.

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

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Um protocolo rápido e modular para a geração de vírus recombinantes de vaccinia expressando proteínas fluorescentes marcadas simultaneamente usando o método de seleção dominante transitória é descrito aqui.

Metodologia para a Geração Eficiente de Proteínas do Vírus da Vaccinia marcadas fluorescentes

A fixação de virions a uma superfície é um requisito para imagens de virion única por imagens de fluorescência de super resolução ou microscopia de força atômica (AFM). Aqui demonstramos um método de preparação de amostras para adesão controlada de virions a superfícies de vidro adequadas para uso em AFM e imagens de fluorescência de super resolução.

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

Ilustramos aqui um ensaio de ligação à membrana in vitro no qual as interações entre HIV-1 Gag e membranas lipídicas são analisadas visualmente usando Gag marcado com YFP sintetizado em um sistema de tradução in vitro baseado em gérmen de trigo e GUVs preparados por uma técnica de eletroformação.

Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas

Temos engenharia da proteína do capsídeo do vírus de hepatite E como um theranostic de nanopartículas (HEVNP). HEVNP auto monta em uma gaiola icosahedral estável na entrega da mucosa. Aqui, descrevemos a modificação do HEVNPs para tumor definião mutando superfície exposta resíduos de cisteínas, que conjugue ligantes sintéticos que se ligam especificamente as células do tumor.

Functionalization superfície de nanopartículas de vírus de hepatite E usando métodos de conjugação química

O protocolo descrito aqui permite que pesquisadores especificamente modificar capsids adenovírus em locais seleccionados pela química simples. Adenovírus blindado vectores partículas e vetores de transferência do gene redirecionada podem ser gerados, e interações do anfitrião de vetor podem ser estudadas.

Combinação de modificações genéticas e químicas de capsídeos em vetores de transferência gênica baseados em adenovírus para blindagem e direcionamento

Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.

Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

Aprenda a funcionalizar fluorescentemente partículas semelhantes a vírus contendo dissulfeto usando química de dibromomaleimida. Este método permite introduzir novos grupos funcionais e formar fluoróforos induzidos por conjugação em uma única reação.

Fazendo induzida por conjugação fluorescentes peguilado vírus-como partículas pela química do bissulfeto de Dibromomaleimide

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