Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação
13 de julho de 2018
Aqui, apresentamos um protocolo que usa JC-1 tintura para avaliar o potencial de membrana mitocondrial das células após serem expostos a hipóxia/reoxigenação com ou sem um agente protetor.
Este método pode ajudar a medir o efeito da hipóxia/reoxigenação nas células do potencial de membrana mitocondrial e pode ser usado para avaliar se um agente é protetor contra uma lesão. A principal vantagem deste ensaio é que a MMP detectada por ele ocorre no caso de fatores como o tamanho mitocondrial. Além disso, tem uma baixa exigência de materiais e brilho.
Comece com 70% de miócitos cardíacos humanos confluentes em uma placa de seis poços. Depois de lavar as células com solução salina tampão fosfato, adicione o medicamento ou veículo em dois mililitros de soro e DMEM livre de glicose. Incube em uma incubadora de cultura de células contendo 5% de CO2 e 95% de ar a 37 graus Celsius por 30 minutos antes da hipóxia.
Após 30 minutos, coloque o prato de miócitos cardíacos humanos em um frasco anhipóxico hermético de 2,5 litros. Equipado com um catalisador para eliminar o oxigênio livre e um indicador anaeróbico para medir a tensão de oxigênio no meio. Coloque o frasco na incubadora de cultura de tecidos.
A cor do indicador anaeróbico muda de azul claro em ambiente normóxico para branco pálido em condições hipóxicas. Reoxigene os miócitos cardíacos humanos removendo a placa de seis poços do frasco e colocando-a na prateleira da incubadora por duas horas. Após a reoxigenação, enxágue as células com um mililitro de PBS pré-aquecido e adicione 0,5 mililitros de tripsina a 25% pré-aquecida ao longo da parede do poço.
Incube a 37 graus Celsius por cerca de um minuto até que todos os miócitos cardíacos humanos estejam quase descolados. Em seguida, adicione um mililitro de meio completo DMEM aos poços para neutralizar a tripsina. Transferir a suspensão da célula para um tubo de centrifugação de 15 mililitros e fazer HCMs em pellets centrifugando a 500 vezes G durante três minutos, à temperatura ambiente.
Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar os grânulos. Em seguida, adicione 5 mililitros de meio completo de miócito cardíaco humano e 5 mililitros de solução de trabalho JC-1 a cada tubo. Ressuspenda os HCMs pipetando para cima e para baixo.
Cubra os tubos com papel alumínio para evitar o branqueamento do indicador fluorescente e incube as células em condições normais por 20 minutos. Depois de peletizar os miócitos cardíacos humanos centrifugando a 500 vezes G por três minutos em uma centrífuga pré-resfriada a quatro graus Celsius, enxágue as células duas vezes com dois mililitros de tampão de coloração JC-1 gelado. Após o segundo enxágue, ressuspenda os miócitos cardíacos humanos em 300 microlitros de tampão de coloração gelada.
E filtre as amostras nos respectivos tubos de amostra. Analisar as células por citometria de fluxo em 30 minutos. Inicie o citômetro de fluxo e certifique-se de que o software esteja conectado.
Execute a inicialização fluídica. Inicie o fluxo e configure a interrupção. Abra duas janelas de gráfico de pontos no software de citometria de fluxo.
Selecione a luz difusa para frente no eixo X e a luz difusa lateral no eixo Y no primeiro gráfico de pontos. Representar as características das células em termos de tamanho e granularidade, respectivamente. Selecione o canal de detecção PE para o eixo Y.
E FITC para o eixo X, usando uma escala logarítmica no segundo gráfico de pontos, que é usado para medir a intensidade de florescência do corante JC-1 nas células. Clique em descarregar para soltar o braço de suporte do tubo e posicione o tubo de amostra em branco contendo miócitos cardíacos humanos que não foram tingidos com JC-1. Clique em carregar para retornar o braço de suporte à sua posição de trabalho.
Clique em gravar para coletar partículas da suspensão no tubo de amostra em branco. E ajuste as tensões dos canais de fluorescência no segundo gráfico de pontos. Gate a população de células para análise posterior no primeiro gráfico de pontos.
Em seguida, analise os miócitos cardíacos humanos. Exiba as estatísticas de cada tubo de amostra e calcule as MMPs de cada amostra dividindo a proporção da intensidade da fluorescência vermelha pela intensidade da fluorescência verde. A hipóxia e a reoxigenação induzem significativamente a apoptose de miócitos cardíacos humanos, em comparação com células normais, conforme medido pela relação IP da anexina.
uma medicina tradicional chinesa com efeitos cardioprotetores, preveniu a apoptose de CMHs após hipóxia/reoxigenação. Como mostrado aqui, a relação vermelho / verde JC-1 após o tratamento com o CCP mitocondrial foi quase zero. Consistente com os resultados do ensaio de apoptose.
O grupo tratado com H/R apresentou uma relação vermelho/verde significativamente menor, em comparação com o grupo normal. E reverteu essa mudança de proporção. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de iniciar as células carregadas com JC-1 em tampão de pé gelado, pois a temperatura tem um efeito considerável na estabilidade do potencial de membrana mitocondrial.
Seguindo este procedimento, outros métodos, como manipulação genética, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se a diminuição da MMP resulta da abertura do MPTP.
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Visão Geral
Este protocolo utiliza o corante JC-1 para avaliar o potencial de membrana mitocondrial (PMM) de células submetidas a hipóxia/reoxigenação. Também avalia os efeitos protetores de agentes contra lesão celular.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Função Mitocondrial
- Pesquisa em Hipóxia
Fundamentos
- O potencial de membrana mitocondrial é crucial para a sobrevivência celular.
- Hipóxia/reoxigenação pode levar à lesão celular.
- Agentes protetores podem mitigar esses efeitos.
- O corante JC-1 é um indicador confiável de mudanças no PMM.
Objetivo do Estudo
- Medir o impacto da hipóxia/reoxigenação no PMM.
- Avaliar os efeitos protetores de agentes específicos.
- Fornecer um ensaio de baixo custo para avaliação do PMM.
Métodos Utilizados
- Cultivar miócitos cardíacos humanos até 70% de confluência.
- Lavar células com solução salina de fosfato.
- Incubar com droga ou veículo em DMEM sem soro.
- Expor células a condições de hipóxia para avaliação.
Principais Resultados
- Demonstrou mudanças no PMM devido à hipóxia/reoxigenação.
- Identificou efeitos protetores de agentes no PMM.
- Mostrou baixos requisitos de material para o ensaio.
- Destacou a influência do tamanho mitocondrial na detecção do PMM.
Conclusões
- O ensaio JC-1 é eficaz para avaliar mudanças no PMM.
- Agentes protetores podem influenciar significativamente os resultados do PMM.
- Este método é acessível e eficiente para estudos celulares.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial membrane potential (MMP) is critical for evaluating cardioprotective strategies in ischemia-reperfusion injury models. This flow cytometry-based JC-1 assay provides a quantitative, high-throughput readout of mitochondrial depolarization in human cardiac myocytes, enabling mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting reperfusion injury. The method supports target validation by linking MMP changes to mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, a key event in cardiomyocyte death.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures MMP as a functional readout of mitochondrial health and mPTP opening in disease-relevant human cardiac myocytes.
- Operational Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding cytoprotective agents under hypoxia/reoxygenation stress.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating MMP preservation with reduced apoptosis, as demonstrated by Annexin PI ratio.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: JC-1’s red/green fluorescence ratio provides a ratiometric, mitochondria-specific readout independent of cell size or granularity.
- Operational Value: Low material requirements and compatibility with standard flow cytometry platforms support assay scalability and reproducibility.
- Screening Readiness: Enables rapid evaluation of compound libraries for effects on MMP in a physiologically relevant human cell model.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses human cardiac myocytes to enhance translational relevance over rodent models in ischemia-reperfusion studies.
- Operational Value: Standardized hypoxia/reoxygenation protocol allows consistent induction of mitochondrial depolarization for compound testing.
- Predictive Value: Facilitates go/no-go decisions by linking MMP protection to functional outcomes like reduced apoptosis.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation and lead identification by providing mechanistic insights into mitochondrial dysfunction in cardiovascular disease models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of MMP as a biomarker of mPTP activation and reperfusion injury severity.
- Screening: Delivers quantitative, normalized fluorescence ratio data suitable for hit selection and dose-response profiling.
- Analytics: Generates red/green intensity ratio metrics that allow statistical comparison across treatment groups.
- Translational Research: Uses human-derived cells to improve predictive confidence for preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted across cardiotoxicity and cardioprotection screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mitochondrial depolarization as a convergent point of reperfusion injury pathways.
- Operational Value: Minimizes variability by normalizing MMP readout to mitochondrial content via ratiometric JC-1 detection.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of compounds that preserve MMP and reduce apoptotic commitment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating MMP stabilization in human cardiac myocytes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cardiac myocyte culture and hypoxia/reoxygenation modeling.
- Dependent on flow cytometry with FITC and PE detection channels and logarithmic fluorescence scaling.
- Necessitates strict temperature control during JC-1 staining to preserve mitochondrial membrane potential integrity.
- Requires standardization of hypoxia duration and reoxygenation timing across experimental groups.
- Limited to adherent cell types amenable to trypsinization and washing without loss of viability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Establishment of Hypoxia/Reoxygenation Model
1:57
Preparation of HCMs for Flow Cytometry
3:49
Flow Cytometer Setup
4:43
Flow Cytometry Measurement and Data Analysis
5:40
Results: Validation of the Establishment of Hypoxia/Reoxygenation (H/R) Model by Flow Cytometry
6:34
Conclusion
