Calorespirometry: Uma abordagem poderosa, não-invasiva para investigar o metabolismo energético celular

Os objetivos gerais deste procedimento são analisar a atividade metabólica de uma amostra biológica e determinar até que ponto as vias anaeróbicas contribuem para a produção de energia celular dentro da amostra. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo farmacêutico sobre a extensão da toxicidade mitocondrial durante o desenvolvimento de medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita a medição simultânea do consumo de oxigênio e da produção de calor em uma amostra de célula de interesse.

Portanto, esse método pode fornecer informações sobre o planejamento do tratamento durante o desenvolvimento farmacêutico. Também pode ser aplicado a outros campos, como a cirobiologia, na qual os efeitos do pré-condicionamento metabólico na criopreservação podem ser avaliados. Para preparar o respirômetro, primeiro adicione dois vírgula dois mililitros de DMEM a cada câmara do respirômetro e insira totalmente as rolhas.

Ajustar as rolhas com uma ferramenta espaçadora de rolhas para permitir a difusão ideal do oxigénio para o meio e definir as câmaras para agitar continuamente as amostras a 750 rpm a 37 graus Celsius até que a concentração de oxigénio e o fluxo de oxigénio estejam estáveis. Confirme se o software do respirômetro está programado para levar em conta a solubilidade em oxigênio do meio usado no experimento. Em seguida, selecione uma porção estável do traço de concentração de oxigênio e calibre essa porção para 100% de saturação de ar.

Agora, feche as rolhas, tomando cuidado para que não haja bolhas nas câmaras. Após cerca de 10 minutos, um fluxo de oxigênio estável deve ser observado. Para se preparar para a calorimetria, primeiro adicione dois vírgula cinco mililitros de água desionizada à ampola de referência e, em seguida, aperte a tampa.

Usando uma bomba de ar, remova os detritos externos da ampola e, em seguida, abaixe lentamente a ampola para posicionar uma no canal de referência do calorímetro. A ampola permanecerá na posição um até que a ampola com a amostra de células tenha sido preparada. O DMEM, usado para calorimetria, deve ser equilibrado em uma incubadora de 37 graus Celsius com atmosfera umidificada e 5% de CO2.

Comece o experimento adicionando três mililitros de DMEM a uma placa de 100 mililitros para cada ampola calorimétrica que será usada e coloque a placa na incubadora até que a amostra esteja pronta para calorimetria. Enquanto o meio está se equilibrando, use um microscópio invertido para selecionar uma placa com células HepG2 que estejam entre 60 e 80% confluentes e sejam distribuídas de forma homogênea. Primeiro, remova o meio de cultura de células e lave as células duas vezes com 10 mililitros de PBS.

Adicione três mililitros de tripsina pré-aquecida a 37 graus Celsius e incube a placa a 37 graus Celsius. Após sete a 10 minutos de incubação, neutralize a reação enzimática com os três mililitros de DMEM a 37 graus Celsius e use uma pipeta de cinco mililitros para dissociar suavemente as células em uma suspensão de célula única. Transfira as células para um tubo cônico estéril de 15 mililitros para centrifugação e ressuspenda a paleta em aproximadamente cinco mililitros de DMEM fresco.

Pipete as células completamente para desagregar quaisquer aglomerados de células e, após a contagem, concentre as células em aproximadamente dois milhões de células por 50 microlitros de meio. A reprodutibilidade deste método depende de contagens de células consistentes e precisas. É fundamental garantir que a amostra seja homogênea e que as células não sejam agrupadas em nenhum ponto durante a análise.

Em seguida, armazene as células no gelo até que estejam prontas para realizar medições respirométricas e calorimétricas. Antes da medição calorimétrica, confirme se o calorímetro está conectado ao computador e se o sinal calorimétrico está estável e em microwatts. Diluir as células para 100.000 células por mililitro no meio equilibrado que foi colocado na incubadora antes da preparação da amostra.

Em seguida, adicione dois vírgula cinco mililitros de solução celular a cada ampola, confirmando que um volume suficiente de ar é mantido entre as tampas das ampolas e o meio para permitir a difusão do gás. Aperte imediatamente as tampas e limpe as ampolas seladas com ar para remover quaisquer detritos externos. Em seguida, abaixe lentamente a ampola selada com a amostra de célula para posicionar um dos calorímetros.

Misture bem a amostra para garantir uma solução homogênea e injete dois milhões de células em cada câmara fechada do respirômetro sob agitação contínua. Após 15 minutos na posição um do calorímetro, baixar lentamente a ampola de referência e a ampola com as células para a posição dois e registar o tempo de descida. 10 a 15 minutos após as células terem sido injetadas no respirômetro, deve-se observar uma estabilização do fluxo de oxigênio e uma diminuição constante na concentração de oxigênio.

Para determinar a respiração de vazamento, injete um microlitro de quatro miligramas por mililitro de oligomicina em cada câmara e deixe o fluxo de oxigênio se estabilizar por cerca de 10 minutos, registrando a taxa de respiração de vazamento estável conforme demonstrado. Em seguida, para determinar o fluxo máximo, injete dois microlitros de FCCP milimolar de ponto zero e dois milimolares na câmara, permitindo que o fluxo de oxigênio se estabilize após cada injeção e continuando as titulações até que o fluxo máximo seja atingido. Registre a frequência respiratória estável durante o fluxo máximo.

Quando a câmara do respirômetro está operando antes da medição da amostra, tanto a concentração de oxigênio quanto os traços de fluxo de oxigênio devem ser estáveis. Depois que a ampola foi abaixada para a posição dois, um período de tempo pode ser identificado em que a produção de calor é estável e um tempo correspondente pode ser identificado em que o fluxo de oxigênio é estável, para permitir o cálculo da razão calorespirométrica. Se as células HepG2 forem cultivadas na ausência de glicose e a galactose for suplementada para aumentar o envolvimento mitocondrial, as células não proliferam dentro do calorímetro, mas diminuem sua atividade metabólica após cerca de 30 minutos na ampola, restringindo o cálculo calorespirométrico ao primeiro momento em que a dissipação de calor foi medida.

É fundamental registrar o tempo em que as células são pipetadas na ampola para que as medições da produção de calor e do consumo de oxigênio sejam coletadas em pontos de tempo idênticos, pois leva aproximadamente 15 minutos para que o fluxo de oxigênio se estabilize e a concentração de oxigênio diminua constantemente. Como o fluxo de oxigênio estabilizado das células serve como substituto do consumo de oxigênio no cálculo da razão calorespirométrica, titulações adicionais podem ser realizadas para avaliar a respiração de vazamento, que é indicada por uma queda no fluxo de oxigênio e a respiração desacoplada máxima, que é indicada por uma falha em aumentar a respiração com titulações sucessivas de FCCP. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em menos de quatro horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que outras linhagens celulares podem ter propriedades metabólicas diferentes. Portanto, cada nova linhagem celular deve ser otimizada para medições calorimétricas e respirométricas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar células HepG2 para calorespirometria para garantir a calibração instrumental correta e conduzir adequadamente um experimento calorespirométrico.