Um ensaio de Neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima

Este método pode ajudar a responder a perguntas relacionadas ao papel das células precursoras neurais na medicina regenerativa. Especificamente, podemos perguntar como a lesão afeta o comportamento das células precursoras neurais. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma abordagem para estudar o efeito da lesão medular na cinética endógena das células precursoras neurais.

A demonstração visual dessas técnicas é crítica. Como as etapas cirúrgicas e de dissecção exigem precisão e podem ser difíceis de aprender, embora possam ser aperfeiçoadas com a prática. Antes de iniciar o procedimento, use uma máquina de cortar cabelo para remover o pelo do dorso de um camundongo anestesiado do meio das costas até o pescoço e as orelhas.

Depois de prender o mouse em um dispositivo estereotáxico, coloque de quatro a cinco pedaços de gaze enrolada sob o abdômen, enquanto puxa levemente a base da cauda para endireitar o corpo e a coluna. Empurre o rolo de gaze torácica rostralmente do abdômen do camundongo em direção à parte superior do tórax para apoiar a coluna torácica. E use fita adesiva de laboratório para prender a cauda e os membros em uma orientação semelhante a uma estrela.

Após desinfetar a pele exposta com swabs sequenciais de etanol a 70% e iodopovidona, use uma lâmina de bisturi número 10 para fazer uma incisão vertical paralela ao eixo longitudinal do animal, do ponto médio de ambas as omoplatas, até a curvatura da coluna torácica. Retraia a pele para expor o tecido mole e o contorno da coluna vertebral. E identifique a borda inferior da almofada de gordura super escapular.

Em seguida, use o bisturi para cortar com cuidado, mas com força, ambos os lados do T5 a T8 vertebral e nove ossos, para separar os tendões musculares das costas da coluna vertebral. Reposicione os afastadores de modo que os dentes dos afastadores sejam inseridos no local da incisão em ambos os lados da coluna. E expanda cada afastador para ajustar a exposição, até que a coluna esteja suficientemente elevada sem sobrecarregar as camadas musculares retraídas.

Sob um microscópio cirúrgico, limpe cuidadosamente o músculo residual e outros tecidos moles que recobrem a coluna vertebral, para expor o osso vertebral. Apertar o processo espinhoso das vértebras com uma pinça dentada e mover a pinça ligeiramente para cima e para baixo para identificar as vértebras que serão removidas. Em seguida, insira uma ponta de uma tesoura curva embotada em ambos os lados do forame intervertebral exposto, caudal à lâmina vertebral a ser excisada.

E corte as articulações intervertebrais de conexão bilateralmente. Em seguida, levante a lâmina para cima e corte a fixação superior da lâmina para isolar e remover o osso. Ao cortar e remover a lâmina vertebral, tome cuidado para sempre inclinar a tesoura para cima para não danificar a medula espinhal subjacente.

Com as veias da linha média dorsal servindo como ponto de referência, insira a haste dobrada de 45 graus de uma ponta de agulha de calibre 30, com o lado chanfrado para cima, um milímetro de profundidade na superfície lateral dorsal da medula espinhal. E aproximadamente 0,5 milímetros laterais a cada lado da linha média. Mova a agulha cerca de dois milímetros da direção caudal para rostral, de modo que todo o comprimento do chanfro seja inserido no cordão.

Em seguida, refaça o caminho da entrada para remover a agulha. Para fechar a ferida, remova o afastador e use uma sutura absorvível 6-0 para unir os músculos das costas em ambos os lados da lesão ao longo da linha média. E uma sutura de seda 4-0 para fechar a pele sobrejacente.

Para isolar as neuroesferas, faça uma incisão na linha média na pele ao longo de todo o comprimento das costas para expor o contorno muscular e ósseo vertebral. Levante o aspecto medial de cada escápula e use uma tesoura para cortar o tecido mole entre a escápula e as vértebras. Quando a coluna vertebral subjacente tiver sido exposta, insira a tesoura na abertura torácica superior, seguindo a curvatura da coluna vertebral, e corte as costelas, músculos e órgãos internos anexados para isolar a coluna vertebral.

Insira a tesoura no forame vertebral caudal e corte as articulações intervertebrais de ambos os lados das lâminas, tomando cuidado para não danificar o cordão intacto. Quando o comprimento apropriado do cordão for exposto, corte cuidadosamente todos os nervos espinhais que se estendem lateralmente do cordão, antes de transferir o tecido da medula espinhal para uma placa de Petri de líquido cefalorraquidiano artificial regular no gelo. Sob um microscópio de dissecação, corte o tecido da medula espinhal para incluir cerca de dois milímetros de tecido rostral e caudal até o local da lesão e use dois pares de pinças finas para separar suavemente a medula em duas metades longitudinais, ao longo das fissuras dorsal e ventral.

Use a micro tesoura para cortar a substância branca lateral dorsal lesionada. E coloque o tecido lesionado em um tubo cônico de 15 mililitros. Segurando metade da medula espinhal com a pinça, provoque e remova a substância branca não lesionada com dois pares de pinças ao longo da extensão caudal rostral da medula espinhal, para isolar a região periventricular apropriada.

Depois de isolar a substância branca lesada e as regiões periventriculares associadas da outra metade da medula espinhal da mesma maneira, coloque os pedaços de tecido periventricular em tubos cônicos individuais de 15 mililitros. E use a microtesoura para picar suavemente o tecido contra as paredes dos tubos. Uma vez que o procedimento de digestão do tecido tenha sido concluído e a suspensão de célula única tenha sido obtida, configure uma cultura de neuroesfera adicionando 10 mililitros do meio apropriado em um frasco de cultura de tecido de 25 mililitros por condição celular.

E adicione as células-tronco neurais isoladas até uma densidade clonal de 10 células por microlitro para sua cultura em uma incubadora de cultura de células. Após 24 horas, agite suavemente os frascos e decanta o conteúdo em tubos cônicos individuais de 15 mililitros para centrifugação. Ressuspenda os pellets em um a dois mililitros de meio neural basal fresco para contagem.

E coloque as células em densidade clonal em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços por condição, contendo 500 microlitros do meio suplementado com mitógeno correspondente apropriado por poço. Em seguida, cultive as neuroesferas na incubadora de cultura de células por sete dias. Cinco dias após a lesão medular mínima, o número absoluto de neuroesferas derivadas de células-tronco neurais definitivas é maior do que o número de neuroesferas derivadas de células-tronco neurais primitivas.

As neuroesferas definitivas exibem um diâmetro maior e um grande centro escuro. Enquanto as neuroesferas primitivas são menores em tamanho e mais compactadas. A lesão medular mínima induz um aumento significativo nas neuroesferas cultivadas a partir do canal central no nível da lesão, em comparação com um aumento relativamente modesto no canal central, rostral ao nível da lesão.

Neuroesferas definitivas também podem ser geradas a partir da substância branca lesionada no nível da lesão. Uma região que não contém células formadoras de neuroesferas em animais apenas laminectomy. Um aumento semelhante nas células-tronco neurais primitivas é observado após a lesão, com exceção das neuroesferas primitivas na substância branca no nível do local da lesão.

Uma vez dominada, a técnica cirúrgica pode ser realizada em menos de 40 minutos. E a dissecção e o isolamento do tecido podem ser realizados em menos de 30 minutos, se realizados corretamente. Após o procedimento cirúrgico, dependendo da cepa do animal, metodologias adicionais, como imuno-histoquímica e choque linear, podem ser usadas para responder a perguntas adicionais, como cinética de proliferação e autodestino das células precursoras neurais após a lesão.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como utilizar o ensaio da neuroesfera para avaliar a ativação de células-tronco neurais, após lesão na medula espinhal.