Name: Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprenda a isolar e transplantar precursores de interneurônios de regiões cerebrais distintas em filhotes de camundongo pós-natal. Este método permite analisar como mudanças ambientais influenciam o destino e a maturação celular em neurociência do desenvolvimento.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health (K99MH104595) e o programa de pesquisa intramural FORMULADORES para T.J.P. Agradecemos Gord Fishell, em cujo laboratório esta abordagem foi estabelecida originalmente.

<ol><li>Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy+as+a+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Epilepsy as a neurodevelopmental disorder.</a> Front Psychiatry. 3 (19), (2012).</li>
<li>Takano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+Dysfunction+in+Syndromic+Autism%3A+Recent+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances.</a> Dev Neurosci. , (2015).</li>
<li>Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losing+your+inhibition%3A+linking+cortical+GABAergic+interneurons+to+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia.</a> Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).</li>
<li>Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+cortical+interneuron+precursors+is+prescient+of+their+mature+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function.</a> Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).</li>
<li>Flames, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+multiple+subpallial+progenitor+domains+by+the+combinatorial+expression+of+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes.</a> J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).</li>
<li>Wonders, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+bias+for+the+origins+of+interneuron+subgroups+within+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence.</a> Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).</li>
<li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+bias+in+the+mitotic+origins+of+somatostatin-+and+parvalbumin-expressing+interneuron+subgroups+and+the+chandelier+subtype+in+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence.</a> Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).</li>
<li>Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+versus+Basal+Neurogenesis+Directs+Cortical+Interneuron+Subclass+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate.</a> Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).</li>
<li>Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+and+temporal+origin+of+chandelier+cells+in+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex.</a> Science. 339 (6115), 70-74 (2013).</li>
<li>Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+interneuron+specification%3A+the+juncture+of+genes%2C+time+and+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry.</a> Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li>
<li>Mi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+emergence+of+cortical+interneuron+diversity+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo.</a> Science. 360 (6384), 81-85 (2018).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li>
<li>De la Cruz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+progenitors+attenuate+the+power+of+acute+focal+ictal+discharges%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges.</a> Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).</li>
<li>Gilani, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+precursor+transplants+in+adult+hippocampus+reverse+psychosis-relevant+features+in+a+mouse+model+of+hippocampal+disinhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).</li>
<li>Larimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caudal+Ganglionic+Eminence+Precursor+Transplants+Disperse+and+Integrate+as+Lineage-Specific+Interneurons+but+Do+Not+Induce+Cortical+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity.</a> Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).</li>
<li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li>
<li>Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transplantations+Reveal+Environmental+Influences+on+Interneuron+Diversity+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation.</a> Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+differentiation%2C+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li>
<li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Um aspecto crítico deste protocolo é maximizar a capacidade de sobrevivência das células. Garantindo que os tecidos e as células são sempre em sACSF de carboxygenated fria como o gelo é necessário promover a sobrevivência da pilha. Isto requer uma dissecção eficiente e estratégia de dissociação para minimizar o comprimento de tempo que as células gastam em solução várias e fora do ambiente do cérebro. Dependendo do número de regiões do cérebro sendo dissecado e transplantados, pode ser útil ter um parceiro nas etapas a d...

Função cortical adequada requer um equilíbrio entre neurônios de projeção excitatória e inibitória gabaérgica interneurônios, uma população extremamente heterogêneo com morfologias distintas, Propriedades eletrofisiológicas, conectividade e neuroquímicos marcadores. Desenvolvimento anormal e função de interneurônios (e subgrupos específicos interneurônio) tem sido associada com o Patobiológico de transtornos psiquiátricos como esquizofrenia, autismo e epilepsia1,2,3. Além disso, muitos genes implicados nestes distúrbios cerebrais são fortemente enriquecidos em interneurônios jovem4. Assim, uma maior compreensão dos mecanismos que regulam a maturação e interneurônio destino determinação é necessária para compreender o desenvolvimento normal e potenciais etiologias de numerosas doenças do cérebro.
Interneurônios prosencéfalo nascem principalmente a partir de duas estruturas embrionárias transitórias, as medial e caudais Eminências ganglionar (MGE e CGE, respectivamente). Estas células postmitotic (precursores de interneurônio) em seguida, passam por uma fase de migração tangencial prolongada para dispersar ao longo do telencéfalo onde eles integrarem uma grande variedade de circuitos. MGE-derivado interneurônios consistem em três subgrupos em grande parte não-sobreposição, neuroquimicamente definidos: rápido spiking interneurônios parvalbumin (PV+), não-fast spiking interneurônios somatostatina (SST+) e tarde cravação neuronal nítrico Interneurônios óxido de sintase (nNOS+) que constituem as células neurogliaform e ivy hippocampal. Numerosos laboratórios identificaram vários mecanismos dentro do MGE que regulam o destino inicial as decisões em PV+ ou SST + interneurônios, incluindo gradientes espaciais de morphogens, data de nascimento de precursores interneurônio e o modo de divisão neurogênica 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. tem sido proposto que interneurônios inicialmente diferenciarem em 'classes cardeais' e em seguida, progressivamente maduro em 'classes definitivas', como eles interagem com seu ambiente11. Provas recentes indicam que alguns subtipos de interneurônio maduro podem ser geneticamente hardwired como essas células se tornam postmitotic nas Eminências ganglionar, indicando que os programas genéticos intrínsecos definidos precoce podem desempenhar um papel maior do que anteriormente agradecido12,13. No entanto, a questão fundamental de como os programas genéticos intrínsecos interagem com pistas ambientais para diferenciação de unidade em subtipos distintos interneurônio permanece largamente inexplorada.
Numerosos estudos transplantamos células embrionárias MGE diretamente em uma variedade de regiões do cérebro, com os resultados de consenso que transplantaram células maduras e liberação de GABA para inibir geralmente o circuito endógeno local14,15, 16,17,18,19. Estas observações de prometendo geraram interesse significativo no uso de células-tronco pluripotentes induzidas humana (hIPSC)-derivado de interneurônios para tratar uma variedade de doenças do cérebro. No entanto, muito poucos desses estudos avaliar se estas células enxertadas maduro em tipos esperados dos interneurônios maduros, um componente crítico quando se pensa em abordagens translacionais.
Para resolver, como o ambiente influencia interneurônio diferenciação e maturação, uma estratégia foi concebida para transplante de precursores imaturos interneurônio em novos ambientes de cérebro a fim de examinar se enxertados interneurônios adotam características do host ambiente ou manter características do doador ambiente20. MGE transplantes não são adequados para abordar esta questão, porque o MGE contém uma população mista de interneurônio e células de projeção gabaérgica que dispersarem ao longo de inúmeras regiões de cérebro21. Sem saber onde estas células MGE que migraram, um pode não totalmente avaliar como esses transplantes são afetados pelo ambiente de cérebro. Por colheita precursores interneurônio no início pós-natal momentos, este problema é contornado pela obtenção de células imaturas que completou sua migração e atingiu sua meta região do cérebro, mas ter a mínima interação com o ambiente. Centrando-se em características específicas de interneurônios diferencialmente expressos entre regiões distintas do cérebro, pode então determinar como o ambiente de host muda Propriedades interneurônio. A abordagem geral descrita no presente protocolo deve ser aplicável para qualquer investigador que quer examinar os neurônios como jovens se comportam quando desafiado em um novo ambiente.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Matrizes cerebrais</td><td>Roboz</td><td>SA-2165</td><td>Só é necessário se a colheita do estriado</td></tr><tr><td>Ponta fina Dumont Fórceps</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de microdissecação</td><td>Roboz</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>ThermoFisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador Manual com suporte</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de plástico de fundo redondo de 5 ml</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 60 mm Placas de Petri</td><td>ThermoFisher</td><td>12556001 Placas de</td><td></td></tr><tr><td>Petri de 100 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>12565100</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50um filtros</td><td>Sysmex</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>Trypan azul</td><td>ThermoFisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>ThermoFisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de mouse pós-natal precoce

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Maturação e determinação neuronal destino requer uma intrincada interação entre programas genéticos e sinais ambientais. No entanto, destrinçar os papéis de intrínseco versus extrínsecos mecanismos que regulam este processo de diferenciação é um enigma para todos os neurobiologists do desenvolvimento. Esta questão é ampliada para gabaérgica interneurônios, uma população celular incrivelmente heterogênea que nasce das estruturas embrionárias transitórias e passam por uma fase migratória prolongada para dispersar ao longo do telencéfalo. Para explorar diferentes como cérebro ambientes afetam interneurônio destino e maturação, desenvolvemos um protocolo para a colheita fluorescente etiquetadas interneurônio imaturo precursores de regiões específicas do cérebro em ratos recém-nascidos (P0-P2). Nesta idade, migração de interneurônio está quase completa e estas células são residentes em seus ambientes de descanso finais com relativamente pouca integração sináptica. Coleção de soluções de célula única via citometria de fluxo, na sequência destes precursores interneurônio são transplantados P0-P2 sua filhotes pós-natal. Através da realização de ambos homotopicamente (por exemplo, córtex-para-córtex) ou heterotópica (por exemplo, córtex-para-hipocampo) transplantes, pode avaliar como desafiador interneurônios imaturos em novos ambientes de cérebro afeta seu destino, maturação e integração do circuito. Cérebro pode ser colhido em ratos adultos e analisado com uma grande variedade de análises posthoc enxertados em células, incluindo a imuno-histoquímica, eletrofisiológicos e transcriptional de criação de perfil. Esta abordagem geral fornece investigadores com uma estratégia a ensaiar como distintos ambientes do cérebro podem influenciar numerosos aspectos do desenvolvimento do neurônio e identificar se especificidade neuronal é conduzida principalmente por programas genéticos hardwired ou Dicas ambientais.

Este protocolo demonstra como colheita de regiões cerebrais específicas do cérebro pós-natal precoce (Figura 1-2), coletar dissociações única célula de precursores interneurônio e transplante dessas células em várias regiões do cérebro ingênuo WT filhotes pós-natal (Figura 3). Para análises posthoc, cérebros que recebeu interneurônio precursor enxertos foram colhidos entre P30-35 para caracterizar a morfologia ce...

Desafio jovens neurônios em novas regiões do cérebro pode revelar importantes insights sobre como o ambiente esculpe, maturação e destino neuronal. Este protocolo descreve um procedimento para colheita precursores interneurônio de regiões específicas do cérebro e transplantá-las de qualquer homotopically ou heterotopically para o cérebro dos filhotes pós-natal.

Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

O objetivo geral deste procedimento é colher precursores de interneurônios de regiões cerebrais distintas em filhotes de camundongos pós-natais e transplantar essas células em receptores pareados por idade para avaliar como as mudanças ambientais influenciam o destino e a maturação dos interneurônios. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência do desenvolvimento sobre como os programas genéticos intrínsecos e os sinais ambientais interagem para esculpir o destino das células neurais. A principal vantagem dessa técnica é que as alterações no destino e na maturação dos precursores de interneurônios podem ser analisadas após sua transferência adotiva para um novo ambiente cerebral.A demonstração visual das etapas de colheita e enxerto de células é crítica porque pequenos erros na técnica podem levar a experimentos de transplante ineficientes e malsucedidos. Para começar, coloque uma lâmina de barbear no lobo frontal anterior de um cérebro de filhote de cachorro pós-natal e lâminas de barbear adicionais nas ranhuras logo posteriores à primeira lâmina de barbear para gerar duas fatias de 0,5 milímetro. Transfira as fatias estriatais para uma placa de Petri com sacarose borbulhada, líquido cefalorraquidiano artificial ou sACSF e coloque o tecido cerebral restante em uma placa de Petri com sACSF no gelo.Coloque as fatias sob um microscópio de dissecação e use uma pinça para beliscar o estriado de ambos os hemisférios, colocando os pedaços estriados em um tubo de 50 mililitros de sACSF no gelo à medida que são colhidos. Se o cérebro foi colhido de um camundongo repórter fluorescente, use microscopia de fluorescência para distinguir o sinal estriatal td-tomate do sinal fluorescente mais forte do globo pálido. Para remover o hipocampo, use uma pinça para hemisseccionar o cérebro ao longo da linha média e coloque um hemisfério sob um microscópio de dissecação na superfície medial para cima.Use uma pinça para remover o tecido cerebral ventral e identificar o hipocampo em forma de salsicha que abrange o acesso anteroposterior ao longo do lado dorsal e ventricular do córtex. Insira as pontas da pinça na frente do hipocampo anterior e avance a pinça posteriormente enquanto aperta ao longo da borda cortical do hipocampo para separar suavemente o hipocampo do córtex. Coloque o tecido isolado em um tubo de 50 mililitros de sACSF no gelo e repita a colheita do hipocampo para o hemisfério contralateral.Em seguida, coloque o córtex hemisseccionado com o lado medial voltado para baixo e use a pinça para remover as porções mais dorsal, ventral, anterior e posterior do córtex. Transfira o quadrado restante do córtex medial para um tubo de 50 mililitros de sACSF no gelo. Depois de remover o cérebro, prenda o lado ventral do cérebro para baixo através do cerebelo e córtex anterior ou bulbos olfatórios.Usando uma pinça curva, separe suavemente o córtex posterior do hipocampo subjacente e outros tecidos em cada hemisfério. E descasque o córtex dorsal para a frente para expor as estruturas subjacentes. Use uma pinça para beliscar o hipocampo em um hemisfério na linha média e remova o hipocampo retirando-o lateralmente do cérebro.Coloque o hipocampo em um tubo de 50 mililitros de sACSF no gelo e colha o hipocampo contralateral da mesma maneira. Em seguida, raspe suavemente as bordas do estriado para soltá-lo do tecido circundante. Aperte suavemente abaixo do estriado para colher o tecido estriado.Após a colheita do córtex de ambos os hemisférios, como demonstrado anteriormente, transfira o estriado sob um escopo de dissecação fluorescente. Use uma pinça para remover qualquer tecido globus pálido positivo para tomate td-vermelho brilhante de cada estriado. Quando todos os tecidos tiverem sido colhidos, transfira o tecido para um tubo inferior redondo de cinco milímetros e substitua o sACSF em cada tubo de coleta por dois mililitros de solução de pronase-sACSF recém-preparada para uma incubação de 20 minutos em temperatura ambiente com movimentos ocasionais.No final da incubação, substitua cuidadosamente o pronase-sACSF por um a dois mililitros de solução de reconstituição e dissocie mecanicamente os tecidos com tubos de Pasteur polidos a fogo. Quando o tecido estiver turvo e nenhum pedaço de tecido estiver visível, coe a solução celular através de um filtro de 50 mícrons em novos tubos de fundo redondo de cinco mililitros para remover quaisquer aglomerados de células antes da classificação das células ativadas por fluorescência. Depois de receber as células da citometria de fluxo, transfira as suspensões celulares para tubos cônicos de 1,5 mililitro para centrifugação.Após a centrifugação, aspirar todos, exceto os últimos 20 microlitros de sobrenadante de cada tubo, e reconstituir os pellets para contagem. Se necessário, diluir a solução celular com sACSF a uma concentração de uma a três vezes 10 elevado a 5 células por microlitro. Carregue uma micropipeta de ponta fina com óleo mineral.Conecte a micropipeta a um injetor de nanolitros e prenda o aparelho de injeção de nanolitros a um manipulador conectado a uma base magnética. Enquanto o primeiro filhote está sendo anestesiado no gelo, pipete a solução celular várias vezes para garantir uma distribuição celular homogênea. Ejete o óleo mineral e encha completamente a pipeta com a suspensão de célula única.Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, coloque o filhote em uma tampa de placa de Petri com a cabeça apoiada em massa adesiva, de modo que o topo da cabeça fique relativamente plano. Cubra a cabeça com um pedaço de fita adesiva com um orifício de diamante, puxando a fita até que a pele seja esticada para que a cabeça fique firmemente presa e lambda seja visível através do orifício. Mova o filhote preso sob o injetor de nanolitros e abaixe a micropipeta de modo que a ponta fique diretamente acima do lambda.Observe as coordenadas X, Y no manipulador e ajuste os botões do manipulador até que a micropipeta esteja posicionada nas coordenadas apropriadas ao longo dos eixos medial, lateral e ântero-posterior da cabeça. Abaixe a micropipeta até que a ponta crie uma pequena concavidade na pele e gire o botão do manipulador do eixo z com firmeza, mas suavemente, para conduzir a micropipeta através da pele e do crânio até o cérebro. Retraia ligeiramente a micropipeta até que a ponta esteja rodeada por um cone de pele em forma de tenda.E visualize as coordenadas ao longo do eixo z. Em seguida, abaixe a micropipeta até a profundidade experimental apropriada e injete as células. Aguarde 15 segundos após as células terem sido entregues antes de retrair a micropipeta e repita a injeção em um segundo local, se desejar.Coloque o filhote em uma almofada de aquecimento e monitore até que a recuperação total seja alcançada antes de transferir de volta para a gaiola doméstica. As células enxertadas migram pelas regiões cerebrais alvo com taxas variáveis de sobrevivência celular variando de dezenas a vários milhares. As células enxertadas localizam-se dentro das regiões apropriadas, com muitas células exibindo morfologias de interneurônios e marcadores neuroquímicos de interneurônios bem caracterizados.As células do doador sobrevivem e amadurecem mesmo quando são enxertadas em novos ambientes com transplantes heterotópicos. A análise eletrofisiológica das células enxertadas revela propriedades fisiológicas semelhantes às de adultos e padrões de disparo distintos, representativos de subtipos de interneurônios bem definidos, sugerindo que os interneurônios enxertados são capazes de amadurecer adequadamente no ambiente hospedeiro. As células transplantadas também exibem correntes pós-sinápticas excitatórias espontâneas.O registro de células piramidais adjacentes a interneurônios transplantados que expressam a canalrodopsina-2 revela correntes GABAérgicas pós-sinápticas que são evocadas pela luz azul nessas células piramidais endógenas. Ao tentar este procedimento, é importante manter as células no gelo e triturar as células suavemente com uma pipeta Pasteur para minimizar a morte celular. Após este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento de célula única, podem ser realizados nas células enxertadas para definir mais completamente como as mudanças ambientais afetam o transcriptoma de uma célula.Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de isolar precursores de interneurônios de diferentes regiões cerebrais de filhotes recém-nascidos e transplantar essas células em várias regiões cerebrais de filhotes pós-natais da mesma idade.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Weber, R. Z., et al. Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro de camundongos. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra o transplante estereotáxico de células progenitoras neurais humanas geneticamente modificadas (NPCs) para o cérebro de camundongos. Os pesquisadores injetam NPCs que expressam luciferase e proteínas fluorescentes, permitindo imagens de bioluminescência in vivo e microscopia de fluorescência...

Transplante de células progenitoras neurais humanas no cérebro de camundongos

Este vídeo apresenta um método para gerar precursores de interneurônios corticais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. O protocolo envolve a cultura das células-tronco em meios contendo inibidores específicos de pequenas moléculas, que facilitam a proliferação e agregação de células-tronco em corpos embrióides (EBs). Posteriormente, os EBs são dissociados com enzimas e plaqueados em poços de placa de cultura revestidos com proteínas de adesão para promover sua diferenciação...

Geração de precursores de interneurônios corticais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Fonte: Quattrocolo, G., et al. Transplante homocrônico de precursores de interneurônios em cérebros de camundongos pós-natais precoces. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o transplante de células precursoras de interneurônios no cérebro de camundongos neonatais usando uma abordagem homotópica ou heterotópica. O procedimento envolve proteger um filhote receptor anestesiado, identificar a região do cérebro alvo e injetar uma suspensão de células precursoras derivadas de um filhote doador no...

Transplante de células precursoras de interneurônios no cérebro de um filhote de camundongo

Fonte: Gonzalez-Ramos, A., et. al., Transplante de neurônios GABAérgicos derivados de células-tronco humanas no hipocampo de camundongo pós-natal precoce para mitigar distúrbios do neurodesenvolvimento. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra a injeção estereotáxica de células precursoras de interneurônios derivados de humanos no hipocampo de um filhote de camundongo geneticamente modificado com interneurônios inibitórios reduzidos, com o objetivo de restaurar o equilíbrio...

Transplante de células precursoras de interneurônios derivados de humanos no hipocampo de filhotes de camundongos

Fonte: Denaxa, M., el al., Transplante de progenitores de interneurônios corticais quimiogeneticamente modificados em cérebros de camundongos pós-natais precoces. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para injetar um vetor de plasmídeo carregando o gene de interesse em progenitores interneurônios em uma fatia de cérebro embrionário, seguido de eletroporação para entrada de plasmídeo e expressão gênica. Esses progenitores modificados podem ser usados posteriormente para o...

Transferência de genes assistida por eletroporação incorporada em agarose em progenitores de interneurônios corticais de camundongos

Este protocolo descreve um método para gerar progenitores interneurônio cortical e pós mitóticas interneurônio precursores de células-tronco embrionárias rato usando um método modificado de corpo-a-monocamada do embryoid. Estes precursores/progenitores pode ser usado em vitro fluorescente classificada e transplantado para o neocórtex neonatal para estudar a determinação do destino ou usado em aplicações terapêuticas.

Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

Com base na engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais, seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e avaliação morfométrica pareada de derivados de "teste" e "controle", este método permite a modelagem precisa do controle genético in vivo de neokortikalny morfologia do neurônio de forma simples e acessível.

Transplante intraventricular de precursores neuronais projetados para estudos de Neuroarquitetura in vivo

Aqui nós apresentamos um protocolo, projetado usar ferramentas chemogenetic para manipular a atividade de progenitores corticais do interneurônios transplantados no córtice de ratos pós-natal adiantados.

Transplantação dos progenitors corticais Quimiogenetically projetados do interneuron em cérebros Postnatal adiantados do rato

O transplante de neurônios GABAérgicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas gerados pela programação neuronal pode ser uma abordagem de tratamento potencial para distúrbios do neurodesenvolvimento. Este protocolo descreve a geração e o transplante de precursores neuronais GABAérgicos derivados de células-tronco humanas no cérebro de camundongos neonatais, permitindo a investigação a longo prazo de neurônios enxertados e a avaliação de seu potencial terapêutico.

Transplante de neurônios gabaérgicos derivados de células-tronco humanas no hipocampo de camundongo pós-natal precoce para mitigar distúrbios do neurodesenvolvimento

Análise mosaico de função do gene em desenvolvimento pós-natal do rato do cérebro usando Virus baseado Recombinação Cre

Aprenda a isolar e transplantar precursores de interneurônios de regiões cerebrais distintas em filhotes de camundongo pós-natal. Este método permite analisar como mudanças ambientais influenciam o destino e a maturação celular em neurociência do desenvolvimento.

Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce

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