Name: 2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprenda a purificação por afinidade para análise paralela de interações proteína-proteína e proteína-metabólito em culturas de células de Arabidopsis thaliana. Este método identifica moléculas interagentes em condições próximas ao in vivo.

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Nós gostaríamos de reconhecer gentilmente Prof. Dr. Lothar Willmitzer por seu envolvimento no projeto, discussões produtivas e supervisão de grande. Nós estamos gratos ao Dr. Daniel Veyel para ajudar com proteomic MS medições. Agradecemos a Sra. Änne Michaelis que nos forneceram inestimável ajuda técnica com medições de LC-MS. Além disso, gostaríamos de agradecer Dr. Monika Kosmacz e Dr. Ewelina Sokołowska por sua ajuda e participação nos trabalhos do manuscrito original e a Weronika Jasińska para suporte técnico.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo apresentado permite identificação paralela de PP e PM complexos de uma proteína do alvo. De clonagem para os resultados finais, o experimento pode ser concluído em menos de 8 a 12 semanas. AP completa leva cerca de 4-6 h para um conjunto de 12 para 24 amostras, tornando nosso protocolo adequado para análise de taxa de transferência média.
O protocolo, apesar de ser em geral simples, tem um número de passos críticos. (i) suficiente quantidade de proteínas entrada e grânulos de afinidade é crucial para alcançar uma gama dinâmica de deteção do metabólito. Lise celular eficiente, portanto, é um passo crucial no processo. Rendimentos de proteína pobre podem ser consequência de pulverização insuficiente do material ou da relação de material-tampão de Lise suboptimal. (ii) tenha cuidado que os reagentes usados são MS-friendly. Detergentes fortes, glicerol ou quantidades excessivas de sal devem ser evitadas como eles interferem com deteção de MS. (iii) grânulos de Agarose não devem ser excessivamente secados durante as etapas de lavagem, e ao usar um distribuidor de vácuo é importante aplicar uma taxa de fluxo lento para não para destruir os grânulos ou afetar a estabilidade do complexa.
Existem algumas possíveis modificações importantes do protocolo apresentado: (i) usamos o promotor constitutivo de CaMV35S para maximizar a quantidade de proteína de isca. Superexpressão, embora muito útil, pode ter efeitos graves na célula homeostase28 e provocar a formação de interações fisiologicamente irrelevantes. Expressão de proteínas etiquetadas usando promotores nativos e onde possível em um plano de perda de função é considerado superior para recuperar a verdadeiros biológicos interactianos. Para proteínas normalmente não expressadas em culturas de células da planta, pode revelar-se necessário identificar relevantes interactianos um fundo de planta. (ii) ao trabalhar com proteínas da membrana, a Lise precisa de ser complementada com um detergente compatível com o MS. (iii) a introdução de uma segunda etapa de purificação da afinidade poderia melhorar o rácio de verdadeiro-positivos falsos positivos e eliminar a necessidade de controles de EV29. Uma marca de romance em tandem com dois sites independentes protease-clivagem apresenta uma alternativa atraente para a etapa de tamanho-exclusão cromatografia adicionada por Maeda et al . 201411, que é trabalhoso e demorado.
O mais grave inconveniente do AP é a alta taxa de falsos positivos. As razões são inúmeras. Superexpressão constitutiva já foi mencionado. Outra fonte de interações fisiologicamente irrelevantes, a menos que trabalhando com organelas isoladas, é a preparação de células inteiras lysates contendo misturas de proteínas e de metabolitos de diferentes compartimentos subcellular. Localização subcellular deve ser usada para filtrar interactianos de verdadeiros. No entanto, a maioria dos falsos positivos resulta inespecíficas ligação entre proteínas e resinas de agarose. Introdução de uma segunda etapa de purificação, como descrito acima, oferece a melhor solução para o problema, no entanto vem ao custo de tempo e produtividade. Além disso, interação mais fraca pode ser perdida, como o protocolo alonga. Outra ressalva do AP é que apesar de abrangentes ele fornece as informações sobre a interactome de uma proteína do alvo, é impossível diferenciar entre alvos diretos e indiretos da proteína iscas. São necessárias abordagens bimolecular direcionadas para confirmar as interações.
AP juntamente com metabolomics baseado em MS foi utilizada para estudar os complexos de proteína em S. cerevisiae12. Este trabalho, juntamente com nossa observação anterior13 que, da mesma forma de lipídios, compostos polares e semi polares permanecem vinculados a complexos de proteínas isolados de lisados celulares, forneceu bases conceituais para o protocolo apresentado. Nosso protocolo caracteriza-se por três pontos originais: (i) em contraste com o fermento trabalhar12, ele demonstra que o AP é adequado para recuperar não apenas ligantes de proteína hidrofóbica mas também hidrofílico. (ii) através da introdução de um protocolo de extração de três-em-um, um único AP pode ser usado para estudar os interactianos de proteína e metabólito da proteína isca. (iii) adaptamos o protocolo para células vegetais.
Os futuros esforços incidirá sobre a criação de uma marca de romance em tandem com dois sites independentes protease-clivagem. Também gostaríamos de explorar a adequação do protocolo para baixo-abundância moléculas pequenas tais como hormonas vegetais.

O método descrito aqui visa a identificação de parceiros metabólito e proteína de uma proteína de escolha em condições de lisado celular quase -in vivo . Especula-se que muitos metabólitos mais do que caracterizada hoje têm uma importante função reguladora1. Metabolitos podem atuar como switches biológicas, mudando a atividade, funcionalidade, e/ou localização de seus receptores proteínas2,3,4. Na última década, vários métodos de descoberta, permitindo a identificação do PMI na vivo ou em condições de quase -in vivo , foram desenvolvidos5. Abordagens disponíveis podem ser separadas em dois grupos. O primeiro grupo é composto por técnicas que começam com uma metabólito conhecido isca para armadilha parceiros de novela de proteína. Métodos incluem drogas afinidade responsivo alvo-estabilidade ensaio7de cromatografia de afinidade6, quimio-proteomics8e térmica proteome perfil9. O segundo grupo é composto por um único método que inicia com uma proteína conhecida, a fim de identificar pequenas-molécula ligantes10,11.
AP, juntamente com lipidomics baseada em MS foi usado para analisar complexos proteína-lipídio em Saccharomyces cerevisiae12. Como ponto de partida, os autores utilizaram expressando 21 enzimas envolvidas na biossíntese de ergosterol de cepas de leveduras e 103 quinases fundiram a uma purificação em tandem-afinidade marca (TAP). 70% das enzimas e 20% das quinases foram encontrados para vincular diferentes ligantes hidrofóbicos, vertendo a luz para a rede de interação proteína-lipídio intrincados.
Anteriormente, nós poderia demonstrar que, da mesma forma de lipídios, compostos polares e semi polares também permanecem vinculados a complexos de proteínas isolados do lisado celular13. Com base nesses resultados, nós decidimos otimizar o AP método anteriormente publicado10,11 para células vegetais e compostos hidrofílicos14. Para este fim, usamos vetores de torneira, descritos por Van Viviane Lopes et al 2010, utilizado com sucesso na planta PPI estudos15. Para encurtar o tempo necessário para obter linhas transgénicas, decidimos em culturas de células de Arabidopsis. Utilizamos um One-Step metil tert-butil éter, (MTBE) / metanol/água método da extração, permitindo a caracterização de proteínas (pellet), lipídios (fase orgânica) e metabólitos hidrófila (fase aquosa)16 em um único experimento de afinidade-purificação. Linhas de controle EV foram introduzidas para excluir falsos positivos, por exemplo, proteínas, vinculando a marca sozinho. Como prova de conceito que marcou três (os cinco) quinases de nucleosídeo difosfato presentes no genoma de Arabidopsis (NDPK1-NDPK3). Entre outras descobertas, nós poderia demonstrar que NDPK1 interage com glutationa S-transferase e glutationa. Consequentemente nós poderia provar que NDPK1 sejam submetidas a glutathionylation14.
Para resumir, o protocolo apresentado é uma importante ferramenta para a caracterização da proteína-proteína e redes de interação da proteína-pequeno-molécula e constitui um grande avanço sobre os métodos existentes.

<table><tbody><tr><td>Sais basais de Murashige e Skoog com orgânicos mínimos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6899</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 1-naftilacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1641</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cinetina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3253</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6776</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>E-64 inibidor de protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease Coquetel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV Protease</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Rotiforese&nbsp; Gel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.2</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Escada de Proteína Prestada</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>SBP Tag Anticorpo (SB19-C4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-101595</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/Lys-C Mix, Grau de Especificação de Massa</td><td>Promega&nbsp;</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Tioureia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MTBE&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>138906</td><td></td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>136806</td><td></td></tr><tr><td>Água</td><td>Biosolve</td><td>232106</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Biosolve</td><td>12006</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Biosolve</td><td>202341</td><td></td></tr><tr><td>ácido fórmico&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>69141</td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 Plataforma Shaker</td><td>Heidolph</td><td>5421002000</td><td></td></tr><tr><td>Malha de Nylon (Diâmetro do fio 34 &micro; M, espessura 55 &micro; M, área aberta 14%)</td><td>Prosepa</td><td>Funil de Vidro de Encomenda</td><td></td></tr><tr><td>Personalizada, 47 mm, 300 ml</td><td>Restek</td><td>KT953751-0000</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Topo de Garrafa 500 mL 0,2 &micro; M Pes St</td><td>VWR International GmbH</td><td>514-0340</td><td></td></tr><tr><td>Moinho misturador MM 400</td><td>Retsch GmbH</td><td>207450001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast</td><td>Flow GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0969-02</td><td></td></tr><tr><td>Mobicol ""Classic"" com 2 tampas de rosca diferentes sem filtros</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>Filtro (pequeno) 35 &micro; Tamanho do poro M, para Mobicol M 1002, M1003, M1050 e M1053</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de Tubo de Velocidade Variável SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y550.1</td><td></td></tr><tr><td>Pratos rotativos para rotadores SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y555.1</td><td></td></tr><tr><td>Resprep 24-Port SPE Manifolds</td><td>Restek&nbsp;</td><td>26080</td><td></td></tr><tr><td>Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml</td><td>Teknokroma</td><td>TR-F034000</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler&nbsp; Frascos</td><td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&ouml; r</td><td>40 11 01 740</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Coluna</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC 1000 Cromatógrafo Líquido</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>LC120</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Espectrômetro de Massa Híbrido Quadrupolo-Orbitrap</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Sistema UPLC&nbsp;</td><td>Águas&nbsp;</td><td>Pedido</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS C18 Coluna, 100A, 1.8 &micro; M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td><td>Águas&nbsp;</td><td></td><td></td>186003533</tr><tr><td>Banhos de limpeza ultrassônica de alta potência para soluções de limpeza aquosa</td><td>Bandelin</td><td>RK 31</td><td></td></tr><tr><td>Genedata Expressionist</td><td>Genedata</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>NaN</td><td>NaN</td><td></td></tr></tbody></table>

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Processos celulares são regulados por interações entre moléculas biológicas, tais como proteínas, metabolitos e ácidos nucleicos. Enquanto a investigação das interações da proteína-proteína (PPI) não é nenhuma novidade, abordagens experimentais, com o objetivo de caracterizar as interações proteína-metabólito endógeno (PMI) constituem um desenvolvimento bastante recente. Neste documento, apresentamos um protocolo que permite a caracterização simultânea do PPI e PMI de uma proteína de escolha, referida como isca. Nosso protocolo foi otimizado para celular de Arabidopsis culturas e combina a afinidade da purificação (AP) com espectrometria de massa (MS)-com base em proteína e metabólito da deteção. Em suma, linhas de Arabidopsis transgênicas, expressando a proteína isca fundida a uma marca de afinidade, primeiro lysed para obter um extrato celular nativo. Anticorpos antimarca são usados para puxar para baixo a proteína e o metabólito parceiros da proteína isca. Os complexos de afinidade-purified são extraídos usando um One-Step metil tert-butil éter (MTBE) / metanol/água método. Enquanto metabolitos separarem em fase hidrofóbica ou o polar, as proteínas podem ser encontradas na pelota. Ambos os metabólitos e proteínas são então analisadas por espectrometria de massa-cromatografia líquida ultradesempenho (UPLC-MS ou UPLC-MS/MS). Linhas de controle do vetor vazio (EV) são usadas para excluir falsos positivos. A principal vantagem do nosso protocolo é que ele permite que a identificação da proteína e metabólito parceiros de uma proteína do alvo em paralelo em condições fisiológicas perto (lisado de celular). O método apresentado é simples, rápido e pode ser facilmente adaptado para sistemas biológicos, além de culturas de células de plantas.

No estudo original, três genes da . thaliana NDPK foram overexpressed em culturas de suspensão de células de PSB-L sob o controle do promotor constitutivo 35S14 (Figura 1). Marca de afinidade em tandem foi fundida a cada extremidade carboxi - ou amino-terminal de uma proteína de isca. Os complexos de afinidade-purified foram submetidos à extração de MTBE/metanol/água16. Afinidade-puxado de proteínas e pequenas moléculas foram identificadas usando MS (tabelas S2 e S3).
Para corrigir para falsos positivos, as amostras em branco foram usadas para excluir pequeno-molécula contaminantes dos produtos químicos e consumíveis de laboratório. Além disso, metabólitos e proteínas que se ligam a qualquer uma tag de afinidade ou resina em paz foram contabilizadas usando linhas de controle EV. Para recuperar o verdadeiros positivos, do não-pareado Student bicaudal teste-t e Benjamini &amp; Hochberg taxa falsa da descoberta correção foi aplicada para identificar metabólitos (Tabela S4) e proteínas (Tabela S5) significativamente enriquecidas em AP NDPKs experimentos (N - e C-terminal marcado NDPKs) em comparação com as linhas de controle EV (FDR &lt; 0.1). Observe que no trabalho anterior, usamos critérios de ausência/presença para delinear interactianos de proteína e da pequeno-molécula.
Resultados representativos são dadas para NDPK1, enquanto o foco de dados metabolito em dipeptídeos, uma classe nova dos reguladores pequeno-molécula estudada em nosso grupo. Análise proteômica revelou 26 parceiros putativo proteína de NDPK1. Pela filtragem adicional de proteínas co localizadas no mesmo compartimento subcelular como NDPK1 (citosol), a lista reduzi 13 interactianos de proteína putativo. Entre as proteínas identificadas foram glutationa S-transferase, alongamento de dois fatores de iniciação, tubulina e hydratase aconitate. Metabolómica análise revelou quatro dipeptídeos Val-Leu, Ile-Glu, Leu-Ile e Ile-Phe que especificamente co eluída com NDPK1 (Figura 2). Observe que todos os quatro dipeptídeos compartilham um resíduo hidrofóbico em sua extremidade N-terminal, sugerindo especificidade de ligação partilhada.
Para procurar conhecidos complexos da proteína-proteína e proteína-metabólito nós consultado 13 identificadas proteínas e quatro dipeptídeos contra o banco de dados de ponto25 (Figura 3). Várias observações poderiam ser feitas: (i) nenhum dos interactianos foi previamente relatada por NDPK1. (ii) APX1 ortholog foi relatado para interagir com aldeído desidrogenase membro da família ALDH7B4, enquanto fator de iniciação de tradução FBR12 com outro fator de iniciação da tradução codificado pelo gene AT2G40290. (iii) os dipeptídeos identificados não relataram parceiros de proteína. Dipeptídeos co eluted não foram relatados anteriormente como associado a qualquer proteína obtida da planta. No entanto, eles desempenham papéis importantes em outros organismos: Leu-Ile, por exemplo, tem um efeito de neurotrofinas-ativando em uma célula humana linha26. Note que o experimento não permite identificar a topologia exata do sistema. Por exemplo, um dipeptídeo pode interagir diretamente com NDPK1, mas também pode estar relacionado com qualquer das proteínas co purificadas.
Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que o procedimento estabelecido, empregando AP juntamente com espectrometria de massa, facilita a identificação da proteína-proteína e proteína-pequeno-molécula interactianos e ajuda a gerar informações abrangentes sobre a interactome da proteína alvo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> Figura 1. Esquema de fluxo de trabalho AP-MS. (A) preparação de uma fracção solúvel nativa da cultura de células vegetais. (B) próximos passos no processo de AP. Depois de colocar a amostra na coluna, a proteína de interesse (POI), fundida a uma marca de torneira vincula-se ao anticorpo IgG imobilizado nos grânulos de agarose. Lavagem da coluna facilita a remoção de proteínas não acopladas e metabólitos. Depois de realizar a clivagem AcTEV, complexos de proteína-metabólito POI são eluídos. (C) separação dos complexos de proteína e metabólito fração seguida de análise semi-quantitativa de MS. Parte desta figura é reproduzida de Luzarowski et al . 201714. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> Figura 2. Dipeptídeos especificamente co de eluição com NDPK1. Médias intensidades de quatro dipeptídeos Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C)e Ile-Phe (D) medido em experimento AP foram plotadas. Todos os quatro dipeptídeos mostram enriquecimento significativo em amostras de NDPK1 em relação ao controle de EV (asteriscos representam FDR &lt; 0.1). Barras de erro representam o erro padrão para 6 medições (3 repetições de N - 3 do C-terminal marcados e proteínas). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> Figura 3. Rede de interação de todas as moléculas co de eluição com NDPK1, consultado no banco de STITCH somente considerando anterior experimental e evidências de banco de dados (confiança &gt; 0.2). Maior confiança indica maiores chances de interação e é calculada com base nos dados depositados. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela S1. MaxQuant saída tabela "parameters.txt". Tabela inclui valores de limiar para identificação e quantificação, bem como informações sobre os bancos de dados utilizados. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela S2. Informações de MaxQuant saída tabela "proteinGroups.txt". Tabela contém uma lista de todos os grupos de proteínas identificadas, intensidades e informações adicionais como número de peptídeos exclusivos e pontuação. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela S3. Arquivo de saída que contém a análise de metabólitos polares. Tabela contém uma lista de todas as características de massa identificadas, caracterizada por m/z específico, RT e intensidade. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela S4. Dipeptídeos encontraram nas amostras de AP em que NDPK1, NDPK2 ou NDPK3 foram usados como isca. Dipeptídeos presentes nas amostras em branco foram excluídos da lista. Duas linhas independentes (marcadas em qualquer N - ou C-terminal) para cada NDPK foram executadas em triplicado. Student t-teste e mais correção do p-valor usando Benjamini &amp; Hochberg método foram utilizados para determinar significativamente enriquecidos Interagente parceiros de NDPKs (FDR &lt; 0.1). Dado ΔRT é calculado em relação aos compostos de referência e Δppm em relação o massa dado em Metlin27monoisotópico. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela S5. Proteínas co purificado com NDPK1. Duas linhas independentes (marcadas em qualquer N - ou C-terminal) para cada NDPK foram executadas em triplicado. Student t-teste e mais correção do p-valor usando Benjamini &amp; Hochberg método foram utilizados para determinar significativamente enriquecidos Interagente parceiros de NDPKs (FDR &lt; 0.1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Interações da proteína-proteína e proteína-metabólito são cruciais para todas as funções celulares. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a análise paralela dessas interações com uma proteína de escolha. Nosso protocolo foi otimizado para culturas de células de plantas e combina a purificação da afinidade com espectrometria de massa base de proteína e deteção do metabólito.

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Este método pode ser usado não apenas para abordar questões-chave na pesquisa básica, mas também contribuir para os campos médico, farmacêutico e biotecnológico, delineando novos ligantes moleculares pequenos de proteínas essenciais. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a análise paralela de proteínas e parceiros metabólicos da proteína de escolha em condições próximas ao vivo. Este método ajuda a pescar moléculas que interagem sem ficar restrito a ligantes pré-selecionados.Embora esse método tenha sido desenvolvido para plantas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como células HeLa, E.coli e S.Cerevisiae. Para começar, prepare o meio MSMO e ajuste o pH para 5,7 com um hidróxido de potássio molar. Em seguida, autoclave a solução por 15 minutos a 121 graus Celsius.Adicione os suplementos ao meio imediatamente antes do início do experimento. Agora, cultive a cultura de células transgênicas PSBL Arabidopsis thaliana em 50 mililitros de meio MSMO em um frasco de 100 mililitros. Em seguida, coloque o frasco em um agitador de plataforma orbital e agite suavemente as células a 130 rpm a 20 graus Celsius na luz.A cada sete dias, subcultive as células em meio fresco em uma solução de um a 10. Em seguida, use um funil de vidro com uma malha de náilon encaixada em um frasco cônico, conectado a uma bomba de vácuo para colher as células durante a fase de crescimento logarítmico. Em seguida, embrulhe as células secas em papel alumínio e congele em nitrogênio líquido.Usando um moinho misturador pré-resfriado, ajuste a uma frequência vibracional de 20 hertz. Homogeneizar o material da célula vegetal colhida e congelada em um pó fino por dois minutos. Em seguida, alíquota de três gramas do pó moído por amostra usando nitrogênio líquido, equipamento pré-resfriado para evitar o descongelamento.Em seguida, usando uma argamassa pré-resfriada com nitrogênio líquido, triture o pó moído com três mililitros de tampão de lise gelada até descongelar. Divida imediatamente a amostra descongelada em dois tubos de microcentrífuga de mililitros. Centrifugue as amostras a 20.817 g por 10 minutos a quatro graus Celsius para remover os detritos celulares.Enquanto a amostra está sendo centrifugada, alíquota de 100 microlitros de grânulos de sepharose IgG por amostra. Adicione um mililitro de tampão de lise e ressuspenda as esferas por vórtice. Gire rapidamente por três segundos a 2.000 g e descarte o tampão de lise.Finalmente, ressuspenda os grânulos em 400 microlitros de tampão de lise. Após a centrifugação, transfira três mililitros do lisado vegetal claro para um tubo de centrífuga cônico de 15 mililitros. Adicione as contas pré-equilibradas ao lisado da planta e incube a mistura em uma roda giratória por uma hora a quatro graus Celsius.Transfira a mistura para uma seringa conectada a uma tampa travada por isca em uma coluna giratória com um filtro de tamanho de poro de 35 micrômetros localizado na parte superior do coletor de vácuo. Passe o lisado pela unidade ligando a bomba de vácuo com uma leve pressão para evitar danos aos grânulos. O lisado não ligado é drenado para a estação de resíduos localizada na base do coletor e os complexos de proteínas, ligados aos grânulos, permanecem no filtro.Assim que a seringa for esvaziada do lisado celular, adicione 10 mililitros de tampão de lavagem para lavar as contas. Em seguida, adicione mililitro de tampão de eluição para realizar a segunda etapa de lavagem. Agora, remova a seringa e a tampa de trava da isca.Feche a tampa inferior na coluna e adicione 400 microlitros do tampão de eluição contendo 50 unidades da forma aprimorada do vírus da corrosão do tabaco, protease, aos grânulos. Coloque a coluna em um agitador de mesa, regulado para 1.000 rpm por 30 minutos a 16 graus Celsius. Em seguida, adicione mais 50 unidades da protease à coluna e incube a mistura no agitador como na etapa anterior.Em seguida, remova a tampa inferior e recoloque a coluna em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Centrifugar a 20 817 g durante um minuto para recolher o eluído e proceder à extracção das proteínas e dos metabolitos. Para iniciar a extração, adicione um mililitro de três a um a um solvente de água de metanol MTBE ao eluído.Inverta o tubo para misturar com a amostra. Em seguida, adicione 0,4 mililitros de uma a três soluções aquosas de metanol à mistura e inverta o tubo para misturar a amostra. Em seguida, centrifugue a amostra a 20.817 g durante dois minutos à temperatura ambiente para permitir a separação de fases.Usando uma pipeta manual de manuseio de líquidos de um mililitro, remova a fase superior contendo lipídios. Em seguida, adicione 0,2 mililitros de metanol e inverta o tubo para misturar a amostra. Centrifugar a 20 817 g durante dois minutos à temperatura ambiente e recolher a fase polar num novo tubo para a medição dos metabolitos.Deixe aproximadamente 50 microlitros da fase polar no fundo do tubo para evitar o deslocamento do pellet de proteína. Em seguida, seque o tubo que contém a fase polar em um evaporador centrífugo durante a noite. Seque os tubos de pellet de proteína por 30 a 60 minutos para evitar a secagem excessiva.Usando purificação de afinidade em uma etapa, juntamente com interações proteína-proteína e proteína-metabólito por espectrometria de massa em culturas de células transgênicas de arabidopsis thaliana foram identificadas. As culturas de células que expressam NDPK1 mostram enriquecimento significativo em valina-leucina, glutamato de isoleucina, isoleucina de leucina e fenilalanina de isoleucina quando comparadas às amostras de vetor vazio, NDPK2 e NDPK3. Para procurar interações proteína-proteína e proteína-metabólito conhecidas, 13 proteínas e quatro dipeptídeos co-eluindo com NDPK1 são comparados com o banco de dados de pontos.As principais associações são observadas entre o ortólogo APX1 e a família da aldeído desidrogenase, e o fator de iniciação da tradução, FBR12, com o homólogo alfa da subunidade do fator de iniciação da tradução. Os dipeptídeos identificados não mostram parceiros proteicos relatados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas, se executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante manter amostras, equipamentos e reagentes frios durante todo o experimento. Após este procedimento, outros métodos, como termoforese microscópica ou ensaio de atividade, podem ser realizados para determinar a interação direta entre as moléculas ou a inferência de seu ligante na atividade da proteína. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manusear a amostra durante todo o procedimento para obter resultados confiáveis e identificar ligantes de sua proteína de escolha.Não se esqueça de que trabalhar com metanol e solução MTBE pode ser extremamente perigoso. Equipamento de proteção individual adequado deve ser usado e precauções

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