2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Este método pode ser usado não apenas para abordar questões-chave na pesquisa básica, mas também contribuir para os campos médico, farmacêutico e biotecnológico, delineando novos ligantes moleculares pequenos de proteínas essenciais. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a análise paralela de proteínas e parceiros metabólicos da proteína de escolha em condições próximas ao vivo. Este método ajuda a pescar moléculas que interagem sem ficar restrito a ligantes pré-selecionados.

Embora esse método tenha sido desenvolvido para plantas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como células HeLa, E.coli e S.Cerevisiae. Para começar, prepare o meio MSMO e ajuste o pH para 5,7 com um hidróxido de potássio molar. Em seguida, autoclave a solução por 15 minutos a 121 graus Celsius.

Adicione os suplementos ao meio imediatamente antes do início do experimento. Agora, cultive a cultura de células transgênicas PSBL Arabidopsis thaliana em 50 mililitros de meio MSMO em um frasco de 100 mililitros. Em seguida, coloque o frasco em um agitador de plataforma orbital e agite suavemente as células a 130 rpm a 20 graus Celsius na luz.

A cada sete dias, subcultive as células em meio fresco em uma solução de um a 10. Em seguida, use um funil de vidro com uma malha de náilon encaixada em um frasco cônico, conectado a uma bomba de vácuo para colher as células durante a fase de crescimento logarítmico. Em seguida, embrulhe as células secas em papel alumínio e congele em nitrogênio líquido.

Usando um moinho misturador pré-resfriado, ajuste a uma frequência vibracional de 20 hertz. Homogeneizar o material da célula vegetal colhida e congelada em um pó fino por dois minutos. Em seguida, alíquota de três gramas do pó moído por amostra usando nitrogênio líquido, equipamento pré-resfriado para evitar o descongelamento.

Em seguida, usando uma argamassa pré-resfriada com nitrogênio líquido, triture o pó moído com três mililitros de tampão de lise gelada até descongelar. Divida imediatamente a amostra descongelada em dois tubos de microcentrífuga de mililitros. Centrifugue as amostras a 20.817 g por 10 minutos a quatro graus Celsius para remover os detritos celulares.

Enquanto a amostra está sendo centrifugada, alíquota de 100 microlitros de grânulos de sepharose IgG por amostra. Adicione um mililitro de tampão de lise e ressuspenda as esferas por vórtice. Gire rapidamente por três segundos a 2.000 g e descarte o tampão de lise.

Finalmente, ressuspenda os grânulos em 400 microlitros de tampão de lise. Após a centrifugação, transfira três mililitros do lisado vegetal claro para um tubo de centrífuga cônico de 15 mililitros. Adicione as contas pré-equilibradas ao lisado da planta e incube a mistura em uma roda giratória por uma hora a quatro graus Celsius.

Transfira a mistura para uma seringa conectada a uma tampa travada por isca em uma coluna giratória com um filtro de tamanho de poro de 35 micrômetros localizado na parte superior do coletor de vácuo. Passe o lisado pela unidade ligando a bomba de vácuo com uma leve pressão para evitar danos aos grânulos. O lisado não ligado é drenado para a estação de resíduos localizada na base do coletor e os complexos de proteínas, ligados aos grânulos, permanecem no filtro.

Assim que a seringa for esvaziada do lisado celular, adicione 10 mililitros de tampão de lavagem para lavar as contas. Em seguida, adicione mililitro de tampão de eluição para realizar a segunda etapa de lavagem. Agora, remova a seringa e a tampa de trava da isca.

Feche a tampa inferior na coluna e adicione 400 microlitros do tampão de eluição contendo 50 unidades da forma aprimorada do vírus da corrosão do tabaco, protease, aos grânulos. Coloque a coluna em um agitador de mesa, regulado para 1.000 rpm por 30 minutos a 16 graus Celsius. Em seguida, adicione mais 50 unidades da protease à coluna e incube a mistura no agitador como na etapa anterior.

Em seguida, remova a tampa inferior e recoloque a coluna em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Centrifugar a 20 817 g durante um minuto para recolher o eluído e proceder à extracção das proteínas e dos metabolitos. Para iniciar a extração, adicione um mililitro de três a um a um solvente de água de metanol MTBE ao eluído.

Inverta o tubo para misturar com a amostra. Em seguida, adicione 0,4 mililitros de uma a três soluções aquosas de metanol à mistura e inverta o tubo para misturar a amostra. Em seguida, centrifugue a amostra a 20.817 g durante dois minutos à temperatura ambiente para permitir a separação de fases.

Usando uma pipeta manual de manuseio de líquidos de um mililitro, remova a fase superior contendo lipídios. Em seguida, adicione 0,2 mililitros de metanol e inverta o tubo para misturar a amostra. Centrifugar a 20 817 g durante dois minutos à temperatura ambiente e recolher a fase polar num novo tubo para a medição dos metabolitos.

Deixe aproximadamente 50 microlitros da fase polar no fundo do tubo para evitar o deslocamento do pellet de proteína. Em seguida, seque o tubo que contém a fase polar em um evaporador centrífugo durante a noite. Seque os tubos de pellet de proteína por 30 a 60 minutos para evitar a secagem excessiva.

Usando purificação de afinidade em uma etapa, juntamente com interações proteína-proteína e proteína-metabólito por espectrometria de massa em culturas de células transgênicas de arabidopsis thaliana foram identificadas. As culturas de células que expressam NDPK1 mostram enriquecimento significativo em valina-leucina, glutamato de isoleucina, isoleucina de leucina e fenilalanina de isoleucina quando comparadas às amostras de vetor vazio, NDPK2 e NDPK3. Para procurar interações proteína-proteína e proteína-metabólito conhecidas, 13 proteínas e quatro dipeptídeos co-eluindo com NDPK1 são comparados com o banco de dados de pontos.

As principais associações são observadas entre o ortólogo APX1 e a família da aldeído desidrogenase, e o fator de iniciação da tradução, FBR12, com o homólogo alfa da subunidade do fator de iniciação da tradução. Os dipeptídeos identificados não mostram parceiros proteicos relatados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas, se executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante manter amostras, equipamentos e reagentes frios durante todo o experimento. Após este procedimento, outros métodos, como termoforese microscópica ou ensaio de atividade, podem ser realizados para determinar a interação direta entre as moléculas ou a inferência de seu ligante na atividade da proteína. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manusear a amostra durante todo o procedimento para obter resultados confiáveis e identificar ligantes de sua proteína de escolha.

Não se esqueça de que trabalhar com metanol e solução MTBE pode ser extremamente perigoso. Equipamento de proteção individual adequado deve ser usado e precauções