Isolamento, caracterização e alto Throughput análise de fluxo extracelular de Mouse primária Renal Tubular as células epiteliais

Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o metabolismo renal, como a oxidação de ácidos graxos, que está intimamente relacionada ao desenvolvimento de fibrose renal e várias outras nefropatias. A principal vantagem dessa técnica é usar uma plataforma de alto rendimento para rastrear compostos que regulam a bioenergética mitocondrial em células epiteliais tubulares renais. As implicações dessa técnica se estendem à terapia da doença metabólica renal, pois permite a triagem de compostos que regulam o metabolismo mitocondrial nas células epiteliais renais.

Para preparar as placas de Petri de 60 milímetros revestidas com colágeno, adicione dois mililitros de ácido acético 20 milimolar pré-filtrado seguido de 35 microlitros de solução de colágeno I em cada placa. Em seguida, incube a placa em temperatura ambiente por uma hora, seque-a ao ar e exponha-a aos raios UV. Em seguida, enxágue os resíduos de ácido acético usando PBS. Faça três enxágues.

Em seguida, armazene o prato em uma incubadora de cultura de células sem dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Depois de preparar o rato para a cirurgia, remova o pelo do peito e do abdômen usando um creme depilatório. Em seguida, desinfete a pele com iodo e limpe o resíduo de iodo.

Em seguida, faça uma incisão para abrir a cavidade abdominal e exponha o coração e os rins. Agora, configure uma bomba de perfusão a 32 mililitros por minuto e remova todas as bolhas na tubulação antes de iniciar a perfusão. Use uma agulha de calibre 27 no final da linha.

Para prosseguir, insira uma agulha no ventrículo esquerdo através do ápice do coração. Assim que o tampão preencher o coração, faça um orifício no átrio direito para criar uma saída para o tampão de perfusão. Em seguida, mude para o tampão de digestão e reduza ligeiramente a velocidade da bomba para 30 mililitros por minuto para a digestão.

Após 20 mililitros de tampão de digestão terem sido perfundidos, remova ambos os rins para o isolamento das células tubulares. Para processar os rins colhidos, primeiro remova as cápsulas renais e a medula. Em seguida, pique os dois rins em pedaços minúsculos e incuba-os em 10 mililitros de um tampão de digestão em um forno a 37 graus Celsius com rotação suave por cinco minutos.

Após a digestão, remova todos os tecidos não digeridos passando o tampão por um filtro de 70 mícrons. Depois de coletar o tecido digerido, adicione 10 mililitros de meio de cultura para interromper a digestão. Em seguida, centrifugue a suspensão de tecido filtrado a 50 g por cinco minutos para peletar as células tubulares.

Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo, adicione cinco mililitros de meio de cultura e repita a centrifugação para coletar as células tubulares restantes. Agora, ressuspenda o primeiro pellet em 20 mililitros de meio de cultura e centrifugue-o a 50 g por cinco minutos para purificar ainda mais as células coletadas. Descarte o sobrenadante.

Em seguida, ressuspenda os dois pellets em 10 mililitros de meio de cultura. Em seguida, conte as células vivas usando a coloração com azul de tripano. Em seguida, semeie até 10 milhões de células em um prato revestido de colágeno de 60 milímetros e deixe as células tubulares se ligarem durante a noite.

Para começar, semeie células tubulares P1 em 40.000 células em poços de uma microplaca de 96 poços recém-preparada revestida com colágeno. Use 100 microlitros de meios de cultura por poço. A otimização da densidade celular e da concentração de compostos no ensaio de fluxo extracelular é a chave para um experimento bem-sucedido.

Recomendamos um experimento piloto de titulação para identificar a densidade celular ideal e a concentração do composto. Em seguida, hidrate o cartucho do sensor. Primeiro, levante o cartucho do sensor e encha cada poço da placa com 200 microlitros de solução de calibração.

Em seguida, reposicione o cartucho para submergir os sensores e incube o conjunto durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, aspire o meio antigo e substitua-o por 175 microlitros de glicose ou meio de ensaio de ácidos graxos. Em seguida, continue a incubação por uma hora sem dióxido de carbono.

Durante a incubação da célula, carregue a porta A do cartucho com 25 microlitros de oligomicina, carregue a porta B com FCCP, carregue a porta C com rotenona/antimicina A e carregue a porta D e todas as outras portas com água. Agora, armazene o cartucho na incubadora sem dióxido de carbono até que a configuração esteja pronta para calibração. Prossiga ligando o analisador de fluxo extracelular e o controlador.

Em seguida, abra o software analisador, escolha um ensaio padrão e pressione a opção Assistente de ensaio. Em seguida, na guia Compostos, atribua os compostos às portas apropriadas. Na guia Correção de fundo, selecione os poços que não contêm células.

Em seguida, use a guia Grupos e rótulos para rotular os grupos experimentais. Em seguida, na guia Protocolo, defina os ciclos de mistura e medição apropriados usando os comandos disponíveis. Essas configurações são indicadas no protocolo de texto e, uma vez inseridas, salve o modelo para uso futuro.

Agora, pressione End Wizard para continuar. Agora, pressione Iniciar para iniciar a calibração. O analisador então ejeta o suporte da placa e solicita que a placa do cartucho seja inserida.

Esse processo de calibração leva de 20 a 25 minutos para ser concluído. Depois que o sistema estiver calibrado, pressione o comando prompt para trocar a placa de calibração pela placa da célula e continue a execução. Quando a execução estiver concluída, salve os dados de OCR e remova a placa do analisador.

Agora, adicione Hoechst a cada um dos poços de ensaio e incube a placa por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, conte as células usando excitação de 355 nanômetros e uma emissão de 460 nanômetros e normalize os dados de OCR para a contagem de células. Neste protocolo, uma população heterogênea de células renais, túbulos incompletamente digeridos e outros detritos teciduais foram cultivados em placas revestidas de colágeno.

No dia seguinte ao isolamento, os meios de cultura foram centrifugados para remover os detritos e as células tubulares foram replaqueadas. Posteriormente, as células se fixaram mais facilmente e, no quinto dia de cultura, estavam em 80 a 90% de confluência. Os TECs renais foram então subcultivados e cresceram até a confluência em uma semana.

Crescimento semelhante ocorreu nas duas passagens seguintes. A monocamada de células formou uma cúpula, levantando-se da placa e permanecendo presa por junções apertadas. A respiração mitocondrial de TECs primários isolados foi medida usando a análise de fluxo extracelular descrita do OCR em diferentes densidades de plaqueamento, conforme descrito.

As células plaqueadas em densidades maiores tiveram aumentos proporcionais no OCR. 40.000 células por poço cobriram a superfície da placa melhor do que quaisquer outras densidades de revestimento, tornando-a a concentração ideal para testar as interações entre células e compostos. Por exemplo, meios contendo substrato de ácidos graxos foram aplicados a TECs junto com 2DG, um inibidor da glicólise, para avaliar diretamente a oxidação de ácidos graxos em TECs nas passagens um e dois.

Ao tentar este procedimento, é importante sempre manter um registro dos volumes e concentrações exatos em cada poço. Alterações nas concentrações finais dos componentes podem fazer com que todo o experimento falhe. Após seu desenvolvimento, essa técnica abrirá caminho para pesquisadores da área de nefrologia explorarem o papel do metabolismo tubular de ácidos graxos na patogênese de várias nefropatias.