Name: Imagem de Ca2 + respostas durante Shigella infecção das células epiteliais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a visualizar respostas de cálcio em células HeLa infectadas por Shigella usando microscopia de fluorescência com sondas químicas. Este método permite analisar sinais locais e globais de Ca²⁺ durante a infecção bacteriana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jenny Lee Thomassin Agradecemos a ajuda em editar o manuscrito. O trabalho foi apoiado pela ANR concede MITOPATHO e PATHIMMUN, concede do Labex Memolife e PSL IDEX Shigaforce. Cristina Sun é um destinatário de uma bolsa de doutorado do Conselho da bolsa de China. Laurent Combettes e Guy Tran Van Nhieu são destinatários de uma troca de WBI-França Tournesol programa N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'Enseignement supérieur et des de cadre de la Recherche dans le parcerias Hubert Curien).

1. preparações
<ol><li>
Preparação de bactérias
	<ol>
<li>As bactérias da placa — estirpe do selvagem-tipoShigella expressando a adesina umFAE (M90T-umFAE) — para um trypticase agar soja (TCS) placa contendo 0,01% de vermelho de Congo (CR) e incube-os por 18 h a 37 ° C. Nota: Para aumentar a sua reprodutibilidade, as placas de Shigella obtidas na etapa 1.1.1 são armazenadas a 4 ° C e devem ser usadas dentro de uma semana, porque todas as colônias em meio de CR eventualmente girará o vermelhas ao longo do tempo.</li>
		<li>Inocule TCS caldo de pré-cultura escolhendo 3 colônias vermelhas das placas raia. Nota: Uma inoculação com 3 colônias é realizada para limitar a probabilidade de escolher um único clone plasmídeo cuja virulência sofreu uma recombinação genética.</li>
		<li>Cultivar culturas bacterianas líquidas numa incubadora tremendo para 16 h a 37 ° C a 200 rpm. Adicione ampicilina em uma concentração final de 75 mg/mL. Concentrações de antibiótico não devem exceder 3 x a concentração inibitória mínima, como um excesso de antibiótico pode levar à perda do plasmídeo grande virulência. Nota: A manutenção do plasmídeo de virulência a Shigella deve ser verificada pelo chapeamento as culturas bacterianas em placas CR suplementadas com concentrações de antibiótico adequadas. A presença de colônias brancas indica perda do plasmídeo.</li>
		<li>Inocule a cultura TCS com a cultura bacteriana prévia a uma diluição de 1: 100. -Incube a 37 ° C numa incubadora de agitação por 2 h a 200 rpm. Certifique-se de que a densidade óptica em 600 nm (OD600nm) é de 0,2 - 0,4.</li>
		<li>Centrifugar a cultura bacteriana por 2 min a 13.000 x g a 21 ° C e resuspenda o pellet em uma quantidade equivalente de médio EM (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, glicose de 5 mM e 25mm HEPES pH = 7.3).</li>
		<li>Diluir a suspensão bacteriana em um buffer EM um final de OD600nm de 0.1 e usá-lo imediatamente ou armazená-lo a 21 ° C e usá-lo dentro o próximo 60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da pilha
	<ol>
<li>Cultura de células de HeLa em DMEM com 1 g/L de glicose suplementado com 10% de soro fetal bezerro (FCS) e cultivá-las a 37 ° C, com 10% de CO2. Cresce TC-7 cultivadas em DMEM com 4,5 g/L de glicose, contendo 10% FCS e não aminoácidos essenciais em uma incubadora de 37 ° C contendo 10% de CO2.</li>
		<li>Para a manutenção da célula, dividir as células regularmente para evitar uma inibição de crescimento-contato ligada aos Estados confluentes; Isto é crítico para uma Ca2 + sonda carregamento/transfeccao eficiência elevada.</li>
		<li>Placa de células HeLa no estéril de 25 mm de diâmetro circular lamelas em placas de 6-poços em uma densidade de 3 x 105 células/poço no dia anterior a experiência para as células HeLa.</li>
		<li>Para células de TC-7, trypsinize e contar as células. Semente-los em 4 x 105 células/poço e incube-os 5-7 dias a 37 ° C em um 10% CO2-incubadora antes os experimentos para permitir uma polarização.<ol>
<li>Atualize o meio de cultura celular todos os dias até o dia do experimento. Nota: Câmaras descartáveis de 35 mm de diâmetro inferior de vidro também podem ser usadas como uma alternativa aos poços contendo lamelas. Se os últimos são utilizados, controle de temperatura através de um estágio aquecido ou objetivo não é suficiente, e uma câmara de incubação termostato montado sobre o palco do microscópio é necessário.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia do experimento, remover o meio e lavar as células 3 x com média de 1 mL EM 21 ° c.</li>
	<li>Carregar as pilhas com 3 mM de Fluo-4h14 em um buffer EM por 30 min a 21 ° C. Nota: Quando o carregamento de sub confluentes células HeLa não levanta grandes problemas, o carregamento de células polarizadas TC-7 é frequentemente heterogêneo e pouco eficiente. Para essas células, nós encontramos que a eficiência de carregamento é realçada pela adição do agente de dispersão — ácido pluronic — em uma concentração final de 0,1% e o ânion-transporte bromosulfophtalein de inibidor em uma concentração final de 20 µM para o EM fluo-4-AM-contendo. O uso de químico ratiometric sondas ou geneticamente codificado-FRET sondas que requerem dual-aquisição não é compatível com a velocidade de aquisição, necessária para o tratamento de imagens de locais Ca2 + respostas.</li>
	<li>Lavar as amostras 3 x com EM buffer e incube-os ainda mais em 1 mL de tampão na 21 ° C, para permitir que a hidrólise da fracção AM. Usar Fluo-4 carregado células imediatamente ou dentro do próximo 90 min (mantida a 21 ° C).</li>
</ol>2. infecção e aquisição de imagens de locais de Ca2 + respostas
<ol><li>Coloca a lamela contendo as células de Fluo-4 carregado em uma imagem de câmara ou câmara de vidro-fundo. Lavar as amostras na câmara de imagens ou descartável de vidro-fundo câmara 3x com buffer EM remover compostos potencialmente resultantes de lise celular. Adicione 1 mL de tampão de EM.</li>
	<li>Coloque a câmara em um palco de microscópio de fluorescência invertido aquecido a 33 ° C. Nota: Esta temperatura é selecionada como um compromisso entre as temperaturas ideais compatíveis com o processo de invasão de Shigella e o abrandamento deCa 2 + respostas para visualizar respostas locais. Nós usamos um 63 X objetivo de óleo de imersão (at = 1.25) equipado com anéis de contraste de fase.</li>
	<li>Selecione um campo de microscopia e configurar parâmetros de aquisição, incluindo o tempo de exposição e binning se necessário, para otimizar o sinal fluorescente Fluo-4. Nota: Os principais desafios de local Ca2 + imagem são de baixa amplitude e a pequena duração das respostas, que exigem a aquisição pelo menos a cada 30 ms. várias disponíveis comercialmente back-iluminado EM-CCD ou C-MOS câmeras apresentam o necessário sensibilidade para a detecção de Ca2 + respostas locais usando Fluo-4. Sensibilidade da deteção é também uma questão importante limitar Fotodano ou artefatos como respostas espontâneas ligadas à excitação fluorescente de Fluo-4 em uma alta frequência. Aqui, uma baseada em LED iluminação de 470 nm, com um filtro de excitação 480 ± 40 nm band-pass, um filtro dicroico 505 nm e uma 527 ± 30 nm passa-banda de emissão utilizados em 5% da sua máxima intensidade, combinada com um filtro de densidade neutra a 1,0 foram usados para minimizar estes problemas sob um fluxo de aquisições de duração limitada. Uma análise de Ca2 + sinais locais por lotes de 120 fluxos de s foi realizada de rotina. Nestas condições de baixa iluminação, fluoróforo fotobranqueamento não foi observado durante as aquisições de min-fluxo 2. Aquisições sucessivas na mesma amostra podem ser realizadas, desde diferentes campos são utilizados. Como regra geral, um primeiro fluxo de aquisição é executado em um campo de controle na ausência de estimulação de bactérias para garantir a ausência de respostas espontâneas. Se observam-se respostas espontâneas, as amostras são lavadas com tampão EM até sem respostas são observadas.</li>
	<li>Para adicionar bactérias para a amostra, remover 500 µ l de tampão EM da câmara e adicione 500 µ l da suspensão bacteriana preparada na etapa 1.1.6 para obter um final OD600nm de 0.05, com os cuidados adequados para evitar se mover o campo da microscopia selecionado; os volumes de assegurar uma adequada mistura de bactérias e uma distribuição homogênea das bactérias em amostras de célula.</li>
	<li>Realize uma aquisição mediante a adição de bactérias. Alternativamente, realize uma aquisição 10 min após a adição de bactérias, que corresponde ao tempo necessário para que as bactérias sedimentos nas células nas condições usadas. No final do fluxo de aquisição, adquira uma imagem de contraste de fase do campo seleccionado para visualizar as bactérias em contato com as células e os babados de membrana associados com sites de invasão bacteriana.</li>
	<li>Repita o procedimento de aquisição como na etapa 2.5, em intervalos que são favoráveis à duração da caixa aquisições de imagem, arquivos, seleção de um novo campo para cobrir todo o processo. Nota: Para Shigella, encontramos que a aquisição transmite cada 5 min por 20 min, seguindo a sedimentação bacteriana 10 min, autorizada a cobrir a maior parte dos eventos de invasão.</li>
	<li>No final do processo de aquisição, adicione uma concentração final de 2 µM de Ca2 + ionóforo ionomycin amostras para determinar a amplitude máxima dos sinais de Ca2 + . Adquirir imagens cada 3-5 s até a estabilização do sinal, geralmente para menos de 10 min.</li>
	<li>Siga pela adição de Ca2 + quelante EGTA em uma concentração final de 10 mM para determinar o sinal de fluorescência na ausência de Ca2 +. Adquirir imagens cada 3-5 s até a estabilização do sinal, geralmente para menos de 10 min. Nota: Por causa da dinâmica relativamente lenta das variações Ca2 + globais, execute estas aquisições cada 3-5 s (não no modo de streaming), permitindo a Ca2 + imagem no mesmo campo microscópico durante os tratamentos sucessivos.</li>
</ol>3. análise
<ol><li>Express citosólico Ca2 + variações ao longo do tempo como a porcentagem de ΔF/F0, onde ΔF representa a variação da intensidade da fluorescência média da região de interesse (ROI) e F0 a fluorescência de base no ROI mesmo, para que um não relevantes para a região do campo desprovido de células é subtraído.<ol>
<li>Remover os níveis basais de fluorescência para cada célula em diferentes campos, correspondente aos níveis de base; Estes níveis podem ser determinados sem ambiguidade devido a baixa frequência e relativamente curta duração dolocais Ca 2 + respostas na aquisição de um determinado fluxo. Nota: Quantificar características marcantes das respostas relacionadas às perguntas feitas e o modelo patogênico estudado. Classicamente, vários parâmetros são levados em conta para analisar Ca2 + sinais, incluindo a frequência de células mostrandolocais ou globais Ca 2 + respostas, bem como a duração, amplitude e frequência dessas respostas. No caso de Shigella e respostas locais, outro aspecto importante da análise é a associação espacial das respostas com sites de invasão bacteriana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para quantificar a percentagem de células responsivas apresentando respostas globais ou locais, desenhe ROIs em células, na série de tempo correspondente às variações de intensidade de Fluo-4.<ol>
<li>Definir parâmetros rigorosos para identificar Ca2 + respostas locais, tais como uma amplitude de variações de fundo triplo acima a linha de fluorescência de média intensidade célula base, ou uma duração de pelo menos 200 ms, para evitar marcar um falso positivo. Nota: Como regra geral, mesmo pequenas Ca2 + respostas locais podem ser distinguidas de qualquer ruído de fundo pelo seu perfil. O ROIs deve ser grande o suficiente para integrar suficientes sinais de fluorescência para permitir a detecção de variações locais. Dependendo da intensidade da detecção Fluo-4, estes ROIs podem corresponder a círculos com diâmetros variando de 2 a 5 mM.</li>
		<li>Medir as variações da média intensidade da fluorescência Fluo-4 em 2 regiões em uma área distinta da mesma célula, para determinar se as respostas são locais ou globais. Nota: A análise de um grande número de células é facilitada pela utilização de software que permite a exibição de tela on-line das variações da intensidade da fluorescência média ao longo do tempo para as regiões selecionadas de imagem. Software de imagem comercialmente disponível tem essa opção, mas isso também pode ser realizada usando o Icy freeware, usando o plugin de Evolução de intensidade de ROI .</li>
		<li>Determine a porcentagem de células apresentando respostas locais. Nota: Este percentual é calculado a partir do número total de células analisadas no campo de microscopia, que deve ser em número suficiente para suportar um estatisticamente significância usando um teste não-paramétrico.</li>
		<li>Determine a duração das respostas locais. Nota:Locais de Ca 2 + respostas podem ser ainda mais distinguidas de acordo com os intervalos de duração (ou seja, menos de 500 ms, entre 5 e 10 s, ou acima de 10 s) e sua associação com sites de invasão de Shigella .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificar a amplitude das respostas. Primeiro, calibre as máxima Ca2 + e célula fundo níveis determinados como na etapa 2.1.7. Desde que a carga de Fluo-4 pode variar para cada célula, execute essas determinações para células individuais no campo.<ol>
<li>Expressa a amplitude das respostas em percentagem relativa da resposta máxima.</li>
		<li>Realizar testes estatísticos utilizando um teste de normalidade, seguido de um teste paramétrico para analisar possíveis diferenças na amplitude das respostas entre as amostras.</li>
		<li>Determine a associação dessas respostas em relação os sites de invasão bacteriana por sua respectiva localização para os babados de membrana induzida por bactérias visualizado nas imagens de contraste de fase correspondente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11413485">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+calcium+ATPases%3A+from+generic+Ca%282%2B%29+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Ca2%2B+signals%3A+a+question+of+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li>
<li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20494106">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li>
<li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li>
<li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li>
<li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+type+III+secretion+systems%3A+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li>
<li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219(2015).</li>
<li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567(2013).</li>
<li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+PtdIns%284%2C5%29P%282%29+into+PtdIns%285%29P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li>
<li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li>
<li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+Ca2%2B+requirement+of+calpain+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fluorescent+Ca2%2B+indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li>
<li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2%2B+signals+during+invasion+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li>
<li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes%2C+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Este manuscrito descreve o protocolo que estamos projetados para seguir Ca2 + sinais locais durante a cinética relativamente curta de uma invasão de Shigella , bem como Ca2 + respostas globais durante a cinética estendida de Shigella. Abaixo, a chave encontram problemas que precisam ser abordadas para otimizar a detecção de Ca2 + sinais minimizando qualquer interferência com os processos biológicos.
Química vs geneticamente codificado so...

CA2 + regula todos os processos de célula conhecida, incluindo a reorganização do citoesqueleto, respostas inflamatórias e caminhos de morte celular relacionados ao hospedeiro-patógeno interações1,2,3. Sob condições fisiológicas, basal citosólico Ca2 + as concentrações são baixas, em centenas de gama nM, mas podem ser submetidas a aumentos transitórios mediante estimulação agonista. Estas variações frequentemente apresentam comportamento oscilatório através da ação das bombas e canais em membranas do plasma e retículo endoplasmático. O padrão dessas oscilações é caracterizado pelo período, duração e amplitude de Ca2 + aumenta e é descriptografado por células que, por sua vez, provocam respostas específicas no que é conhecido como o Ca2 + código4,5 . Um aumento sustentado da citosólico Ca2 + concentração sob condições patológicas pode levar à morte celular associada a permeabilização de membranas mitocondriais e o lançamento do pro-apoptotic ou fatores necróticos6, 7.
Shigella, o agente causador da disenteria bacilar, invade células epiteliais injetando efetores em células hospedeiras, usando um tipo III secreção sistema (T3SS)8,9. Uma invasão de Shigella das células do hospedeiro é associada com o locais e globais Ca2 + sinais eliciados a T3SS. Quanto à formação de poros toxinas, o translocon T3SS que insere as membranas de pilha de anfitrião e é necessária para a injeção de efetores T3SS é provavelmente responsável para a ativação do PLC e do triphosphate do inositol (1, 4, 5) (InsP3)-dependente Ca2 + lançamento. A combinação de estimulação localizada PLC e o acúmulo de actina polimerizada em sites de um resultado de invasão de Shigella em uma Ca InsP3 dependente atipicamente longa duração2 + versão10. O efetor do III tipo IpgD, um bisfosfato fosfatidil 4,5 (PIP2) -4-fosfatase, limita a quantidade de local de PIP2, assim, controlar a quantidade de substrato disponível para PLC gerar InsP3, que contribui para o confinamento do local Ca2 + respostas em sites de invasão bacteriana11,12. Estes locais Ca 2 + respostas provavelmente contribuem para a polimerização de actina no Shigella invasão sites10. Global Ca2 + respostas que são também provocadas pela Shigella, no entanto, são dispensáveis para o processo de invasão bacteriana, mas provocar a abertura de hemichannels connexin na membrana plasmática e a liberação de ATP no extracelular compartimento. Lançado ATP agindo de forma parácrina, por sua vez, estimula aCa 2 + oscilatórias respostas nas células ao lado da célula infectada. IpgD também é responsável pela formaçãoglobais Ca 2 + respostas em erráticas respostas isoladas com dinâmica lenta. Eventualmente, após uma prolongada infecção bacteriana, IpgD leva para a inibição de InsP3 mediada por Ca2 + sinais. Através de sua interferência com sinalização de Ca2 + , IpgD atrasa um Ca2 +-ativação Calpaína dependente, levando para a desmontagem de estruturas de adesão focal e o descolamento prematuro da infectado as células13.
Enquanto Ca2 + sinais estão envolvidos em aspectos críticos da patogênese, a utilização de um microrganismo gera um número de desafios técnicos que não são encontrados em estudos clássicos agonista. Os protocolos descritos aqui usam o comumente usado fluorescente Ca2 + indicador químico impresso Fluo-4 que nós produzimos para caracterizar o local de Ca2 + sinais durante uma infecção de Shigella . Passos essenciais para a detecção destes sinais são discutidos, bem como procedimentos implementados para sua análise quantitativa que é necessário para caracterizar o papel de efetores bacterianas em sinalização de Ca2 + .

<table><tbody><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph versão 7.7</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolLED sistema de iluminação pE-2</td><td>Micro-prato Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm, alto&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tripticase (TCS)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11768</td></tr><tr><td>Ágar TCS</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11043</td></tr><tr><td>Congo red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>75768</td></tr><tr><td>M90T-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>Shigella flexneri sorotipo V. expressando a adesina</td><td></td> AfaE</tr><tr><td>ipgD-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>cepa mutante ipgD isogênica expressando a adesina</td><td></td> AfaE</tr></tbody></table>

imagem de ca2 + respostas durante shigella infecção das células epiteliais

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

CA2 + é um íon ubíquo envolvido em todos os processos celulares conhecidos. Enquantoglobais Ca 2 + respostas podem mudar o destino de célula, variações locais grátis Ca2 + citosólico concentrações, ligada à liberação de lojas internas ou um influxo através dos canais da membrana plasmática, regulam processos de célula cortical. Patógenos que aderir ou invadir o hospedeiro células gatilho uma reorganização do citoesqueleto de actina subjacentes a membrana plasmática de anfitrião, que provavelmente afeta Ca2 + sinalização globais e locais. Porque esses eventos podem ocorrer em baixas frequências de forma pseudo estocástica sobre cinética estendida, a análise de Ca2 + sinais induzidos por patógenos gera grandes desafios técnicos que devem ser abordadas.
Aqui, nós relatamos protocolos para a detecção de Ca2 + sinais globais e locais em cima de uma infecção de Shigella de células epiteliais. Estes protocolos, artefatos ligados a uma exposição prolongada e Fotodano associado com a excitação de sondas fluorescentes de Ca2 + são solucionados problemas ao controlar rigorosamente os parâmetros de aquisição durante períodos de tempo definidos durante um Shigella invasão. Os procedimentos são implementados para analisar com rigor a amplitude e frequência da global citosólico Ca2 + sinais durante a cinética de infecção prolongada usando a sonda química Fluo-4.

Invasão de Shigella está associado atípica duradouro Ca2 + respostas locais:
Seguindo o protocolo mencionado acima, as células HeLa Fluo-4-carregado foram desafiadas com WT Shigella e aquisições de fluxo foram realizadas para analisar sinais de Ca2 + . Um experimento de representante é mostrado na Figura 1, com uma série de imagens de lapso de tempo da intensidad...

Aqui, apresentamos os protocolos para visualizar respostas de cálcio (Ca2 +) eliciadas células HeLa infectadas por Shigella. Otimizando os parâmetros de infecção bacteriana e imagem latente com sondas fluorescentes de Ca2 + , caracterizam-se atípica globais e locais Ca2 + sinais induzidos por bactérias sobre uma escala grande da cinética da infecção.

Imagem de Ca2 + respostas durante Shigella infecção das células epiteliais

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

O objetivo geral desta análise de microscopia fluorescente usando sondas químicas é analisar as respostas locais e globais de cálcio provocadas pelas células hospedeiras durante a infecção por Shigella patogênica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia celular, como sinalização induzida por patógenos que leva à reorganização do citoesqueleto ou morte celular. A principal vantagem desta técnica é que, usando sondas químicas, pode-se seguir sinais locais de cálcio associados a processos locais desviados pelo patógeno.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à definição de parâmetros que permitem seguir os sinais locais de cálcio, preservando a integridade das amostras biológicas. Para começar, coloque Shigella do tipo selvagem expressando a adesão AfaE em uma placa de ágar tripticase de soja ou TCS contendo 0,01% de vermelho Congo e incube as placas a 37 graus Celsius por 18 horas. Prepare as pré-culturas a partir das placas listradas, colhendo três colônias vermelhas e inoculando o caldo TCS com 75 microgramas por mililitro de ampicilina.Cultive as culturas líquidas em uma incubadora agitada a 37 graus Celsius e 200 rpm por 16 horas. Em seguida, inocular o TCS com a pré-cultura bacteriana em uma diluição de 1:100. Incube a cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora agitada a 200 rpm por duas horas.Certifique-se de que a densidade óptica em 600 nanômetros seja de 0,2 a 0,4. Centrifugar a cultura a 13 000 g e 21 graus Celsius durante dois minutos e voltar a suspender o sedimento num volume equivalente de meio EM. Diluir a suspensão bacteriana em tampão EM a um OD 600 final de 0,1 e utilizá-la imediatamente ou armazená-la a 21 graus Celsius e utilizá-la nos 60 minutos seguintes.Cultive células HeLa em DMEM com um grama por litro de glicose suplementada com 10% FCS e cultive a cultura a 37 graus Celsius com 10% de CO2. Cultive células TC7 em DMEM com 4,5 gramas por litro de glicose, 10% FCS e aminoácidos não essenciais e cultura a 37 graus Celsius e 10% de CO2. Para manutenção celular, divida as células regularmente para evitar a inibição do contato de crescimento ligada a estados confluentes.Isso é fundamental para a alta carga da sonda de cálcio e eficiência da transfecção. Tripsinizar e contar as células TC7. No dia anterior ao experimento com células HeLa, coloque as células em lamínulas circulares estéreis de 25 milímetros de diâmetro em placas de seis poços a uma densidade de três vezes 10 elevado a cinco células por poço.Em seguida, para permitir a polarização antes dos experimentos, semeie as células em quatro vezes 10 elevado a cinco células por poço e incube-as por cinco a sete dias, substituindo o meio todos os dias. No dia do experimento, remova o meio e use um mililitro de meio EM para lavar as células três vezes. Carregue as células com três tampão micromolar Fluo-4 AM e EM e incube as placas a 21 graus Celsius por 30 minutos.Com tampão EM, lave as amostras três vezes, adicione um mililitro de tampão EM e incube as células a 21 graus Celsius para permitir a hidrólise da porção AM. Coloque a lamínula contendo as células carregadas com Fluo-4 em uma câmara de imagem ou fundo de vidro. Use tampão EM para lavar a amostra três vezes para remover compostos potencialmente resultantes da lise celular.Em seguida, adicione um mililitro de buffer EM. Coloque a câmara em um microscópio de fluorescência invertida Selecione um campo de microscopia e configure os parâmetros de aquisição, incluindo tempo de exposição e binning, se necessário, para otimizar o sinal fluorescente Fluo-4.Para adicionar bactérias à amostra, remova cuidadosamente 500 microlitros de tampão EM da câmara e adicione 500 microlitros da suspensão bacteriana para obter um OD 600 final de 0,05. Realize imediatamente uma aquisição ou aguarde 10 minutos para permitir que as bactérias sedimentem nas células. No final do fluxo de aquisição, adquira uma imagem de contraste de fase do campo selecionado para visualizar as bactérias em contato com as células e os babados da membrana associados aos locais de invasão bacteriana.Repita o procedimento de aquisição em intervalos que sejam favoráveis à duração das aquisições de imagem, salvamento de arquivo e seleção de um novo campo para cobrir todo o processo. No final do procedimento de aquisição, adicionar à amostra dois micromolares do ionóforo de cálcio ionomicina para determinar a amplitude máxima dos sinais de cálcio. Adquira imagens a cada três a cinco segundos até que o sinal se estabilize, geralmente por menos de 10 minutos.Em seguida, adicione o quelante de cálcio EGTA a uma concentração final de 10 milimolares para determinar o sinal fluorescente na ausência de cálcio. Adquira imagens a cada três a cinco segundos até a estabilização do sinal, geralmente por menos de 10 minutos. Realize a análise de imagem de acordo com o protocolo de texto.Neste experimento, células HeLa carregadas com Fluo-4 foram desafiadas com Shigella do tipo selvagem e aquisições de fluxo foram realizadas para analisar sinais de cálcio. Uma série de imagens de lapso de tempo da intensidade de fluorescência da sonda Fluo-4 é calculada em uma região de interesse para uma única célula, e a imagem de contraste de fase correspondente é mostrada. Aumentos locais atípicos no cálcio citosólico livre são observados no local da invasão de Shigella com amplitude variável e durações variando de 2,5 a cinco segundos, seguidos por aumentos globais na célula infectada.Neste exemplo, uma cepa mutante isogênica, deficiente para o efetor tipo III IpgD, uma fosfatidil 4, 5-bisfosfato fosfatase, induziu respostas locais mais globais e menos atípicas com longas durações em comparação com a cepa Shigella do tipo selvagem. Como visto neste experimento, a imagem das respostas globais de cálcio sobre a cinética de infecção estendida mostra uma diminuição na frequência das respostas 30 minutos após o desafio com Shigella do tipo selvagem. Finalmente, a quantificação das respostas celulares dependentes da dose ao agonista de cálcio histamina ilustra a inibição de uma liberação de cálcio dependente de trifosfato de inositol em estágios tardios de uma infecção por Shigella.Após este procedimento, todos os métodos que combinam simultaneamente fluidos e imagens compatíveis podem ser realizados para abordar o papel dos sinais de cálcio em um determinado processo. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos pode ser extremamente perigoso, e cuidados como descarte de resíduos, limpeza de superfícies ou equipamentos contaminados devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.

imaging-ca2-responses-during-shigella-infection-of-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Vonaesch, P. et. al., Análise de Imunofluorescência da Formação de Grânulos de Estresse após Desafio Bacteriano em Células de Mamíferos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a infecção das células epiteliais pela bactéria patogênica Shigella flexneri e a resposta celular do hospedeiro resultante. Proteínas efetoras bacterianas interrompem a tradução do hospedeiro, desencadeando a formação de organelos sem membrana chamados grânulos de estresse, que refletem a resposta adaptativa da...

Formação de Grânulos de Estresse durante a infecção por Shigella em células epiteliais cancerígenas

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

Este vídeo demonstra uma técnica para detectar a resposta local e global do íon cálcio após a infecção por Shigella de células epiteliais humanas. A Shigella invade as células hospedeiras e libera efetores de invasão, impactando os níveis de cálcio intracelular. A amplitude e a frequência do cálcio citosólico local e global são estudadas usando um indicador fluorescente.

Uma técnica de imagem para estudar a resposta do cálcio em células infectadas por bactérias

Descreve-se um método para controlar a ruptura endomembranar provocada pelas bactérias...

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Para combater a disseminação da bactéria, as células hospedeiras reorganizar seu citoesqueleto de compartimentar as bactérias e induzir a autofagia. Usando Shigella infecção de células de cultura de tecidos, hospedeiro e determinantes de agentes patogénicos subjacentes a este processo são identificados e caracterizados. Utilizando modelos de peixe-zebra de infecção Shigella, o papel de moléculas e de mecanismos descobertos são investigados in vivo.

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

O presente protocolo descreve ensaios de infecção para interrogar a adesão, invasão e replicação intracelular de Shigella usando linhagens celulares epiteliais in vitro .

Análise de Infecção de Células Epiteliais com Shigella

Células M em um epitélio folículo-associados especializados que cobrem as placas de Peyer desempenhar um papel importante para a vigilância imunológica da mucosa intestinal em tecido linfóide associado. Aqui descrevemos o método de avaliação para transcitose bacteriana por células...

Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

Nós descrevemos o isolamento rápido de murinos primários células tipo II alveolares epiteliais (AECII) por meio de seleção por citometria de fluxo negativo. Estes AECII mostram viabilidade e pureza elevados e são adequadas para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares relativas ao seu papel em condições respiratórias, tais como doenças auto-imunes ou infecciosas.

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

A colonização da nasofaringe murina com Streptococcus pneumoniae e a subsequente extração de células aderentes ou recrutadas é descrita. Esta técnica envolve a lavagem da nasofaringe e a coleta do fluido através das nares e é adaptável para várias leituras, incluindo quantificação celular diferencial e análise da expressão mRNA in situ.

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Este protocolo detalha um método para isolar células apresentadoras de antigénio a partir de timo humano por meio de diferentes passos de digestão enzimática do tecido seguida por centrifugação de densidade da suspensão de células individuais e finalmente separação magnética e / ou FACS das populações de células de interesse.

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

Aprenda a visualizar respostas de cálcio em células HeLa infectadas por Shigella usando microscopia de fluorescência com sondas químicas. Este método permite analisar sinais locais e globais de Ca²⁺ durante a infecção bacteriana.

Imagem de Ca^{2 +} respostas durante Shigella infecção das células epiteliais

Explorar mais vídeos