Name: Calorespirometry: Uma abordagem poderosa, não-invasiva para investigar o metabolismo energético celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprenda a técnica de calorespirometria para analisar o metabolismo energético celular de forma não invasiva. Este método mede simultaneamente o consumo de oxigênio e a produção de calor em amostras biológicas.

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Este trabalho foi financiado em parte pela concessão do National Science Foundation-160944 para Mary E. Konkle e Michael A. Menze.

1. cultura de pilha
<ol><li>Manter as células de carcinoma (HepG2) hepatocelular humano médio modificado águia de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e substratos adicionais (10 mM glicose, glutamina 2 mM e piruvato de 1 mM) a 37 ° C numa incubadora de cultura celular (5% CO2 , ar de 95%, 100% de umidade). Nota: Use a formulação DMEM acima quando DMEM é referenciado em etapas posteriores para respirometria e calorimetria.</li>
	<li>Placa as células em 1 x 106 células por placa de cultura de 100mm e subcultura-las cada 7 dias ou antes de chegar a 90% de confluência e renovar o médio a cada 3-4 dias.</li>
	<li>Realize os experimentos que, quando as células são de 60-80% de Confluencia.</li>
</ol>2. preparação de Respirometer e calorímetro
<ol><li>Pipetar 2,2 mL de DMEM na câmara respirometer, tapar totalmente e ajustá-lo com a ferramenta de espaçador de rolha para permitir a difusão do ideal de oxigênio do ar para médio.</li>
	<li>Mexa continuamente a 37 ° C até que a concentração de oxigênio (traço azul) e o fluxo de oxigênio (traço vermelho) são estáveis. Certifique-se de que software a respirometer é programado para dar conta da solubilidade de oxigênio do meio utilizado no experimento. Nota: Diferentes meios de comunicação têm coeficientes de solubilidade de oxigênio diferentes (por exemplo, DMEM = 0,92).</li>
	<li>Após a estabilização da concentração de oxigênio em DMEM com a câmara aberta, selecione uma parte estável do rastreamento de concentração de oxigênio e calibrá-lo para a saturação do ar de 100%.</li>
	<li>Calibre para oxigênio de 0%, selecionando uma parte estável do rastreamento de concentração de oxigênio quando o oxigênio não está presente na câmara. Execute esta etapa após 20 titulação µ l de 230 mM ditionito de sódio ou após todo o oxigênio é consumido pela amostra biológica no final do experimento.</li>
	<li>Após a calibração de ar de 100% do respirometer, feche o bujão e certifique-se de que não há bolhas estão presentes na câmara. Nota: um ligeiro aumento no fluxo de oxigênio será detectado na câmara fechada como o sensor de oxigênio polarographic (POS) consome oxigênio para medir a pressão parcial de oxigênio.</li>
	<li>Depois de ~ 10 min da rolha sendo fechada, confirme que o respirometer está pronto para células HepG2, observando um fluxo estável de oxigênio. Nota: O calorímetro usado aqui utiliza ampola de aço inoxidável e requer uma ampola para ser usado como uma referência.</li>
	<li>Adicionar 2,5 mL de H2O (dH2O) [volume igual como as amostras (etapa 4)] para a ampola de referência do calorímetro e aperte a tampa, usando um alicate, se necessário. Limpe a ampola selada com fluxo de ar e abaixe lentamente a ampola na posição 1 no canal de referência do calorímetro. Permanecem na posição 1 até amostra biológica é preparada.</li>
</ol>3. preparação de células HepG2 para respirometria e calorimetria
<ol><li>Confirme que o respirometer e o calorímetro são preparados e calibrados. Quente DMEM e tripsina a 37 ° C em banho-maria.</li>
	<li>Adicione DMEM para uma placa de 100mm fresca e lugar na incubadora para permitir o equilíbrio do meio para CO2 e temperatura. Nota: Este meio será usado para o experimento de calorimetria, então o volume apropriado depende do número de ampolas que será usado.</li>
	<li>Confirme com um microscópio invertido que as células estão em 60-80% de confluencia, depois lave a 100mm-placa 2 x com 10 mL de temperatura fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Adicionar 3 mL de tripsina de C a 37 ° a 100mm placa de células e incube-os por 7-10 min a 37 ° C, a incubadora de cultura de células. Neutralizar a tripsina com 3 mL de 37 ° C DMEM e suspender pipetando suavemente-~ 20 vezes com uma pipeta de 5 mL.</li>
	<li>Transferir a 6 mL de células ressuspensa em DMEM e tripsina em um tubo cônico de 15 mL estéril e centrifugue por 5 min à 175 g. x remover o líquido sem perturbar o centrifugado.</li>
	<li>Resuspenda o pellet de células em ~ 5 mL de DMEM e pipetar cuidadosamente para garantir que as células são suficientemente dissociado um do outro.</li>
	<li>Remova ~ 100 µ l da amostra bem misturada e realizar uma contagem completa de células utilizando todos os 8 campos em um hemocytometer para determinar o número total de células. Em seguida, calcule o volume para ressuspensão das células para gerar ~ 2 x 106 células por 50 µ l. Nota: Isto irá garantir que a 2 x 106 células são adicionadas a cada câmara do respirometer com deslocamento médio mínimo.</li>
	<li>Centrifugar as células durante 5 min à 175 x g. Ressuspender o sedimento do volume calculado de DMEM da etapa 3.7.</li>
	<li>Realize uma contagem de células, para determinar o volume necessário para injetar 2 x 106 células por câmara no respirometer (isto deve ser ~ 50 µ l). Armazene as células para a medição de respirometric no gelo até que esteja pronto.</li>
	<li>Enquanto a amostra concentrada de células está no gelo, determine a diluição necessária para produzir uma concentração de 1 x 105 células/mL para a calorimetria.</li>
	<li>Misturar a amostra bem e prepare-se para cada ampola ~ 3 mL de células a 1 x 105 células/mL em DMEM. Nota: O DMEM usado para a diluição da amostra deve ser o meio equilibrado, preparado na etapa 3.3.</li>
</ol>4. calorimetria
<ol><li>Garantir que o calorímetro é conectado ao computador e o sinal calorimétricos em µW é observável e estável.</li>
	<li>Adicionar 2,5 mL de células a 1 x 105 células/mL (5 células de ~2.5 x 10) para cada ampola, garantir o suficiente de ar entre a tampa da ampola e o meio para permitir a difusão do gás.</li>
	<li>Imediatamente aperte a tampa, usando um alicate, se necessário. Limpe a ampola selada, usando o fluxo de ar para remover quaisquer resíduos externos e abaixe lentamente a ampola na posição 1 do calorímetro. Registre o tempo que a ampola é abaixada na posição 1.</li>
	<li>Permitir que a ampola sentar-se na posição 1 por 15 min. Nota: Durante este período de 15 min, as células são para ser injetado o respirometer (passo 5). Isso garante que o mesmo intervalo de tempo é usado para produção de calor e consumo de oxigênio, quando a relação de CR é determinada.</li>
	<li>Após 15 minutos na posição 1, abaixe lentamente a referência e a amostra ampolas para a posição 2. Registra o tempo que as ampolas estavam abaixadas e medida pelo menos 30 min.</li>
</ol>5. respirometria
<ol><li>Durante o intervalo de 15 min em que a ampola está na posição 1 no calorímetro, começa os estudos respirometric.</li>
	<li>Misture bem a amostra de células pipetando para garantir uma solução homogénea e injetar < 50 µ l da amostra em cada câmara do respirometer para uma concentração final de ~ 2 x 106 células/câmara celular. Registre o tempo em que as células são injetadas no respirometer.</li>
	<li>Após a injeção, as células HepG2 são continuamente agitou a 37 ° C. Espere pelo menos 20-30 min para ambos uma estabilização do fluxo de oxigênio e uma diminuição constante da concentração de oxigênio.</li>
	<li>Selecione a guia de fluxo de2 O por V à direita da tela e realçar uma porção estável do fluxo de oxigênio. Selecione marcas, então as estatísticas e dados do registro para o fluxo de O2 por V. Esta gravação será usada no cálculo do rácio da CR. Nota: As etapas 5.5 e 5.6 são opcionais. Vazamento de respiração e respiração desacoplada máxima serão revelados por titulações de oligomicina e Compararia.</li>
	<li>Injetar 1 µ l de oligomicina 4mg/mL em cada câmara e permitir ~ 10 min para a estabilização do fluxo de oxigênio. Taxa de respiração vazamento estável registro seguindo as etapas executadas em 5.4 destacando uma parte estável do rastreamento de fluxo de oxigênio após adição de oligomicina.</li>
	<li>Titula-se injeções de 2 µ l de 0,2 mM Compararia em cada câmara, permitindo a estabilização de fluxo de oxigênio após cada injeção. Continue as titulações até o fluxo máximo é atingido, como indicado por um ligeiro decréscimo na titulação Compararia subsequente. A taxa de respiração estável durante o fluxo máximo de registro.</li>
</ol>6. cálculo do rácio de Calorespirometric
<ol><li>Realizar uma contagem de célula final das amostras preparadas em ~ 1 x 105 células/mL, utilizando todos os 8 campos de um hemocytometer para determinar o número total de células adicionado à ampola (2,5 mL).</li>
	<li>Determine um tempo para gravar medições do calorímetro e respirometer no qual estáveis sinais estão presentes em momentos idênticos. Referência que o tempo registrado quando a ampola foi reduzida para a posição 2 e o tempo de injeção de células para o respirometer.</li>
	<li>Grave a produção de calor, colocando o cursor sobre o rastreamento exibir a saída de calor para a ampola respeitada no momento determinado na etapa e expressa como µW/milhões de células. Coletar dados de consumo de oxigênio e certifique-se de que ele é expresso como pmol O2 x s-1 x milhões de células.</li>
	<li>Para calcular a taxa de CR, primeiro converta µW em kJ/s e depois dividir kJ/s por mol de O2/s para obter a relação de CR, expressada em kJ/mol O2. Nota: A relação do CR é apresentada em kJ/mol O2. (ver <a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">arquivo complementar 1</a>)</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O objetivo do calorespirometry é avaliar quantitativamente as contribuições das vias aeróbias e anaeróbias, a atividade metabólica e obter uma visão composta de fluxo de energia celular. Isso é realizado por uma medida simultânea de dissipação de calor e fluxo de oxigênio, seguido por uma comparação do rácio CR calculado com o equivalente de oxycaloric teórica. Vários passos críticos devem ser considerados para dados reprodutíveis e confiáveis. A manutenção de uma cultura de pilha de estéril, saudável é fundamental. Cont...

Em sistemas biológicos, a libertação de calor ou entalpia de mudança durante o metabolismo normalmente é monitorado ou diretamente (via directa calorimetria) ou indiretamente através do consumo de O2 e/ou produção de CO2 (através de respirometria). Infelizmente, quando estas técnicas são utilizadas em isolamento, informação crítica é perdida, tais como a contribuição das vias anaeróbias para o metabolismo celular. Calorespirometry é uma técnica poderosa que se baseia na medição simultânea de dissipação de calor e a respiração. Calorespirometric trabalho pioneiro investigou o metabolismo anaeróbico em células de mamíferos totalmente oxigenados e demonstrado contribuições simultâneas das vias aeróbias e anaeróbias, a homeostase de energia, apesar das células transformadas em uma ambiente totalmente oxigenado1. Calorespirometry desde que foi aplicado a uma grande variedade de questões biológicas. Alguns exemplos incluem o estudo da energética animal em baixos níveis de oxigênio, os efeitos do herbicida e do estrogênio sobre as brânquias de moluscos bivalves, o metabolismo de organismos terrestres e a decomposição microbiana do solo orgânico matéria2, 3 , 4 , 5 , 6. Além disso, calorespirometry tem revelado como metabólica pré-condicionamento antes da congelação melhora a criopreservação de mamíferos células7. Cada abordagem, tanto calorimetria e respirometria, independente aumentou nosso conhecimento do celular e a Bioenergética. No entanto, questões biológicas fundamentais que podem ser respondidas através da utilização de calorespirometry permanecem relativamente inexploradas.
Lei de Hess afirma que a mudança de entalpia total de uma reação é independente do percurso entre os Estados iniciais e finais. Por exemplo, a mudança de entalpia total para uma via metabólica é o somatório da variação enthalpies de todas as reações dentro da via. Calorimetria oferece uma abordagem em tempo real para medir a produção de calor celular, que detecta indiscriminadamente vias aeróbias e anaeróbias. Isto é baseado na Fundação que nenhuma energia é trocada no sistema exceto pelas paredes da ampola experimental8. Uma mudança na dissipação de calor é igual à mudança na entalpia liberada de todas as reações metabólicas em ampola. Assim, uma entalpia negativa se correlaciona com a perda de calor do sistema. Exaustiva pesquisa nas últimas quatro décadas tem caracterizado a paisagem termodinâmica de catabolismo e o anabolismo. Isso é representado por um aumento constante nos artigos de pesquisa encontrado sob os termos de busca "biológicos" e "calorimetria" como indexados pelos Estados Unidos nacional biblioteca da medicina (NLM) no National Institutes of Health (PubMed). A pesquisa revela que antes de 1970, um total de 27 publicações calorimetria biológicos de referência; Enquanto isso, no ano de 2016, 546 publicações utilizaram a técnica.
Os métodos calorimétricos são bem estabelecidos para determinar a produção de calor. No entanto, mais flexibilidade é concedida para resolver o valor respirometric. A medição de respirometric pode consistir de O2, CO2, ou tanto O2 e CO2. Além disso, a medição de O2 e CO2 pode ser realizada por várias técnicas, incluindo optrodes, eletrodos tipo Clark e diodo ajustável do laser absorção espectroscopia7,9,10 ,11. Enquanto a produção de CO2 é uma métrica valiosa em muitos estudos respirometric, o meio para pilhas cultivadas frequentemente utiliza um sistema de reserva de bicarbonic para controle de pH12,13. Para evitar complicações da medição de CO2 no sistema de bicarbonato, o seguinte protocolo para o calorespirometry das células em cultura utiliza O2 como o único parâmetro de respirometric.
Simultâneas com medição de fluxo de oxigênio, certas respirometers (ver Tabela de materiais) são projetados para avaliações detalhadas da função mitocondrial. Substrato-desacoplador-inibidor-titulações (SUIT) protocolos são bem estabelecidos e são compatíveis com os experimentos para medir a membrana potencial ou reativas de oxigênio (ROS) de espécies formação14. O protocolo apresentado por calorespirometry de células intactas é compatível com a introdução de produtos químicos uncouplers como carbonila cianeto-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) e a F0F1-ATP sintase inibidor oligomicina. Através da adição de FCCP, consumo de oxigênio pode ser desacoplado da produção de ATP, que é útil para avaliar o impacto da terapêutica potencial mitocondrial peformance15. Além disso, a adição de oligomicina acende-se a extensão da respiração de vazamento. Assim, as respirometric medições realizadas calorespirometry são compatíveis com protocolos extensivos projetados para elucidar ainda mais a fisiologia mitocondrial.
A medição simultânea de dissipação de calor e de fluxo de oxigênio permite o cálculo da relação de calorespirometric (CR). Esta relação é então comparada com a constante do Thornton ou a oxycaloric teórico equivalente, que varia entre-430 ao-480 kJ mol-1 , dependendo da linhagem de células ou tecidos de interesse e o de substratos de carbono completados1, 16. assim, uma relação de CR mais negativa revela aumentada contribuições de vias anaeróbias a atividade metabólica geral. Por exemplo, a proporção de CR para a respiração do tecido muscular rotina sem o desempenho ativo de trabalho varia de-448 a-468 kJ mol-1, que está dentro do intervalo dos teóricos oxycaloric equivalente17,18. Enquanto isso, células de câncer mamíferos cultivadas em meio que é rico em glicose exibir reforçada ácido lático fermentação glicólise a seguir e relativamente baixo envolvimento mitocondrial19. Este resultados de fenótipo em rácios de CR no intervalo de-490 a-800 kJ mol-1, demonstrando um maior envolvimento das vias anaeróbias no metabolismo celular como indicado pelo negativo mais CR rácios1,7, 16,20.
Distribuidores comerciais e sem fins lucrativos de célula e tecido atualmente oferta de linhas de celulares de mais de 150 espécies, com quase 4.000 linhas de células derivadas de seres humanos. Linha celular imortalizado é ferramentas convenientes para avaliar rapidamente a toxicidade da terapêutica potencial, muitos dos quais direta ou indiretamente interferem com funções mitocondriais. Usar células transformadas durante o rastreio de drogas pode ser de valor preditivo limitado em parte por causa do efeito Warburg, uma marca registrada de muitos cancros. Muitas vezes, cancros geram ATP de fosforilação do substrato-nível e mantêm equilíbrio redox através da produção de lactato sem engajar-se totalmente a mitocôndria sob condições aeróbias19. Desenvolvimento farmacêutico é notoriamente caro e ineficiente, com aproximadamente 8 em 9 compostos testados em ensaios clínicos humanos não atingirem o mercado aprovação21. Enquanto terapêutica potencial pode passar triagem inicial devido à baixa citotoxicidade em linhas celulares, é possível que alguns destes compostos são mitotoxic. Sem um método adequado para detectar como estas toxinas podem prejudicar o equilíbrio de energia em células primárias que não exibem o efeito Warburg, informação crítica é muitas vezes excessivamente olhou, descongestionamento desenvolvimento terapêutico em estágios iniciais.
Calorespirometry é uma abordagem prática e não-invasiva para analisar a atividade metabólica em uma variedade de amostras biológicas, incluindo células e tecidos. O núcleo do protocolo apresentado é compatível com uma variedade de aplicações. Uma complicação, no entanto, foi identificada. Células imortalizadas geralmente são cultivadas em um meio isento de glicose suplementado com galactose para aumentar a contribuição da fosforilação oxidativa (OXPHOS) para a produção de energia, a fim de sensibilizar as células com potencial mitotoxins22, 23. Esta reprogramação metabólica parece obscurecer a análise quando amostras são colocadas nas ampolas de aço inoxidável usadas pelo calorímetro15. As células cultivadas em meio de glicose continuam a se envolver em alta atividade metabólica durante várias horas. Enquanto isso, células cultivadas em meio de galactose diminuem a produção de calor dentro de 30 min de sua colocação em ampola, fazer medições restritas aos pontos de início tempo experimental. Este comportamento, infelizmente, dificulta a oportunidade de avaliar sua proliferação celular. Apesar desta limitação específica, a maioria dos aplicativos são compatíveis com análise de calorespirometric e metabólicas obter informações detalhadas podem ser obtidas através desta abordagem.

<table><tbody><tr><td>Células HepG2 American</td><td>Type Culture Collection</td><td>HB-8065</td><td>Células usadas para calorespirometria</td></tr><tr><td>O2k-Respirômetro</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10022-02</td><td>Respirômetro</td></tr><tr><td>LKB 2277 monitor de atividade térmica (TAM)</td> <td>Thermometric AB</td><td></td><td>Thermometric foi comprado pela TA Instruments</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td> <td>Thermofisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Solução 100x adicionada ao meio DMEM</td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino - Premiuim Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Adicionado a 10% em meio DMEM</td></tr><tr><td>Tripsn-EDTA (0,25%)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td>Reagente de dissociação</td></tr><tr><td>celular Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>O4876</td><td>Inibidor mitocondrial</td></tr><tr><td>Cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Desacoplador mitocondrial</td></tr><tr><td>Corning 100 mm TC-Treated Culture</td><td>Dish Corning Corporation</td><td>430167</td><td>Placa de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Glicose, pó</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15023021</td><td>Glicose para meio DMEM</td></tr><tr><td>Galactose, pó</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP656500</td><td>Galactose para meio DMEM</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Glutamina para meio</td></tr><tr><td>DMEM DMEM, sem glicose</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11966025</td><td>Meio de cultura celular</td></tr></tbody></table>

calorespirometry: uma abordagem poderosa, não-invasiva para investigar o metabolismo energético celular

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Muitas linhas de celulares usadas em pesquisa biológica e biomédica básica mantenham a homeostase de energia através de uma combinação da respiração aeróbia e anaeróbia. No entanto, na medida em que ambos os caminhos contribuem para a paisagem da produção de energia celular é consistentemente ignorada. Células transformadas cultivadas em saturando os níveis de glicose frequentemente mostram uma diminuição da dependência na fosforilação oxidativa para a produção de ATP, que é compensada por um aumento no nível de substrato fosforilação. Essa mudança no equilíbrio metabólico permite que as células a proliferar apesar da presença de toxinas mitocondriais. Em negligenciar a poise metabólica alterada de células transformadas, resultados de um rastreio farmacêutico podem ser mal interpretados desde o potencialmente mitotoxic efeitos podem não ser detectados usando linhas de célula modelo cultivadas na presença de glicose alta concentrações. Este protocolo descreve o emparelhamento de duas técnicas poderosas, respirometria e calorimetria, que permite a avaliação quantitativa e não-invasiva de contribuições aeróbias e anaeróbias para produção de ATP celular. Respiração aeróbia e anaeróbia gera calor, que pode ser monitorado através de calorimetria. Enquanto isso, a medição da taxa de consumo de oxigênio pode avaliar o grau de respiração aeróbia. Quando tanto a dissipação de calor e consumo de oxigênio são medidos simultaneamente, a relação de calorespirometric pode ser determinada. O valor obtido experimentalmente em seguida pode ser comparado com a oxycaloric teórico equivalente e a extensão da respiração anaeróbica pode ser julgada. Assim, o calorespirometry fornece um método exclusivo para analisar uma ampla gama de questões biológicas, incluindo o desenvolvimento de drogas, crescimento microbiano e bioenergética fundamental sob condições de hipóxicos e normoxic.

A reprodutibilidade das medições calorespirometric depende de uma preparação de amostra adequada e consistente. Amostras preparadas a partir de cultura de células não devem ser usadas se as placas são abandonadas, como contagem de células pode se tornar imprecisa devido à aglutinação. Além disso, os fluxos de calor reduzida devido à difusão do substrato limitada nas células agrupadas podem ocorrer. Portanto, quando usando células aderentes, é crítico para selecionar uma placa com a confluência entre 60-80% e para mudar o...

Este protocolo descreve calorespirometry, a medição direta e simultânea de dissipação de calor e de respiração, que fornece uma abordagem não-invasiva para avaliar o metabolismo energético. Esta técnica é usada para avaliar a contribuição das vias aeróbias e anaeróbias para utilização de energia, monitorando o fluxo de energia celular total.

Calorespirometry: Uma abordagem poderosa, não-invasiva para investigar o metabolismo energético celular

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Os objetivos gerais deste procedimento são analisar a atividade metabólica de uma amostra biológica e determinar até que ponto as vias anaeróbicas contribuem para a produção de energia celular dentro da amostra. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo farmacêutico sobre a extensão da toxicidade mitocondrial durante o desenvolvimento de medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita a medição simultânea do consumo de oxigênio e da produção de calor em uma amostra de célula de interesse.Portanto, esse método pode fornecer informações sobre o planejamento do tratamento durante o desenvolvimento farmacêutico. Também pode ser aplicado a outros campos, como a cirobiologia, na qual os efeitos do pré-condicionamento metabólico na criopreservação podem ser avaliados. Para preparar o respirômetro, primeiro adicione dois vírgula dois mililitros de DMEM a cada câmara do respirômetro e insira totalmente as rolhas.Ajustar as rolhas com uma ferramenta espaçadora de rolhas para permitir a difusão ideal do oxigénio para o meio e definir as câmaras para agitar continuamente as amostras a 750 rpm a 37 graus Celsius até que a concentração de oxigénio e o flux

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

A descrição de um método para caracterização da função mitocondrial em células é fornecido. O perfil mitocondrial gerado fornece quatro parâmetros da função mitocondrial, que pode ser medido em um experimento: taxa de respiração basal, ATP-linked respiração, vazamento de prótons, e capacidade de reserva.

Experimento Perfil bioenergética usando células C2C12 mioblastos

Os métodos apresentados fornecem instruções passo a passo para a realização de uma coleção de ensaios respirométricos baseados em microplacas usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de músculo esquelético de camundongo. Esses ensaios são capazes de medir mudanças/adaptações mecanicistas no consumo de oxigênio mitocondrial em um modelo animal comumente usado.

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

O objetivo do presente protocolo é medir o efeito da glicose mediada por alterações de respiração mitocondrial na presença de compostos naturais intactos 832/13 beta células usando respirometria de alta resolução.

Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

Avaliar a fosforilação oxidativa usando respirômetros de alta resolução tornou-se parte integrante da análise funcional das mitocôndrias e do metabolismo de energia celular. Aqui, apresentamos protocolos para a análise do metabolismo de energia celular usando respirômetros de alta resolução baseados em câmara e microplatos e discutimos os principais benefícios de cada dispositivo.

Respirometria de alta resolução para avaliar bioenergésicos em células e tecidos usando respirômetros baseados em câmara e placas

O estado metabólico das células epiteliais pigmentares da retina humana (H-RPE) reflete sua saúde e função. Apresentamos aqui um protocolo otimizado para examinar o fluxo metabólico em tempo real de H-RPE usando respirometria de alta resolução.

Análise em Tempo Real da Bioenergética em Células Epiteliais Pigmentares Pigmentares Humanas Primárias Usando Respirometria de Alta Resolução

Aqui, descrevemos um método abrangente para medir a fosforilação oxidativa mitocondrial em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas frescas de músculos humanos ou de camundongos. Este método permite a quantificação em tempo real da respiração mitocondrial e a avaliação da preferência de combustível e flexibilidade metabólica, preservando as redes mitocondriais existentes e a integridade da membrana.

Medição da respiração mitocondrial em fibras musculares esqueléticas humanas e de camundongos por respirometria de alta resolução

O uso indevido de álcool prejudica a imunidade dos macrófagos alveolares (MA) devido à supressão da respiração mitocondrial e da bioenergética. Recentemente, demonstramos que a exposição ao etanol (EtOH) aumenta a dependência da glutamina para a respiração mitocondrial em AMs. Aqui, são fornecidos métodos para determinar o uso de glutamina para respiração mitocondrial em AMs tratados com EtOH usando um bioanalisador de fluxo extracelular.

Avaliação da glutamina como fonte de combustível para macrófagos alveolares expostos ao etanol crônico usando um bioanalisador de fluxo extracelular

Apresentamos um método não invasivo e em tempo real para monitorar a saúde mitocondrial usando Espectroscopia Raman por Ressonância (RRS). Usamos RRS para quantificar os estados redox mitocondriais e desenvolvemos uma métrica para a saúde mitocondrial, a razão mitocondrial reduzida de Ressonância Raman (3RMR), que mostra uma resposta mais rápida às mudanças na oxigenação do que os analitos tradicionais de gases sanguíneos.

Avaliação em tempo real e não invasiva da função mitocondrial usando espectroscopia Raman por ressonância

Neste relatório, nós descrevemos a pele tridimensional reconstruir modelo que imita a pele humana em arquitetura e composição. Fisiologia dos melanócitos, a progressão de melanoma eo destino de células-tronco dérmica foram investigados usando a pele reconstruir modelo. O modelo também é útil como uma ferramenta de pré-clínicos para avaliação de drogas.

A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

Aprenda a técnica de calorespirometria para analisar o metabolismo energético celular de forma não invasiva. Este método mede simultaneamente o consumo de oxigênio e a produção de calor em amostras biológicas.

Calorespirometry: Uma abordagem poderosa, não-invasiva para investigar o metabolismo energético celular

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