Name: Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprenda a medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos cardíacos humanos após hipóxia/reoxigenação usando o ensaio de citometria de fluxo com corante JC-1. Este método avalia efeitos protetores de agentes com baixo consumo de materiais.

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Este estudo foi suportado por concessões do nacional a chave de pesquisa e programa de desenvolvimento da China (n. º 2017YFC1700503), programa nacional de pesquisa básica (programa 973) da China (No.2012CB518602), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81370223 e n. º 81573957) e Fundação de pesquisas inovadoras dos pós-graduados a de Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).

1. preparação de reagentes e soluções
<ol><li>Prepare meio completo humano miócitos (HCMs) adicionando-se 25 mL de mistura de suplemento miócito crescimento médio de 500 mL do meio de crescimento do miócito conforme as instruções do fabricante. Loja a 4 ° C e aquecer a 37 ° C antes de usar.</li>
	<li>Preparar a solução de Tongxinluo (TXL) pela dissolução TXL pó ultrafino em soro/glicose-livre de Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) e ajustar a concentração de TXL a 400 µ g/mL, adicionando DMEM (para mais detalhes, ver11). Loja a 4 ° C e aquecer a 37 ° C antes de usar.</li>
	<li>Prepare-se 5 mL da solução de trabalho de JC-1 adicionando 25 µ l de solução-mãe (200x) JC-1, 4 mL de água ultrapura e 1 mL de estoque coloração tampão (5x) em um tubo de centrífuga de 15 mL no escuro. Pipetar a mistura acima e para baixo várias vezes e aquecer até 37 ° C antes de usar.</li>
	<li>Prepare 30 mL de trabalhar buffer de coloração adicionando 24 mL de água ultrapura para 6 mL de estoque coloração buffer (5x) em um tubo de centrífuga de 50 mL. Use esta solução gelada.</li>
</ol>2. estabelecimento de modelo de hipóxia/reoxigenação
<ol><li>Placa de 1,0 x 105 células por poço com meio completo de HCM em um prato bem 6. Crescer para atingir uma confluência de cerca de 70% em uma incubadora de células contendo 5% de CO2 e 95% ar a 37 ° C.</li>
	<li>HCMs lavar com soro fisiológico de tampão fosfato (PBS). Expô-las a diferentes tratamentos (400 µ g/mL TXL ou não) em 2 mL de soro/glicose livre DMEM por 30 min antes de hipóxia em uma incubadora de células contendo 5% de CO2 e 95% ar a 37 ° C.</li>
	<li>Incube HCMs em um frasco hermético e hipóxico (2,5 L) equipados com um catalisador para eliminar o oxigênio livre e induzir a hipóxia por 18 h (figura 1A) e um indicador anaeróbio para medir a tensão de oxigênio no médio11,12, 13, em uma incubadora de células contendo 5% de CO2 e 95% ar a 37 ° C. Nota: Demora cerca de 1,5 h para o catalisador eliminar oxigênio livre no frasco. Portanto, os HCMs são mantidos no frasco para 19,5 h antes que o frasco é aberto. A cor do indicador anaeróbica muda de luz azul no ambiente normoxic para branco pálido em condições de hipóxia (figura 1B).</li>
	<li>Reoxygenate HCMs movendo a placa bem 6 para uma incubadora definir a 37 ° C, contendo 5% CO2 e 95% do ar por 2 h.</li>
</ol>3. preparação de HCMs por citometria de fluxo
<ol><li>Aquecer a solução de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético-tripsina 0,25% e PBS a 37 ° C.</li>
	<li>Médio de cada poço, Aspire, enxaguar as células com 1 mL de PBS e adicionar 0,5 mL de tripsina 0,25% ao longo da parede do poço.</li>
	<li>Incube a 37 ° C até HCMs todos são quase isoladas (cerca de 1 min).</li>
	<li>Adicione 1 mL de DMEM completo meio (meio DMEM com 10% de soro fetal bovino) nos poços para neutralizar a tripsina. Pelota HCMs por centrifugação a 500 x g, durante 3 min à temperatura ambiente e transfira a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de meio completo HCM e 0,5 mL de solução de trabalho de JC-1 para cada tubo. Ressuspender os HCMs pipetando para cima e para baixo.</li>
	<li>Cobrir os tubos todo com papel de alumínio para evitar o branqueamento do indicador fluorescente e incubar HCMs em condições normais (a 37 ° C contendo 5% de CO2 e 95% ar) por 20 min.</li>
	<li>HCMs pelota por centrifugação a 500 x g, durante 3 min a 4 ° C.</li>
	<li>Enxágue HCMs duas vezes com 2 mL de tampão de coloração gelada JC-1.</li>
	<li>Resuspenda HCMs em um volume final de 300 µ l de tampão de coloração gelada no tubo de amostra (12 x 75 mm) e usar as células para análise dentro de 30 min. Nota: Use Carbonilcianeto m-clorofenil-hidrazona (CCCP), um potente inibidor da cadeia respiratória de transporte de elétrons, para tratar HCMs por 1h em uma concentração de 20 µM, para o controlo positivo.</li>
</ol>4. instalação de citômetro de fluxo
<ol><li>Inicie o citômetro de fluxo e certifique-se de que o software é ligado a ela.</li>
	<li>Executar inicialização fluidics, iniciar o fluxo e configurar o breakoff.</li>
	<li>Abra duas janelas de trama do ponto do software de citometria de fluxo.<ol>
<li>Selecione Avançar espalhadas (FSC) no eixo X e luz lado espalhado (SSC) no eixo Y na primeira parcela ponto para representar as características das células em termos de seu tamanho e sua granularidade, respectivamente.</li>
		<li>Selecione o canal da deteção do PE (575 ± 26 nm) para o eixo Y e FITC (530 ± 30 nm) para o eixo X, usar uma escala logarítmica na trama do segunda ponto, que é usada para medir a intensidade de fluorescência do corante JC-1 nas células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. fluxo Cytometry medição e análise de dados
<ol><li>Clique em descarregar para fora o tubo suporte braço e posicione-a em branco (HCMs que não foram tingidos com JC-1) amostra tubo nele. Clique em Load para retornar o braço de suporte do tubo, a sua posição de trabalho.</li>
	<li>Clique em registro para coletar partículas de suspensão no tubo de amostra em branco e então portão população celular (P1) para posterior análise na trama do primeira ponto (Figura 3).</li>
	<li>Coletar HCMs em outros tubos de amostra e otimizar a medição ajustando as tensões dos canais de fluorescência, para certificar-se que o ponto de célula está localizado na área central da trama do segunda ponto.</li>
	<li>Exibir as estatísticas de cada tubo de amostra e calcular as MMPs de cada amostra, dividindo-se a relação de intensidade de fluorescência vermelha por que da intensidade de fluorescência verde.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1606915">Acute Myocardial Infarction.</a> New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li>
<li>Ibanez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESC+Guidelines+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation%3A+The+Task+Force+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).</li>
<li>Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Myocardial reperfusion injury.</a> New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).</li>
<li>Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+role+in+myocardial+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).</li>
<li>Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+cardioprotection%3A+signal+transduction+in+ischemic+pre-%2C+post-%2C+and+remote+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning.</a> Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).</li>
<li>Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+an+isolated+mitochondrial+population+revealed+by+cytofluorometric+analysis+at+the+single+organelle+level%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level.</a> Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).</li>
<li>Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+and+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li>
<li>Cossarizza, A., Salvioli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+using+JC-1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14(2001).</li>
<li>Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JC-1%2C+but+not+DiOC6%283%29+or+rhodamine+123%2C+is+a+reliable+fluorescent+probe+to+assess+delta+psi+changes+in+intact+cells%3A+implications+for+studies+on+mitochondrial+functionality+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis.</a> FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).</li>
<li>Chen, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+miR-128-3p+by+Tongxinluo+Protects+Human+Cardiomyocytes+from+Ischemia%2Freperfusion+Injury+via+Upregulation+of+p70s6k1%2Fp-p70s6k1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 775(2017).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+autophagy+by+Tongxinluo+through+the+MEK%2FERK+pathway+protects+human+cardiac+microvascular+endothelial+cells+from+hypoxia%2Freoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+protects+mesenchymal+stem+cells+against+hypoxia+and+serum+deprivation-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis.</a> Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.prot065490.short">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).</li>
<li>Pravdic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetic-induced+preconditioning+delays+opening+of+mitochondrial+permeability+transition+pore+via+protein+Kinase+C-epsilon-mediated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway.</a> Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Excessive+Histone+Deacetylases+Activity+in+Diabetic+Hearts+Attenuates+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion+Injury+via+Mitochondria+Apoptosis+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway.</a> Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065(2017).</li>
<li>Qiu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-induced+melanoma+cell+death+is+associated+with+mitochondrial+permeability+transition+pore+%28mPTP%29+opening%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).</li>
<li>Zhen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+dependent+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+is+required+for+dexamethasone-induced+death+of+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts.</a> Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).</li>
<li>Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2+as+a+potential+target+of+mitochondrial+superoxide+and+its+role+in+endothelial+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).</li>
<li>Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mitochondrial+KATP+channel+on+voltage-gated+K%2B+channel+in+24+hour-hypoxic+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).</li>
<li>Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neuroprotective+Effects+of+Hypothermia+on+Bilirubin-Induced+Neurotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro.</a> Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).</li>
<li>Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+by+Jiang+Zhi+Granule+protects+against+metabolic+stress-induced+hepatocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury.</a> World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).</li>
<li>El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renoprotective+Effects+of+Aldose+Reductase+Inhibitor+Epalrestat+against+High+Glucose-Induced+Cellular+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury.</a> Biomed Research International. 2017, 5903105(2017).</li>
<li>Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Liver+Mitochondria+Isolation%2C+Size+Fractionation%2C+and+Real-time+MOMP+Measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement.</a> Bio-Protocols. 6 (15), (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, apresentamos um protocolo que utiliza o corante de JC-1 para avaliar a MMP das células após serem expostos a H/R. detectadas pelo ensaio de JC-1, o MMP de células independe de fatores como tamanho mitocondrial, forma e densidade que possam influenciar a fluorescência do único-componente sinais de14. Consequentemente, os resultados do ensaio de JC-1 são relativamente confiáveis. Além disso, é conveniente e economia de tempo para realizar o ensaio de JC-1. Este ensaio tem uma baixa exigência p...

Doença coronariana é a principal causa de morte no mundo. O tratamento de escolha para reduzir lesões isquêmicas e limitar o tamanho do infarto em pacientes com ST-segmento elevados do miocárdio é oportuna e eficaz de reperfusão miocárdica através de intervenção coronária percutânea primária (PCI)1, 2. No entanto, a reperfusão causa dano adicional, que pode representar até 30% do tamanho final de infarto3. É universalmente reconhecido que o poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) não é apenas central na morte de danos e célula mitocondrial durante a isquemia/reperfusão (eu / R), mas é também um destino convergente do cardioprotetores sinalização4 , 5. como a abertura do mPTP acarretaria a despolarização da membrana mitocondrial interna potencial (MMP)4, detectamos mPTP abertura usando o 5, 5, 6, 6 '-tetracloro-1, 1, 3, 3 '-tetraetil-imidacarbocyanineiodide (JC-1) do ensaio.
O ensaio de JC-1 é um método de cytofluorimetric que é tanto qualitativas como quantitativas, e foi validado mais analisando o MMP ao nível de uma única mitocôndria6. JC-1 existe como forma agregada, rendendo um vermelho a laranja colorida de emissão (590 ± 17.5 nm) na matriz da mitocôndria com MMP normal; com a perda de MMP, JC-1 é convertido para a forma monomérica que produz fluorescência verde com uma emissão de 530 nm ± 15. Portanto, uma diminuição do rácio de intensidade de fluorescência vermelha/verde pode indicar a redução de MMP em condições tais como isquemia/reperfusão (eu / R).
Além de JC-1, MMP também tem sido estudada com membrana permeável cações lipofílicas como Rodamina 123 e 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine iodeto [DiOC6(3)]. No entanto, em comparação com estas duas sondas, JC-1 é mais confiável para a análise de MMP. Rodamina 123 tem sensibilidade relativamente pobre (especialmente em têmpera de7,de modo8) e especificidade de pobre. A mudança de rodamina 123 às vezes é tão pequena que é difícil para os pesquisadores ou equipamento para observar/detectar. Além disso, em uma única célula, existem sites de ligação diferentes mitocôndria para Rodamina 123 e assim que ele pode ter fluorescência diferentes emissões9. DiOC6(3) não é recomendado para a detecção de MMP também como ele reage com sensibilidade para a despolarização da membrana plasmática10.
Portanto, aqui vamos usar o JC-1 ensaio para avaliar a MMP de HCMs após serem expostos a hipóxia/reoxigenação com ou sem um agente protetor.

<table><tbody><tr><td>Kit de ensaio de potencial de membrana mitocondrial com JC-1</td><td>Beyodtime, China</td><td>C2006</td><td>No kit há solução de estoque JC-1 (200 &vezes;), tampão de coloração de estoque (5&vezes;) e pó ultrafino CCCP (10mM)</td></tr> <tr><td>Tongxinluo</td><td>Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China</td><td>071201</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V-FITC/PI Kit</td><td>Becton-Dickinson, EUA</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies, Grand Island Biological Company, EUA</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Miócitos cardíacos humanos</td><td>Promocell, Alemanha</td><td>C-12810</td><td></td></tr><tr><td>Meio de crescimento de miócitos (SupplementMix)</td><td>Promocell, Alemanha</td><td>C-39275</td><td></td></tr><tr><td>Meio de crescimento de miócitos (pronto para uso)</td><td>Promocell, Alemanha</td><td>C-22070</td><td>usado com meio de crescimento de miócitos SupplementMix</td></tr><tr><td>GENbox</td><td>BioM&eacute; rieux, Marcy l' Etoile, França</td><td>96127</td><td>Catalisador 2.5L</td></tr><tr><td>(AnaeroPack)</td><td>MITSUBISHI GAS CHEMICAL&nbsp; COMPANY, INC.&nbsp;, Japão</td><td>&nbsp; C-1</td><td></td></tr><tr><td>Indicador anaeróbico</td><td>BioM&eacute; rieux, Marcy l' Etoile, França</td><td>96118</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>Becton-Dickinson, EUA</td><td>FACSAria 2</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>Becton-Dickinson, EUA</td><td></td><td>Versão 8.0.1</td></tr><tr><td>Tubo de amostra</td><td>Corning science, EUA</td><td>352054</td><td>12 * 75mm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone, EUA</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Oportuna e eficiente de reperfusão da artéria coronária obstruída é a melhor estratégia para diminuir o tamanho do infarto do miocárdio em pacientes com um segmento ST elevado de infarto do miocárdio. No entanto, reperfusão por si pode resultar em mais casos de morte, um fenômeno conhecido como lesão de reperfusão. A abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP), com a diminuição do potencial de membrana mitocondrial (MMP), ou despolarização mitocondrial, é universalmente reconhecida como a etapa final da lesão de reperfusão e é responsável por mitocondrial e casos de morte. JC-1 é um corante lipofílico catiônico que se acumula nas mitocôndrias, dependendo do valor da MMP. Quanto maior o MMP é, quanto mais JC-1 acumula-se nas mitocôndrias. As quantidades crescentes de JC-1 na mitocôndria podem ser refletidas por uma mudança de emissão de fluorescência do verde (~ 530 nm) ao vermelho (~ 590 nm). Portanto, a redução do rácio da intensidade de fluorescência vermelha/verde pode indicar a despolarização da mitocôndria. Aqui, levamos vantagem do JC-1 para medir MMP, ou a abertura do mPTP em miócitos humanos após hipóxia/reoxigenação, detectada por citometria de fluxo.

Antes de realizar o ensaio de JC-1 para avaliar as alterações de MMP, é altamente recomendável que ser realizados experimentos confirmar as condições com êxito definido pelos pesquisadores. Como mostram os resultados de citometria de fluxo (Figura 2), em comparação com o grupo normal, hipóxia/reoxigenação (H/R) significativamente induziu a apoptose de HCMs (anexina V + /PI±), indicando que nós tinha estabelecido um modelo baseado em pilha de I / R (45.00 ± 2,...

Aqui, apresentamos um protocolo que usa JC-1 tintura para avaliar o potencial de membrana mitocondrial das células após serem expostos a hipóxia/reoxigenação com ou sem um agente protetor.

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Este método pode ajudar a medir o efeito da hipóxia/reoxigenação nas células do potencial de membrana mitocondrial e pode ser usado para avaliar se um agente é protetor contra uma lesão. A principal vantagem deste ensaio é que a MMP detectada por ele ocorre no caso de fatores como o tamanho mitocondrial. Além disso, tem uma baixa exigência de materiais e brilho.Comece com 70% de miócitos cardíacos humanos confluentes em uma placa de seis poços. Depois de lavar as células com solução salina tampão fosfato, adicione o medicamento ou veículo em dois mililitros de soro e DMEM livre de glicose. Incube em uma incubadora de cultura de células contendo 5% de CO2 e 95% de ar a 37 graus Celsius por 30 minutos antes da hipóxia.Após 30 minutos, coloque o prato de miócitos cardíacos humanos em um frasco anhipóxico hermético de 2,5 litros. Equipado com um catalisador para eliminar o oxigênio livre e um indicador anaeróbico para medir a tensão de oxigênio no meio. Coloque o frasco na incubadora de cultura de tecidos.A cor do indicador anaeróbico muda de azul claro em ambiente normóxico para branco pálido em condições hipóxicas. Reoxigene os miócitos cardíacos humanos removendo a placa de seis poç

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Medicine

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Saponina permeabilizadas preparação de fibras em conjunto com a análise de fosforilação oxidativa fornece respirométrico de avaliação integrada da função mitocondrial. Respiração mitocondrial em estados fisiológicos e patológicos pode refletir várias influências regulamentares, incluindo as interações mitocondrial, morfologia e bioquímica.

Avaliação fosforilação oxidativa respirométrico em saponina-fibras cardíacas permeabilizadas

Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca...

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

Este vídeo demonstra a marcação de células neuronais com anticorpos para complexos da cadeia respiratória mitocondrial, proteína associada ao DNA mitocondrial e proteína da membrana externa mitocondrial, seguida de citometria de fluxo para quantificar seus níveis.

Medição de Múltiplos Parâmetros Mitocondriais em Neurônios usando Citometria de Fluxo

Aqui descrito é um método para detectar e quantificar as proteínas da membrana exterior mitocondrial por imunomarcação das mitocôndrias isoladas a partir de tecidos de roedores e de análise por citometria de fluxo. Este método pode ser estendido para avaliar os aspectos funcionais de subpopulações mitocondriais.

Imunodetecção de membrana externa proteínas por citometria de fluxo de mitocôndrias isoladas

O objetivo do presente protocolo é ilustrar como usar rato neonatal cardiomyocytes como um sistema modelo para examinar como vários fatores podem alterar o consumo de oxigênio no coração.

Analisando a taxa de consumo de oxigênio em Mouse culto principal Cardiomyocytes Neonatal utilizando um analisador de fluxo extracelular

As bombas do efluxo de xenobiotic são altamente ativas na haste e nas pilhas Hematopoietic do progenitor (hspcs) e causam a extrusão de tmrm, uma tintura fluorescente potencial da membrana mitochondrial. Aqui, nós apresentamos um protocolo para medir exatamente o potencial mitochondrial da membrana nos hspcs por tmrm na presença de Verapamil, um inibidor da bomba do efluxo.

Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

Aqui descrevemos um método confiável para medir a massa mitocondrial e o potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas cultivadas ex vivo e células T.

Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

Os efeitos distintos de diferentes graus de hipotermia na proteção do miocárdio não foram minuciosamente avaliados. O objetivo do presente estudo foi quantificar os níveis de morte celular após diferentes tratamentos de hipotermia em um modelo baseado em cardiomiócito humano, estabelecendo as bases para futuras pesquisas moleculares aprofundadas.

Avaliação in vitro da proteção do miocárdio após hipotermia-pré-condicionamento em um modelo de miócitos cardíacos humanos

Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.

Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Aprenda a medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos cardíacos humanos após hipóxia/reoxigenação usando o ensaio de citometria de fluxo com corante JC-1. Este método avalia efeitos protetores de agentes com baixo consumo de materiais.

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação (Vídeo) | JoVE Journal

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação

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