Name: Um ensaio de Neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprenda a usar o ensaio de neuroesfera para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógenas após lesão medular mínima em ratos. Este método permite quantificar a migração e ativação das NSCs para estudos de neuroregeneração.

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Este trabalho é financiado pela Fundação Krembil (subvenção de funcionamento CMM). WX foi o destinatário do prêmio estudante Carlton Marguerite Smith. NL recebeu uma bolsa de pós-graduação de Ontário.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de cuidado Animal da Universidade de Toronto e está em conformidade com o "guia para o cuidado e uso de animais experimentais" (2nd Edition, conselho canadense no cuidado Animal, 2017).
1. cirurgia de lesão medular mínima
Nota: Antes da cirurgia certifique-se de que todos os materiais e instrumentos cirúrgicos são esterilizados por métodos apropriados (figura 1A).
<ol><li>Construa um arco de apoio torácico, acumulando 4 – 5 quadrados de gaze e gravando-os juntos no meio para obter um rolo fixo de gaze.</li>
	<li>Posicione o mouse na câmara de indução e iniciar a anestesia com isoflurano 5%. Confirme a ausência de um reflexo de pitada de dedo do pé antes de prosseguir, bem como ao longo do processo. Como a cirurgia pode demorar mais de 30 min para completar, otimize para a exposição mínima de isoflurano (5 min a 5%) e o tempo restante de 2 – 3%.</li>
	<li>Transferi o mouse para um cone de nariz ligado à máquina anestésica em dose de manutenção de isoflurano de 2 – 3%. Use a máquina de cortar cabelo para remover a pele do dorso do animal do meio da costas até as pescoço/orelhas para expor uma área retangular ampla da pele para a cirurgia.</li>
	<li>Transferi o mouse para um instrumento estereotáxica colocando seu nariz do cone de nariz anexada e estabilizando o crânio com barras de orelha. Manter o isoflurano em 5% durante a colocação das barras de orelha e inferior para 2-3%, quando o mouse é segura no dispositivo estereotáxica.</li>
	<li>Administrar medicações analgésicas pré-operatório intraperitonealmente — Meloxicam (2,0 mg/kg). Aplica generosamente lubrificação do olho para os olhos de rato aberto para evitar a dessecação da córnea quando sob anestesia.</li>
	<li>Coloque o arco de apoio torácica debaixo do abdômen do mouse enquanto endireitar o corpo do rato e espinha puxando levemente a base da cauda. Use fita de etiquetagem de laboratório para proteger a cauda e pernas estendidas todos em uma posição de estrela, como. Uma vez seguro, empurre o arco de apoio torácica rostral, do abdome para o tórax superior do mouse — para sustentar a coluna torácica (figura 1B).</li>
	<li>Prepare um campo cirúrgico estéril, desinfecção a superfície de pele pele-recortado preparada na etapa 1.3 com etanol a 70%, seguida de iodo-povidona. Repita duas vezes. Aplica um pano cirúrgico estéril para manter um campo largo esterilizado.</li>
	<li>Usando uma lâmina de bisturi de #10, faça uma incisão vertical paralelo ao eixo longitudinal do animal do ponto médio de ambas as lâminas do ombro para a curvatura da coluna torácica. Retrai a pele para expor o tecido mole e o contorno da coluna vertebral (Figura 1).</li>
	<li>Identifica a borda inferior da almofada gorda supraescapular (isto demarca o nível vertebral T4/5). Com a mesma lâmina #10, com cuidado, mas com força, corte ao longo de ambos os lados do osso T5-T8/9 para desanexar os tendões de costas-musculares da coluna vertebral.</li>
	<li>Introduza os dentes de afastadores os locais de incisão de cada lado da coluna vertebral. Ajuste a exposição expandindo retractores para elevar suficientemente a espinha sem colocar demasiada pressão sobre as camadas de músculo retraído (Figura 1).</li>
	<li>Sob o microscópio cirúrgico, limpe cuidadosamente o residual músculo e outros tecidos moles sobrejacentes a espinha para expor o osso vertebral (Figura 1E). Identifica as vértebras que serão removidas por apertando o processo espinhoso das vértebras com fórceps dentado e movê-lo ligeiramente até e para baixo. Nota: Isto deve permitir a identificação das articulações intervertebrais e expor as pequenas aberturas (Forame intervertebral) por baixo das vértebras de interesse.</li>
	<li>Inserir uma cabeça da tesoura curva cega em ambos os lados do Forame intervertebral exposto, caudal para a lâmina vertebral para ser extirpado e cortar as ligação articulações intervertebrais bilateralmente.</li>
	<li>Levantar a lâmina para cima e corte a fixação superior da lâmina para isolar e remover o osso. Nota: Isto irá expor o saco dural intacto que contém a medula espinhal (Figura 1F). Pode haver excessivo sangramento que pode ser controlado, colocando pré-cortados gaze de 1 x 1 cm para as áreas afetadas e/ou lavagem com PBS estéril.</li>
	<li>Com a veia de linha média dorsal, servindo como um marco, insira uma haste de 45° dobrados de uma ponta de agulha 30G (com agulha bisel voltado para cima) na superfície dorsolateral da medula espinhal (aproximadamente 1 mm de profundidade) em aproximadamente lateral de 0,5 mm para cada lado da linha média.</li>
	<li>Mova a agulha ~ 2 mm de caudal para rostral (paralelo à linha média) para que toda a extensão do bisel da agulha é inserida no cordão. Remova a agulha, refazendo via o caminho de entrada (Figura 1). Nota: Não deve haver nenhum sangramento mas inchaço do tecido espinhal pode ser visto neste passo.</li>
	<li>Para fechar o ferimento, remover o retractor e suturar os músculos das costas em ambos os lados da lesão junto na linha média usando uma sutura de 6-0. Use uma sutura de seda 4-0 estéril para posteriormente fechar a pele sobrejacente.</li>
	<li>Aplique pomada antibiótica para o topo da pele para prevenir infecção pós-operatória, usando a ponta de um cotonete de algodão suturado superficial. Administre analgésicos no pós-operatório de 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea, juntamente com fluidos (1 mL de solução de Ringer lactato).</li>
	<li>Desligue o isoflurano vaporizador e oxigênio. Remova o mouse o local em uma gaiola limpa com nenhum fundamento e dispositivo estereotáxica.</li>
	<li>Coloque o rato na gaiola cerca de 30 cm de uma lâmpada de calor para a recuperação da anestesia e monitor comportamento após acordar. O rato deve acordar dentro de 5 a 10 min e têm a função de membro posterior com possível paresia e/ou fraqueza de cauda ao acordar.</li>
	<li>Monitorar o comportamento do mouse ao longo dos próximos dias e fornecer cuidados pós-operatórios adequados e analgésicos (i.e., mash, lactato de solução fluido subcutâneo, 0,1 mg/kg a buprenorfina Ringer 2 x diariamente por via subcutânea para 2-3 dias e peso adequado acompanhamento ) em conformidade aos regulamentos de instalações de animais locais e a nível individual como recuperação podem variar.</li>
</ol>2. Neurosphere do ensaio dissecação
Nota: Siga os procedimentos de cultura de tecido estéril adequada em todo.
<ol><li>Preparação da solução enzimática
	<ol>
<li>Adicione 32 mL de Earle está equilibrado sal solução (EBSS) à albumina ovomucoid inibidor contendo o frasco de vidro e suavemente vórtice até dissolver.</li>
		<li>Adicionar 5 mL de EBSS para um frasco de vidro previamente repartidas papaína e coloque em banho-maria 37 ° C para dissolver. A solução se tornará claro (solução 1).</li>
		<li>Tomar 500 µ l de EBSS e adicionar para o pre-repartida DNase que eu vidro frasco para obter uma concentração de 1 mg/mL (solução 2). Misture-os muito delicadamente inclinando-se o frasco e para trás e adicionar 250 µ l desta mistura a solução 1. Nota: Todas as soluções feitas (solução 1 e 2) são suficientes para processamento de duas peças de tecido. Se o processamento mais peças de tecido, acomodar com mais preparação da solução.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecação e preparação do tecido
	<ol>
<li>Lugar uma limpeza de laboratório embebido em isoflurano na gaiola do rato e permitir que 2-3 min para vapores anestesiar completamente do mouse. Eliminatória seguinte, remover o rato da gaiola e confirmar a ausência de um dedo do pé-pitada reflexo.</li>
		<li>Execute o deslocamento cervical com um objeto pontiagudo de metal(ou seja, cartão de gaiola de metal) para abater o animal. Pulverize o animal euthanized meados de volta de seu pescoço generosamente com etanol a 70%.</li>
		<li>Na base do crânio, use uma tesoura para cortar a cabeça e descartar em um saco de bio. Fazer uma incisão na pele ao longo de todo o comprimento da parte traseira para expor o músculo e contorno ósseo vertebral (Figura 2A).</li>
		<li>Levantar o aspecto medial de cada escápula (IE., omoplata — identificado por sobrejacente do tecido) e usar tesouras para cortar tecidos moles (entre a escápula e vértebras). Separado inteiramente para expor a coluna vertebral subjacente.</li>
		<li>Seguindo a curvatura da coluna vertebral, insira o mesmo par de tesouras da abertura torácica superior e isolar a coluna vertebral, cortando-se anexada costelas, músculos e órgãos internos (Figura 2B).</li>
		<li>Insira uma tesoura no caudal forame vertebral/abertura e corte as articulações intervertebrais em ambos os lados das lâminas (superfície dorsal). Tome especial cuidado para não danificar o cabo intacto. Continue esse processo até o nível desejado e/ou o comprimento do fio é exposto.</li>
		<li>Corte com cuidado a spinal nerve(s) estendendo-se lateralmente da medula antes de transferir o tecido da medula espinhal em uma placa de Petri com fluido cerebrospinal artificial regular. Manter a amostra em gelo (Figura 2).</li>
		<li>Sob um microscópio de dissecação, corte o tecido da medula espinhal para incluir ~ 2 mm rostral e caudal para o local da lesão. Usar dois pares de pinças para separar com cuidado o cabo em 2 metades longitudinalmente ao longo das fissuras dorsais e ventrais (Figura 2').</li>
		<li>Com micro-tesouras, corte matéria branca dorsolateral ferida. Coloque a peça em um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Segurando uma metade da medula espinhal para baixo com fórceps, provocar e remover matéria branca usando um outro par de pinças bem ao longo da extensão rostrocaudal da medula espinhal para isolar a região periventricular desejado. Repita para a outra metade da medula espinhal.</li>
		<li>Coloque pedaços de tecido periventricular em um tubos cónicos 15ml separado. Use micro-tesouras e picar delicadamente o tecido contra as paredes dos tubos cónicos. Nota: As modificações de dissociação de tecido são de papaína dissociação sistema protocolo23 e de procedimentos de preparação de tecido descrito anteriormente24.</li>
		<li>Adicionar 2,5 mL de nova solução 1 (passo 2.1.3) a amostra de tecido e coloque sobre um roqueiro a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Triture levemente o tecido na solução com uma ponta de pipeta de 1.000 µ l. Centrifugar a suspensão de célula nublado x g durante 5 min à RT</li>
		<li>Preparar a solução 3 com 2,7 mL de equilibrada solução Earle está de sal, 300 µ l de solução de inibidor ovomucoid (etapa 2.1.1) e 150 µ l do DNase eu solução (etapa 2.1.3).</li>
		<li>Descartar o sobrenadante da etapa (etapa 2.2.13) e ressuspender em 1,5 mL de solução 3 da etapa anterior (etapa 2.2.14).</li>
		<li>Esta nova suspensão de célula (etapa 2.2.15) em cima de 5 mL de solução de inibidor de ovoimucoid (etapa 2.1.1) em um novo tubo cônico de 15 mL para criar um gradiente descontínuo de densidade da camada. Centrifugar x g por 5 min à RT.</li>
		<li>Descartar o sobrenadante e ressuspender em 2 mL de mídia neurobasal. Centrifugar x g por 3 min em RT.</li>
		<li>Descartar o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de mídia neurobasal. Filtre a suspensão usando um coador de célula 20 µm seguido de 4 mL de mídia para um volume total de 5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Chapeamento
	<ol>
<li>Preparar meios de cultura para o crescimento de neurosphere, completando neurobasal mídia com fator de crescimento epidérmico (20 ng/mL) / fator de crescimento fibroblástico (20 ng/mL) / heparina (2 µ g/mL) [para NSCs definitivos] ou leukemina fator inibitório (10 ng/mL) [para NSCs primitivos]. Adicione 10 mL de qualquer mídia para um balão de cultura de tecidos de 25 mL.</li>
		<li>Use um hemocytometer e corante Trypan azul para calcular o número de células em suspensão (etapa 2.2.18)25. Uma vez calculado, adicionar células para frascos de cultura de tecidos preparados (etapa 2.3.1) para uma densidade clonal de 10 células / µ l e lugar frasco de cultura de tecidos com células adicionados em incubadora para 24 h (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO2). Nota: Um exemplo da técnica da contagem é a seguinte: Tome 10 µ l de suspensão de células e misture com 10 µ l de corante azul de Tripan. Adicione 10 µ l desta mistura em um hemocytometer. Sob um microscópio óptico de 10x, contar o número de células vivas e soma todas as células contadas dentro 4 dos 4 x 4 quadrantes. Use a fórmula: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] para dar o volume da suspensão de células para ser banhado em cada frasco de cultura de tecidos de 25 mL para garantir densidade clonal (10 células / µ l).</li>
		<li>Após 24h, suavemente agite o frasco e despeje o conteúdo em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar x g por 5 min à RT.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 a 2 mL de mídia neurobasal fresco.</li>
		<li>Repita a etapa 2.3.2 para contar o número de células em suspensão e placa células em densidade clonal em uma placa de cultura de tecido de 24-poço contendo 500 µ l cada de seus meios respectivos mitógeno complementado (EFH para crescimento de NSC definitivo) e LIF para crescimento de NSC primitivo. Nota: Usar a fórmula adaptada (5.000 / [X células/4) x 2 x 10 x 1.000) para calcular o volume de suspensão de célula para ser banhado em cada bem contendo 500 µ l de mídia.</li>
		<li>Coloque placas contendo células na incubadora (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO2) para crescer por 7 dias.</li>
	</ol></li>
	<li>Contando
	<ol>
<li>Após 7 dias em cultura, remover placas e ver os sob um microscópio de luz. Quantificar neurospheres pela contagem de colônias esféricas que são > 80 µm de diâmetro para culturas dNSCs e > 50 µm de diâmetro para culturas de pNSCs. Nota: Se desejar, neurospheres pode ser ainda mais passadas26 ou diferenciadas. Se as células não são mais necessários, elimine adicionando peróxido de hidrogênio acelerado aos poços (cerca de 1 mL) por 20 min para que a cor do meio fica amarela. Em seguida, descarte.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconditioning+with+isoflurane+produces+dose-dependent+neuroprotection+via+activation+of+adenosine+triphosphate-regulated+potassium+channels+after+focal+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats.</a> Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).</li>
<li>Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+testing+of+motor+function+in+spinal+cord+injured+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats.</a> Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).</li>
<li>Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CatWalk-assisted+gait+analysis+in+the+assessment+of+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Durante o procedimento cirúrgico, existem alguns passos críticos onde o pesquisador deve prestar particular atenção a fim de obter resultados óptimos e minimizar a variabilidade entre os animais. Deve ter cuidado com a anestesia inalada (isoflurano) durante a cirurgia como anestésico foi mostrado para ter efeitos neuroprotective com exposição prolongada27. Nesse sentido, ao estudar a capacidade regenerativa da medula espinhal após lesão, fazer um esforço para realizar a cirurgia, mais rapidamente ...

O sistema nervoso central contém uma subpopulação de células-tronco multipotentes, auto renovadora que têm a capacidade de dar origem a todas as células nervosas maduro diferentes tipos1,2,3,4. Essas células-tronco neurais (NSCs) residem em nichos especializados do cérebro e da medula espinhal e pode ser ativadas após lesão para proliferar, migrar e se diferenciar em células maduras neurais. NSCs e seus descendentes foram mostrados para migrar para o local da lesão, em lesão cortical modelos5,6. No cérebro, NSCs foram mostrados para migrar dos ventrículos laterais para o local da lesão, onde eles se diferenciar em astrócitos que contribuem para a formação de cicatriz glial7. Na medula espinhal, no entanto, poucos estudos foram feitos para perguntar se esses mesmos NSCs endógenos podem ser aproveitados para promover a recuperação após a lesão da medula espinhal. De fato, atualmente há um debate sobre se a ativação da pilha de haste piscina na medula espinhal exige um dano físico direto do nicho periventriculares revestem o canal central8 ou se os danos para a coluna vertebral cabo parênquima (deixando o tronco nicho de célula intacto) é suficiente para ativar endógena NSCs9.
Um número de modelos de lesão (SCI) da medula espinhal têm sido utilizado para estudar a fisiopatologia da lesão aguda e crônica. Estes modelos também tem sido usados para testar potenciais terapias para tratar SCI através de neuroproteção, imunomodulação e desenvolvimento celular transplante/substituição estratégias10,11,13. Modelos atuais incluem compressão e/ou contusão lesões, que causam déficits funcionais em grande escala, bem como lesões extensas e cavitações no cabo14,15. Cicatrizes gliais resultantes podem abranger diversos segmentos da coluna vertebral juntamente com a maioria de largura/circunferência do16da medula espinhal. Assim, enquanto estes modelos são clinicamente relevantes, arranjaram um desafio significativo para estudar a resposta de NSCs endógenas após lesão. Existem modelos de químicos da lesão que pode ser adaptado para causar formas mais leves de lesão que pode poupar o canal central17. No entanto, esses tipos de lesão focar a desmielinização associada com SCI e não são modelos clinicamente relevantes para o dano físico e/ou mecânico associado com Sci traumático.
Para lidar com as limitações dos modelos de lesão atual, nós adaptamos um agulha faixa mínima SCI modelo, originalmente desenvolvido no rato9, para a aplicação em um modelo do rato adulto. Nosso modelo de lesão adaptado pode criar uma lesão consistente na região dorsolateral da medula espinhal do mouse e poupar o canal central para o nível da lesão. A vantagem desse modelo é que ele permite o estudo da cinética de NSC após lesão e sua potencial migração radial para o local da lesão. O uso de um modelo de mouse também permite o uso de ratos transgénicos que permitem o monitoramento de linhagem de NSCs endógenos e seus descendentes após lesão. As propriedades do NSCs mais podem ser avaliadas usando uma forma modificada do ensaio em vitro neurosphere que é introduzida no presente protocolo.
O ensaio de neurosphere é um em vitro formadoras ensaio que permite o isolamento de NSCs na presença de mitógenos. Em densidades de chapeamento clonal, NSCs individuais proliferam para dar origem a colônias esféricas flutuantes de células que são compostas por uma pequena subpopulação de NSCs e uma grande maioria dos progenitores18,19. Em nosso protocolo, demonstramos o isolamento de duas distintas, relacionadas a lineally NSCs da região periventricular da medula espinhal — sob condições de linha de base e seguir nosso modelo SCI mínimo. Definitiva neural da haste nestin expressa de células (dNSCs) e a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e são cultivados na presença de fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF) e heparina (juntos denominada EFH)20. Estes dNSCs são raros na medula espinhal ingênuo, dando origem a muito poucas neurospheres em vitro. No entanto, mostramos que os dNSCs são ativados mínimo SCI, expandindo os números dos neurospheres isolada da região periventricular21a seguir. Células-tronco neurais primitivas (pNSCs) estão a montante do dNSCs na linhagem de células-tronco neurais. pNSCs são excessivamente raros, expressos níveis baixos do marcador pluripotência Oct4 e leucemia responsivo de fator inibitório (LiF)22. pNSCs não formam neurospheres quando isoladas de rato adulto medula espinhal devido à presença de proteína básica de mielina (MBP) em culturas primárias; no entanto, pNSC neurospheres pode ser isolado de ratos deficientes de MBP e seus números são lesões seguintes expandida — semelhantes a dNSCs21. Finalmente, mostramos que neurospheres dNSC-derivado pode ser isolado do local da lesão em cedo vezes seguindo mínimo Sci. Estes resultados demonstram que o nosso modelo de lesão e ensaios podem avaliar as características de ativação de periventriculares NSCs tais como sua capacidade de proliferar e migrar em resposta a lesões.

<table><tbody><tr><td>Retrátil Agricola</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Moria Vannas-Wolff (Curvada)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15370-50</td><td>Personalize ao encomendar para obter pontas embotadas</td></tr><tr><td>Pinça Graefe (Reta, 1 x 2 Dentes)</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Graefe Extra Fina (Curvada, Serrilhada)</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>11152-10</td><td>Ou qualquer outra pinça para sutura</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats (Straight)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td><td>Ou qualquer outra apropriada para sutura</td></tr><tr><td>Bisturi Handle #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Ou qualquer outra</td></tr><tr><td>máquina de cortar cabelo</td> apropriada <td>amazon.ca</td><td>https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA</td><td>ou qualquer outra</td></tr><tr><td>máquina de cortar cabelo apropriada instrumento</td><td>Stoeling</td><td>51500</td><td>ou qualquer outra</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td></td> apropriada <td>ou qualquer apropriado sancionado pela minha instalação de cuidados com animais</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td></td><td></td><td>ou qualquer sancionado apropriado pela instalação de cuidados com animais</td></tr><tr><td>Tears Naturale PM</td><td>Alcon</td><td>https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE</td><td>ou qualquer outro</td></tr><tr><td>Isoflurano</td> apropriado <td>Baxter International Inc</td><td>DIN 02225875</td><td>ou qualquer outro apropriado para anestesia</td></tr><tr><td>Q-tips Cottom Swabs</td><td>amazon.ca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaze de Algodão</td> https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS <td>Fisher Scientific</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>30 G Agulhas</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td>Para Lesões</td></tr><tr><td>25 G Agulhas</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>Para Injeções de Drogas</td></tr><tr><td>Seringas de 1 mL</td><td>3090659 Becton Dickinson</td><td></td><td>para injeções de drogas</td></tr><tr><td>Seringas de 3 mL</td><td>309657</td><td>Becton Dickinson</td><td>para injeções de fluidos</td></tr><tr><td>4-0 uoftmedstore.com de sutura</td><td></td><td>2297-VS881</td><td>para sutura da pele</td></tr><tr><td>6-0 uoftmedstore.com de sutura</td><td></td><td>VS889</td><td>para sutura muscular</td></tr><tr><td>Pomada de polisporina</td><td>amazon.ca</td><td>102051</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 mL</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Qualquer</td></tr><tr><td>placa de Petri</td> apropriada <td>ThermoFisher</td><td></td><td>qualquer</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>apropriado Qualquer</td></tr><tr><td>hemocitômetro</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Qualquer</td></tr><tr><td>centrífuga</td> <td>apropriadaThermoFisher</td><td></td><td>Qualquer</td></tr><tr><td>apropriado Ferramentas de Dissecção Padrão</td><td>Ferramentas de Ciências</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finas Microscópio de Dissecção</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Contagem</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Neural Basal-A Médio</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17404-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Invitrogen</td><td>12700075</td><td></td></tr><tr><td>30% Glicose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td>1 M, 9,01 g em 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>1 M Glicose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7,5% NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>155 mM, 1,30 g em 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>155 mM NaHCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>23,83 g em 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>Apo-Transferrina</td><td>R& D Systems</td><td>3188-AT</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7505</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Selênio</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Dissociação de Papaína&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>PDS</td><td>1 frasco de papaína pode ser usado para 2 amostras</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epidérmico</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td>Pó reconstituído com 1mL de Mistura Hormonal e aliquotado em frascos de 20uL para ser armazenado no freezer</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento de Fibroblastos</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0226</td><td>Pó reconstituído com 0,5 mL de Mistura Hormonal e aliquotado em 20 &mu; Frascos L para serem armazenados no freezer</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Fator Inibidor de Leucemia</td><td>em Casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azul</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Tripano 24 Placas de poços</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>11,69 g em 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>1 M KCL</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>7,46 g em 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>20,33 g em 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>108 mM CaCl2</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C7902</td><td>1,59 g em 100 mL dH2O</td></tr></tbody></table>

um ensaio de neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Células-tronco neurais (NSCs) na medula espinhal dos mamíferos adulta são uma população relativamente mitotically quiescente de periventriculares células que podem ser estudados em vitro usando o ensaio de neurosphere. Este ensaio formadoras é uma poderosa ferramenta para estudar a resposta de NSCs para fatores exógenos em um prato; no entanto, isto também pode ser usado para estudar o efeito de manipulações na vivo com a compreensão apropriada dos pontos fortes e limitações do ensaio. Uma manipulação do interesse clínico é o efeito da lesão na ativação endógena do NSC. Modelos atuais de lesão da medula espinhal fornecem um desafio para estudar isto como a gravidade dos modelos comuns de contusão, compressão e transecção causar a destruição do nicho NSC no local da lesão onde residem as células-tronco. Aqui, descrevemos um modelo de lesão mínima que causa danos localizados na superfície dorsolateral superficial do piso inferior torácica (T7/8) da medula espinhal rato adulto. Este modelo de lesão poupa o canal central ao nível da lesão e permite a análise de NSCs que residem no nível da lesão em vários pontos de tempo após lesão. Aqui, nós mostramos como o ensaio de neurosphere pode ser utilizado para estudar a ativação de duas populações distintas, relacionadas com lineally, de NSCs que residem na região periventricular da medula espinhal - NSCs primitivos e definitivos (pNSCs e dNSCs, respectivamente). Demonstramos como isolar e cultura estes NSCs da região ao nível da lesão e o local da lesão de substância branca periventricular. Nossas dissecações pós-cirúrgica da medula espinhal mostram aumento do número de pNSC e neurospheres dNSC-derivado da região periventricular das cordas feridas comparados aos controles, falando de sua ativação através de lesão. Além disso, após lesão, neurospheres dNSC-derivado pode ser isolado do local da lesão — demonstrando a capacidade de NSCs para migrar do seu nicho periventricular para locais de ferimento.

Após a cirurgia, os ratos devem experiência mínimos déficits motor, que podem incluir a cauda e possível paresia do membro posterior para até 24 h. Após este tempo, os ratos não devem experimentar nenhuma paralisia do membro posterior e/ou paresia e alterações mínimas na marcha.
A Figura 3 mostra resultados representativos de ensaio de neurosphere 5 dias após a lesão mínima da medula espinhal. Os nú...

Aqui, vamos demonstrar o desempenho de um modelo de lesão medular mínima em um rato adulto que poupa o nicho central canal habitação endógena células tronco neurais (NSCs). Mostramos como o ensaio de neurosphere pode ser usado para quantificar a ativação e migração de NSCs definitivos e primitivos, após lesão.

Um ensaio de Neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas relacionadas ao papel das células precursoras neurais na medicina regenerativa. Especificamente, podemos perguntar como a lesão afeta o comportamento das células precursoras neurais. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma abordagem para estudar o efeito da lesão medular na cinética endógena das células precursoras neurais.A demonstração visual dessas técnicas é crítica. Como as etapas cirúrgicas e de dissecção exigem precisão e podem ser difíceis de aprender, embora possam ser aperfeiçoadas com a prática. Antes de iniciar o procedimento, use uma máquina de cortar cabelo para remover o pelo do dorso de um camundongo anestesiado do meio das costas até o pescoço e as orelhas.Depois de prender o mouse em um dispositivo estereotáxico, coloque de quatro a cinco pedaços de gaze enrolada sob o abdômen, enquanto puxa levemente a base da cauda para endireitar o corpo e a coluna. Empurre o rolo de gaze torácica rostralmente do abdômen do camundongo em direção à parte superior do tórax para apoiar a coluna torácica. E use fita adesiva de laboratório para prender a cauda e os membros em uma orientação semelhante a uma estrela.Apó

a-neurosphere-assay-to-evaluate-endogenous-neural-stem-cell

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Neurociência

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Aprenda a usar o ensaio de neuroesfera para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógenas após lesão medular mínima em ratos. Este método permite quantificar a migração e ativação das NSCs para estudos de neuroregeneração.

Um ensaio de Neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima (Vídeo) | JoVE Journal

Um ensaio de Neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima

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