Name: Preparação de sílica funcional usando um método Bioinspirada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a sintetizar sílica bioinspirada com imobilização enzimática in situ usando neutralização ácida rápida. Este método rápido e ecológico permite personalizar propriedades do material para aplicações em biomateriais.

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Os autores agradecer o apoio financeiro do departamento de química e engenharia biológica (Universidade de Sheffield) e o EPSRC (EP/L017059/1 e EP/P006892/1).

1. preparação de soluções de Precursor (e soluções encapsulante opcional)
<ol><li>Em um recipiente de plástico de 180 mL, medir 1,5 mmol de silicato de sódio penta-hidratado (318,2 mg) e dissolver em 20 mL de água desionizada.</li>
	<li>Da mesma forma, em um segundo recipiente, medir 0,25 mmol de hexamina pentaethylene (PEHA, 58,1 mg) e dissolver em 20 mL de água desionizada.<ol>
<li>Ao usar a alternativa amina-contendo compostos , por exemplo,dietilenotriamina (DETA) ou triethylenetetraamine (Roberta), certifique-se de que a proporção de toupeira Si:N total permanece constante em 1 (ou seja, correspondente a 0,5 mmol de DETA ou 0,375 mmol de Roberta em o procedimento descrito)15.</li>
		<li>Quando usando amina polimérica aditivos por exemplo,poly(ethyleneimine) (PEI) ou poly(allylamine hydrochloride) (PAH), manter uma concentração de 1 mg/mL (volume de reação final)15. Atenção: Lidar com essas aminas somente dentro de uma coifa, como eles são corrosivos ou tóxicos em suas formas puras (especialmente como vapores).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para executar em situ encapsulamento durante a síntese, dissolver uma massa pré-determinada de proteína (aqui 50 mg de albumina de soro bovino, BSA) em 5 mL de água desionizada. Subtrai essa quantidade de água do volume de água desionizada para ser usado para a dissolução de silicato de sódio penta-hidratado.<ol>
<li>Para facilitar a dissolução de proteína, sem alterar sua estrutura, uma vez misturada com água deionizada, tampar o recipiente e armazenar a 4 ° C. Checar o progresso de dissolução, de preferência sem mexendo ocasionalmente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sílica síntese
<ol><li>Combine as soluções de silicato de sódio penta-hidratado e PEHA em um do contêiner de 180 mL e adicionar água desionizada para fazer a final solução volume 41 mL (ou 46 se em situ encapsulamento é omitido).</li>
	<li>Coloque a mistura recém-preparado de silicato de sódio e PEHA soluções no topo de uma placa de agitador, adicionando uma barra de agitador para fornecer uma mistura consistente.</li>
	<li>Este vaso, suspender uma sonda de pH e gravar o pH inicial.<ol>
<li>Nesta fase, opcionalmente, remova um 750 alíquota µ l da mistura inicial para posterior determinação da concentração inicial [Si] usando o ensaio espectrofotométrico do azul de molibdênio, como descrito no passo 8.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniciar a síntese, adicionando uma quantidade pré-determinada de 1 M de HCl, calculado da forma da Figura 1e observar a evolução imediata de turbidez (ver Figura 2)</li>
	<li>Assim que acabou-se a adição de ácido, adicionar a solução encapsulante (se houver) tão rapidamente quanto possível. Nota: O volume final, dado estas quantidades é 50 mL da mistura de reação total, levando a concentrações de Si e N de 30mM. Isto pode ser escalado como desejado multiplicando todos acima quantidades por uma quantidade constante.</li>
	<li>Gravar o pH depois de 5 min para determinar a conclusão de reação; Certifique-se de que o pH é 7 ± 0,05.</li>
</ol>3. ácida eluição dos materiais
<ol><li>Modifica a composição de sílica produzida após a reação chegou a conclusão (ou como uma coalhada como feita pelo resuspending uma amostra anterior sintetizada de sílica) pela adição de mais ácido.</li>
	<li>Se resuspending sílica, mistura de sílica de Bioinspirada preparada como aproximadamente 150 mg com 100 mL de água deionizada em um recipiente de plástico de 180 mL e coloque no topo de uma placa de agitador.</li>
	<li>Uma vez que a suspensão é bem misturada, suspenda uma sonda de pH no vaso.</li>
	<li>Titula-se em mais de HCl até pH desejado (entre 7 e 2) foi alcançado e permite estabilizar para ca. 1 min.</li>
	<li>Espere uma mais 5 min para garantir que o sistema está totalmente equilibrado e prossiga para isolar o silicone sólido.</li>
</ol>4. sílica separação e secagem
<ol><li>Decante a suspensão de sílica Bioinspirada para tubos de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de 5.000 g durante 15 minutos.</li>
	<li>Remova o sobrenadante após a centrifugação e armazenamento para posterior análise (por exemplo, ensaio de Bradford, veja abaixo). Encher os tubos de centrífuga com água desionizada e ressuspender a sílica usando um misturador do vortex.</li>
	<li>Repeti a centrifugação, armazenamento de sobrenadante e re-suspensão duas vezes.</li>
	<li>Após a centrifugação final, remover o sobrenadante e raspar a sílica em um cadinho de cerâmico.</li>
	<li>Seca em estufa durante a noite a 85 ° C.<ol>
<li>Se encapsulamento tiver sido feita, use uma instalação de liofilização ou um forno operando sob vácuo para evitar a desnaturação de proteínas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. produção de molibdênio azul reagente (MBR) para determinação de [Si]
<ol><li>Para um balão aferido de 1 L plástico, adicione 8 tetra de molibdato de amónio mmol (10 g) em uma hotte.</li>
	<li>Isso dissolva em 500 mL de água desionizada sob agitação.</li>
	<li>Acidificar a solução adicionando cuidadosamente 60 mL de solução de HCl de 10 M.</li>
	<li>Ajustar o volume final para 1 L.</li>
</ol>6. produção de sulfato de pará-aminofenol agente redutor (RA) para determinação de [Si]
<ol><li>Coloque um balão volumétrico de 500 mL vidro num banho de água à temperatura ambiente em um prato do agitador em uma hotte.</li>
	<li>Adicionar 111 mmol (10 g) de ácido oxálico anidro, 19,5 mmol (3,35 g) de sulfato de pará-aminofenol e 16 mmol (2G) de sulfito de sódio e dissolver em 250 mL de água.</li>
	<li>Cuidadosa e lentamente adicione 92 g (50 mL) de ácido sulfúrico saturado, agitando e espere a solução esfriar.</li>
	<li>Finalmente, dilua para 500 mL com água desionizada.</li>
</ol>7. Silicomolybdic ácido ensaio sobre espécies monoméricas de sílica
<ol><li>Em um frasco plástico de 5 mL, diluir 300 μL de MBR produzido na etapa 5.4 com 3 mL de água desionizada.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de uma solução de teste de ácido silícico e agitar a mistura. Nota: Esta solução girará lentamente amarela.</li>
	<li>Depois de exatamente 15 min, adicione 1,6 mL do agente redutor preparado a partir da seção 6 para reduzir o silicomolybdate amarelo complexo para seu isômero azul.</li>
	<li>Permita uma cor azul desenvolver pelo menos 2, mas não mais de 24 h.</li>
	<li>Medir a absorvância da amostra em 810 nm em um espectrofotômetro UV-vis e calcular [Si] contra uma curva de calibração.</li>
</ol>8. Silico ensaio ácido Molybdic na espécie de sílica poliméricos
<ol><li>Para medir a concentração de espécies de polissilicato usando o método do azul de molibdênio, em um tubo de microcentrifugadora, combine 750 µ l de solução de hidróxido de sódio 2M com suspensão de sílica 750 µ l.</li>
	<li>Selo e coloque em um carro alegórico microcentrifuga.<ol>
<li>Certifique-se de suficiente espaço livre resta dentro do tubo para evitar a ruptura devido ao acúmulo de pressão. Nota: Um headspace de 500 µ l é geralmente suficiente para evitar isso. Alternativamente, o procedimento pode ser realizado em frascos abertos enquanto perda líquida por evaporação é contabilizada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flutuar os microcentrifuga de tubos num banho de água aquecido a 80 ° C e deixe-o dissolver por 1h.</li>
	<li>Após decorrido 1h, retirar os tubos do microcentrifuge e limpe o exterior seco.</li>
	<li>Uma vez arrefecido, [Si] pode ser determinada conforme descrito acima, conforme descrito nas etapas de 7.2 a 7.5.</li>
</ol>9. Bradford procedimento de ensaio para determinação da concentração de proteína em sílica
<ol><li>Inserir uma quantidade pré-determinada de reagente (temperatura ambiente) Bradford e amostra em cada cubeta atribuída (ver tabela 1 e tabela 2 para volumes específicos). Utilize pontas de pipetas descartáveis para cada cubeta para evitar alterações de volume devido à natureza do reagente e repetir cada ponto em triplicado.</li>
	<li>Misture cada cubeta 3 vezes por inversão e deixar desenvolver por 10 min.</li>
	<li>Medir a absorvância a 595 nm, utilizando o sobrenadante puro como em branco.</li>
	<li>Calcule a absorbância original de cada cubeta subtraindo de cada medição da absorbância encontrada para as amostras de controlo (cubeta n º 0 em ambos os ensaios).</li>
	<li>Calcule a concentração de proteína da amostra desconhecida, utilizando uma curva de calibração (Figura 3). Em caso de diluição da amostra original, o factor de diluição deve ser contabilizado.<ol>
<li>Crie uma curva de calibração para cada conjunto de experimentos por plotagem absorvância medida contra a concentração de BSA para evitar flutuações aleatórias que podem afetar a sensibilidade do ensaio.</li>
		<li>Embora este ensaio da proteína destina-se a usar o BSA como um padrão para quantificar qualquer tipo de proteína, crie uma curva de calibração para cada proteína específica de interesse para a exatidão melhorada.</li>
		<li>Se o conteúdo de proteína da amostra desconhecida é esperado para ser maior do que o intervalo coberto da curva de calibração, diluí-lo conforme necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine o teor de proteínas para cada amostra durante a re-suspensão para monitorar perda de proteína possível.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram nenhum interesse financeiro concorrente.

No trabalho atual, apresentamos um método para precipitar rapidamente materiais de sílica Bioinspirada e encapsulamento de biomoléculas nele. Vamos demonstrar os passos críticos dentro do procedimento, ou seja, a quantidade de reação-iniciando o ácido a ser adicionado e sincronismo de adição da biomolécula encapsulante. Nós mostramos o efeito da quantidade de ácido adição em progressão de reação e o rendimento (Figura 4 e Figura 5, respectivamente) e demonstraram um método para controlo apertado sobre as condições de síntese, permitindo a consistência, apesar desta sensibilidade. Em relação a espécie ativa encapsulamento, embora simples em termos de procedimento, encapsulamento é mostrado para ser sensível às condições do experimento (ordem de adição, pH de adição, condições ambientais), no entanto, consistência no material Propriedades de novo é alcançável.
As condições de síntese podem ser modificadas através do uso de diferentes aditivos, muitos dos quais foram publicados em outros lugares,15 , fornecendo uma gama de morfologias e porosidades. Pós-sintéticas, mais técnicas para modificar e adaptar quimicamente Bioinspirada materiais de silicone têm sido relatadas como decoração de amina de13 e superfície suave de purificação. 20 finalmente, devido à natureza suave, aquosa da síntese, em situ encapsulamento é possível para uma vasta gama de substratos do que aqueles demonstrado aqui, que vão desde enzimas17,18 às células toda,21 sais de metal,22 ingredientes farmacêuticos ativos, pontos23 e quântica. 24
Ao contrário de outras sínteses de sílica orgânica mediada (por exemplo, a família de materiais MCM-41 ou SBA-15), a natureza polifuncionais de Bioinspirada aditivos não podem produzir ordenou estruturas de poros, nem altamente monodisperso distribuições de tamanho de partícula característica de sílica Stöber-tipo. 25 isto é devido à falta de comportamento bem definidos micellization Bioinspirada aditivos (fora de casos especiais)26 juntamente com o aumento da atividade catalítico sobre monofuncionais amina-contendo aditivos. 26
Por outro lado, esta natureza aditiva polifuncionais permite o uso de tempos de reação mais curto e mais suave temperatura & pressão em comparação com outras sínteses de sílica orgânica mediada. Isto também leva à possibilidade de eluição de aditivo de temperatura conforme descrito acima, que ainda tem de ser alcançado para essas outras famílias de sílica devido as especificidades de sua química de superfície. 27 , 28 , 29 -consequentemente, materiais de sílica Bioinspirada foram mostrados para ser mais económico e prático para produzir em uma escala maior, levando ao desenvolvimento e comercialização mais fácil. 14
Em resumo, síntese de sílica Bioinspirada representa um método rápido e fácil para produzir espécie ativa suportes ou mídia adsorvente de gás. Através de um controlo apertado do pH durante e após a reação, uma grande variedade de compostos de sílica-amina pode ser sintetizada com propriedades diferentes, que é ainda complementado pela possibilidade de em situ encapsulamento de uma matriz de diferentes orgânico, materiais inorgânicos ou orgânicos-bio. Embora independente modificação pós-sintética de Bioinspirada aditiva e concentração encapsulante ainda tem de ser alcançado, estes métodos representam um passo promissor para processos químicos ambientalmente benignos.

O uso da sílica como um apoio estrutural para catalisadores industriais está bem estabelecido, permitindo a atividade catalítica melhorada, estabilidade e capacidade de processamento,1 , portanto, potencialmente reduzindo os custos de operação. Estes benefícios são agravados em caso de imobilização da enzima, como o armazenamento dentro de um sistema de poros de sílica pode conferir benefícios significativos no tempo de vida de enzima sobre o seu homólogo livre. Nesse sentido, muito esforço tem sido despendido em encontrar o melhor método para anexar enzimas para espécies de sílica, com vários comentários comparando investigações utilizando diferentes métodos de imobilização em suportes sólidos siliciosas. 2 , 3 , 4
Enzimas são normalmente anexadas via physisorption ou covalente, além do encapsulamento dentro de um material poroso. 5 no entanto, existem desvantagens significativas relacionadas a cada método: physisorption se baseia em interações de superfície transitórias entre a sílica e biomolécula, que pode muito facilmente ser enfraquecida pelas condições de reação levando o inaceitável enzima de lixiviação. O muito mais forte apego covalente geralmente resulta em menor atividade devido a reduzida liberdade conformacional das espécies ativas. Encapsulamento pode resultar em atividade reduzida devido à inacessibilidade de enzima ou limitações de difusão. 6
Desenvolvimentos recentes no campo de sínteses de sílica mais suaves (muitas vezes apelidado de ' Bioinspirada') estabeleceram o em situ encapsulamento de biomoléculas e outras espécies ativas durante a síntese de material. 7 , 8 , 9 este método nega muitas das desvantagens de imobilização convencional - ao contrário de abordagens de Quimissorção liberdade conformacional da biomolécula é mantida pelo uso de interações noncovalent mais fracas, mas como as formas de cavidade de poros em torno a biomolécula, lixiviação ainda é impedida. Com efeito, encapsulamento demonstrou-se a trabalhar para uma gama de biomoléculas e células mesmo toda,10 e através de encapsulamento em efeitos de sílica Bioinspirada como desativação devido processo dura condições podem ser evitadas. 7 , 11
O objetivo do método descrito neste documento é preparar uma sílica porosa com propriedades controláveis, em condições ambientes, usando um aditivo orgânico Bioinspirada. O método pode ser facilmente modificado para incluir o encapsulamento de moléculas inorgânicas ou Juss, uma seleção do que deve ser mostrada. Vamos mostrar mais um método fácil para modificar os materiais como síntese química para alcançar o volume desejado Propriedades e purificação removendo o modelo orgânico através de eluição ácida.
Em comparação com a síntese tradicional de sílica porosa com modelo suporta (por exemplo,sílica materiais modelado através de surfactante supramolecular assemblies MCM-41 ou SBA-15)12 , que este método é significativamente mais rápido e mais suave, permitindo adaptados, em situ encapsulamento sem a necessidade de inúmeros passos de imobilização e purificação laboriosa. Além disso, o uso de eluição ácida, ao invés de calcinação abre a possibilidade de functionalization superfície orgânica.
Este método é altamente aplicável para aqueles que trabalham na imobilização de espécies ativas que têm encontrado physisorption ou imobilização covalente ser ineficaz. Também é útil para aqueles pesquisando processo aumentar como a síntese de Bioinspirada está singularmente posicionada para industrialização, em relação aos materiais convencionais de sílica com modelo. 13 , 14 , que esse método não é recomendado para aplicações que requerem uma matriz ordenada dos poros dentro do material , por exemplo,para Fotônica, como a estrutura material é desordenada apesar de alguma semelhança nas propriedades de massa.

<table><tbody><tr><td><forte>Síntese de sílica</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicato de sódio pentahidratado</td><td>Fisher scientific</td><td>10070470</td><td></td></tr><tr><td>Pentaetileno hexamina (PEHA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>292753</td><td></td></tr><tr><td>Dietilenotriamina (DETA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D93856</td><td></td></tr><tr><td>Trietilenotetraamina Tóxica ()</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90460</td><td></td></tr><tr><td>Poli (etilenoimina) (PEI)</td> <td>Polysciences</td><td>6088</td><td>1,2K MW</td></tr><tr><td>Poli (cloridrato de alilamina) (PAH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>283215</td><td>17,5k MW</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl) 1M</td><td>Fisher Scientific</td><td>10487830</td><td></td></tr> <tr><td>< forte > ensaio de ácido silicomílico < / molibdato ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>amônio tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7302</td><td>Produto substituído por M1019</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl) 37,0% em peso</td><td>Fluka Analytical</td><td>84436</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oxálico anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75688</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de para-aminofenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>10446880</td><td></td></tr><tr><td>Sódio sulfito</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234400</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84727</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autotitrator Titrando 902</td><td>Metrohm</td><td>2.902.0010</td><td></td></tr><tr><td>801 placa do agitador magnético</td><td>Metrohm</td><td>2.801.0040</td><td>Para uso com acima</td></tr><tr><td>de 800 Dosino</td><td>Metrohm</td><td>2.800.0010</td><td>Para uso com acima</td></tr><tr><td>Aquatrode Plus</td><td>Metrohm</td><td>6.0253.100</td><td>Para uso com</td></tr> a <tr><td>centrífuga acima Sorvall ST16</td><td>Thermo Scientific</td><td>11814243</td><td>Code é para Fisher scientific</td></tr><tr><td>UV-Vis espectrofotômetro Genesys 10A</td><td>Thermo scientific</td><td>12104972</td><td>Code é para a Fisher scientific</td></tr></tbody></table>

preparação de sílica funcional usando um método bioinspirada

Preparation of Functional Silica Using a Bioinspired Method

O objetivo dos protocolos descritos neste documento é sintetizar materiais de sílica Bioinspirada, executa o encapsulamento de enzima nele e parcialmente ou totalmente purificar o mesmo por eluição ácida. Combinando o silicato de sódio com uma aditivo de Bioinspirada polifuncionais, sílica é rapidamente formada em condições ambientais após neutralização.
O efeito da neutralização taxa e biomolécula ponto de adição no rendimento de sílica são investigados e eficiência de imobilização biomolécula é relatada para ponto de adição de variação. Em contraste com outros métodos de síntese de sílica porosa, é mostrado que o suaves condições necessárias para a síntese de sílica Bioinspirada são totalmente compatíveis com o encapsulamento de biomoléculas delicados. Além disso, condições suaves são usados em todas as etapas de síntese e modificação, tornando Bioinspirada sílica um alvo promissor para o scale-up e comercialização como um material desencapado e apoio activo médio.
A síntese é mostrada para ser altamente sensível às condições, ou seja, a taxa de neutralização e pH final de síntese, porém firme controle sobre esses parâmetros é demonstrado através da utilização de métodos de titulação de auto, levando a alta reprodutibilidade na caminho de progressão de reação e rendimento.
Portanto, Bioinspirada sílica é uma escolha excelente apoio material ativo, mostrando versatilidade para muitas aplicações atuais, que não se limitando aos demonstrado aqui e a potência em aplicações futuras.

As técnicas descritas acima são capazes de forma consistente e reproducibly precipitar sílica. Isto é mais fácil de determinar pelo rápido aparecimento de turvação dentro do recipiente de reação, que, após a cessação de agitação vai resolver espontaneamente em uma coalhada espessa de sílica precipitada (Figura 2). A extensão da reação e, portanto, o rendimento pode ser confirmado pela medição da massa desta coagulado após a separação e é tipicamente de 58 ± 6,5% (Figura 4, amarelo).
Mais insights sobre a progressão de reação podem ser gerado, adaptando o método espectroscópico azul de molibdênio para detectar a quantidade de espécies de silicato monomérico não tenha reagido, bem como as espécies que reagiram à forma polysilicates ou 'oligómeros', mas Não conseguiram chegar a um tamanho suficiente para coagular (Figura 4, vermelho e azul respectivamente).
Este dados de especiação de sílica específico são de particular interesse ao comparar as eficiências de titulação diferente para a reação de precipitação - ou seja, como o pH final da reação e a taxa na qual este é alcançado afeta a polimerização de sílica monomérica de uma 'oligómero' e sua subsequente coagulação de silicone sólido. Modificando a quantidade de ácido adicionado na etapa 2.4 ligeiramente, sob - ou over - titration da mistura de reação pode ser realizada (Figura 5). Medindo-se a especiação de sílica novamente para estes dois casos, uma clara diferença pode ser vista na conclusão da reação (Figura 4) apesar de apenas pequenas alterações no perfil de titulação da reação (Figura 5).
Embora nenhuma diferença está presente entre o consumo de espécies monoméricas para os casos de reação de três (restantes entre 29-33%), há uma clara diferença na quantidade de espécies de sílica oligoméricas que precipitam-se em cada caso. Isto está de acordo com a teoria tradicional sobre sílicas de sol-gel - no caso 'desviar' o pH é realizado mais elevado para já, permitindo partículas individuais crescer e, consequentemente, auxiliando a coagulação eficiente; no caso 'superação' a coagulação é induzida muito mais rápido devido a titulação rápida, portanto, menos que a espécie de sílica têm crescido a um tamanho suficiente para coagular e permanecem presas na fase coloide. 16
Dada a importância da titulação mediante formação de sílica, um priori conhecimento do volume titulação adequada é essencial. Embora não extraível da estequiometria da reação devido ao comportamento complexo protonação dos aditivos de amina e mudança na acidez superfície de sílica na coagulação, altamente confiáveis relações empíricas entre o conteúdo do sistema, as concentrações e volumes de título são prontamente gerados (Figura 1).
Concluída a coagulação, superfícies materiais podem ser modificadas facilmente através do uso de eluição ácida, conforme relatou recentemente pelos autores em outros lugares. 13 isto permite ajuste fino de propriedades materiais, tais como composição, porosidade e atividade química do aditivo (Figura 6a e b).
Neste estudo, BSA foi usado como uma enzima de encapsulante exemplar, no entanto, as técnicas descritas aqui podem ser usadas para várias enzimas17,18. O procedimento seguido para a deteção de proteínas é o protocolo de ensaio de Bradford,19 usando os sobrenadantes armazenados a partir de cada ciclo de centrifugação. A quantidade de proteína no sobrenadante é calculada usando uma curva de calibração, criada a partir de quantidades conhecidas de BSA dissolvido no sobrenadante de uma amostra com zero teor de proteína (amostra de controle). A quantidade de proteína encapsulada em sílica será calculada pela subtração da proteína detectada em sobrenadantes do montante inicial da proteína adicionado. O único reagente necessário para o ensaio é o reagente de Bradford (adquiridos ou feito de acordo com receitas-padrão).
Existem três tipos de formato de ensaio, dependendo do volume da amostra, a quantidade esperada de proteína para ser detectado e o método de medição utilizado. Neste documento, o formato seguido é especificado por um espectrofotômetro, requer cubetas descartáveis do macro e do micro tamanho e pode detectar de 10 µ g/mL a 1,4 mg/mL de proteína.
Na Figura 7 , a quantidade de proteína detectada depois de cada lavagem (passo 4.3) é mostrada como um % do montante inicial da proteína (que era 50 mg). Cerca ~ 50% de BSA foi detectado no sobrenadante após a centrifugação de primeira, que diz respeito à eficiência de imobilização de ~ 50%. Como não havia que nenhum BSA detectado em lavagens a seguir, que BSA (ou qualquer outra enzima) pode ser encapsulada com segurança durante a síntese de sílica com nenhuma lixiviação - esta é uma vantagem significativa desse método. A fim de confirmar a presença de BSA em sílica produzida, realizou-se análise de Fourier Transform Infrared espectroscopia (FTIR). A presença das bandas características de Amida I e II na área de 1.500/cm e 1650/cm (Figura 8) nas amostras preparadas na presença de BSA, mas não no controle de amostras (sem BSA) confirmaram a presença de BSA em sólidos.
Além do método de adição de enzima descrito acima (BSA adicionado durante a neutralização da mistura reacional), existem outra adição , por exemplo,BSA possíveis variações durante a mistura o silicato e as soluções aditivas, antes da neutralização ou enzima adicionada à solução de silicato ou aditivo antes de sua mistura e neutralização. Algumas dessas possibilidades foram exploradas ainda mais e as eficiências de imobilização (massa de BSA imobilizada como uma porcentagem da enzima adicionada ao sistema de reação, calculado com base do ensaio de Bradford) e a quantidade de BSA em sílica final foram medidos ( concentração de BSA em sílica, em percentagem do peso total composto produzido, ver Figura 9). Ficou claro que quando BSA foi adicionado para os reagentes não tenha reagidos (casos A C na Figura 9) não havia diferenças consideráveis na eficiência a imobilização ou a quantidade de BSA em resina composta resultante. No entanto, quando BSA é adicionada durante a formação de sílica (caso D na Figura 9), eficiência de imobilização e a quantidade de BSA no produto final foram ambos significativamente menor. Apesar dessas diferenças, a quantidade média de sílica produzida permaneceu inalterada (entre 85-90 mg). Essas observações podem ser explicadas com base na ionização (ou ponto isoeléctrico) de BSA, silicato/sílica e aditivo. Os diferentes métodos de adição permitem diferentes interações entre os precursores da enzima e sílica. Como o pH no momento da adição das mudanças de enzima, a ionização de cada espécie irá determinar interações intermoleculares, que por sua vez irão controlar a eficiência de imobilização.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cuvete n</td>
			<td>Concentração de BSA (mg/mL)</td>
			<td>Reagente de Bradford (mL)</td>
			<td>Amostra (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>0 (controle)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>0.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>0,5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.75</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Amostra desconhecida (X)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: configuração de ensaio de Bradford Macro e volumes calculados componente. Válido para determinação gama 0.1-1.4mg/mL (volumes para 1 replicar)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cuvete n</td>
			<td>Concentração de BSA (ug/mL)</td>
			<td>Reagente de Bradford (mL)</td>
			<td>Amostra (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>0 (controle)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>7.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Amostra desconhecida (X)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Micro Bradford ensaio set-up e volumes calculados componente. Válido para determinação variam de 1-10 µ g/mL (volumes para 1 replicar)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig1.jpg"> Figura 1 : Necessário volume de título contra a concentração de sílica para sistemas de reação usando DETA ou PEHA como aditivo. Sílica foi sintetizada em diferentes concentrações, mantendo um [N]: relação de [Si] de 1, para dois diferentes aditivos químicos. Barras de erro são um desvio padrão em torno da média. 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig2.jpg"> Figura 2 : Fotografias de coalhada de sílica na embarcação da reação (a) durante e após a agitação, (b) demonstrando a turvação da solução e estabelecendo-se que são indicativos de uma reação óptima.  
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig3.jpg"> Figura 3 : Curva de calibração de amostra para ensaio de macro Bradford. Sobrenadante da síntese de sílica Bioinspirada na ausência de BSA é misturado com uma quantidade conhecida da proteína, após o qual a análise de Bradford é executada conforme descrito na etapa 9.1.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig4.jpg"> Figura 4 : Estados de polimerização final da espécie de sílica para condições de reação diferente. Sílica é sintetizada usando condições ideais (linha de base), bem como com over - ou Under titulação, após o qual concentração relativa de sílica é quantificada por polissilicato monoméricas ou dimérica silicatos (vermelho), 'oligómeros' (azul) e de coagulação instável sílica (amarelo).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig5.jpg"> Figura 5 : Progressão do pH através do sistema de reação em função do volume do título inicial. Ácido é dosado imediatamente após ca. 38s da mistura, fazendo com que o pH rapidamente cair para abaixo de 8. Depois, ainda mais as quantidades de ácido são automaticamente dosadas tal que o pH foi 7,0 ± 0,05 300s após adição inicial. No caso de excesso titulada, não foi viável, como a dose inicial foi suficiente para deixar o pH abaixo de 7, atingindo pH 6.65 depois 300s. Volume inicial de HCl adicionado para 'desviar', 'base', e 'superação' foi 6,90 e 7.05 7,20 mL respectivamente.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig6.jpg"> Figura 6 : Alterações de propriedade representativa após acidificação do material coagulado sílica. (a) mudança de concentração de aditiva em relação ao pH e (b) mudança de porosidade de sílica em relação ao pH. Reproduzido de Manning et al . 13 sob licença Creative Commons. 
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig7.jpg"> Figura 7 : Concentração de BSA em sobrenadantes de síntese de sílica Bioinspirada. Bradford ensaios foram realizados em sobrenadantes de reação após a centrifugação, do qual o restante do montante relativo (portanto ocluídas de sílica sintetizada) foi determinado.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig8.jpg"> Figura 8 : Análise FTIR em sílica Bioinspirada com e sem encapsulamento espécie ativa. Espectros mostrou: preto linha: linha de sílica, cinza Bioinspirada: BSA puro, linha azul: sílica Bioinspirada carregado com BSA. Linhas verticais tracejadas indicam bandas Amida característico. 
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig9.jpg"> Figura 9 : Eficiência de imobilização e a quantidade de BSA em resina composta por sílica produziram utilizando PEHA. BSA foi adicionado (A) na solução PEHA antes de misturar com silicato, (B) na solução antes de misturar com PEHA, (C) após a mistura inicial de soluções PEHA e silicato e (D) após a mistura PEHA e silicato silicato soluções e neutralização. Eficiência é medida como % BSA encapsulado da mistura da reação como proporção do total BSA adicionado, enquanto BSA em sílica significa concentração de BSA % na composição final de sílica em massa. Barras de erro são um desvio padrão em torno da média.

Aqui, apresentamos um protocolo para sintetizar materiais de sílica Bioinspirada e imobilizar enzimas nele. Sílica é sintetizada pela combinação de silicato de sódio e uma amina 'aditiva', que neutralizam a uma velocidade controlada. Função e propriedades dos materiais podem ser alteradas por em situ imobilização enzimática ou pós-sintética eluição ácida de aditivos encapsulados.

Preparação de sílica funcional usando um método Bioinspirada

The goal of the protocols described herein is to synthesize bioinspired silica materials, perform enzyme encapsulation therein, and partially or totally ...

As principais vantagens deste método são que ele é rápido, fácil, ecologicamente correto e permite a adaptação de materiais. Este método pode fornecer informações sobre como a sílica bioinspirada é formada, as formas disponíveis de incorporação de biomoléculas e o tratamento pós-material sintético. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a formação de sílica é rápida e uma quantidade específica de ácido precisa ser adicionada rapidamente para obter os melhores resultados.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos como ele era leve, de modo que as condições eram compatíveis com enzimas. Pensamos em usar esse método para melhorar o desempenho e a estabilidade da enzima. A demonstração visual deste método é crítica, pois a etapa de neutralização ácida é a mais importante para as propriedades finais do material.Primeiro, pesar 318,2 miligramas de silicato de sódio pentahidratado em um recipiente de plástico de 180 mililitros e dissolver em 20 mililitros de água deionizada. Em um segundo recipiente, pesar 58,1 miligramas de pentaetileno hexamina ou PEHA e dissolver em 20 mililitros de água deionizada. Subtraia essa quantidade de água do volume de água deionizada a ser usada para a dissolução do silicato de sódio pentahidratado.Para realizar o encapsulamento in situ durante a síntese, dissolva uma massa predeterminada de proteína em cinco mililitros de água deionizada e coloque a solução na geladeira para dissolução total. Verifique ocasionalmente o progresso da dissolução, de preferência sem mexer. Combine as soluções de silicato de sódio pentahidratado e PEHA em um dos recipientes e adicione água deionizada suficiente para fazer o volume final da solução de 41,5 mililitros.Coloque a mistura recém-preparada em cima de uma placa de agitação e adicione uma barra de agitação para fornecer uma mistura consistente. Em seguida, suspenda uma sonda de pH na solução de agitação e registe o pH inicial. Comece a síntese adicionando uma quantidade predeterminada de ácido clorídrico de um molar e observe a evolução imediata da turbidez.O primeiro passo crítico é a rápida adição de ácido para iniciar a formação de sílica. O pH precisa ser reduzido para sete o mais rápido possível. Se a encapsulação estiver ocorrendo, adicione a solução encapsulante assim que a adição de ácido estiver completa.Em seguida, registre o pH após cinco minutos para determinar a conclusão da reação. Após a conclusão da reação, modificar a composição da sílica produzida adicionando mais ácido clorídrico à mistura até atingir o pH desejado entre dois e sete e deixar a suspensão estabilizar durante cerca de um minuto. Em seguida, decantar a suspensão de sílica bioinspirada em tubos de centrifugação de 50 mililitros e, em seguida, centrifugar a suspensão a 5 000 g durante 15 minutos.Após centrifugação, remover o sobrenadante e conservá-lo para análise posterior. Reabasteça os tubos da centrífuga com água deionizada e ressuspenda a sílica usando um misturador de vórtice. No caso da incorporação de biomoléculas, uma etapa crítica é dar os sobrenadantes da sílica bioinspirada para serem analisados posteriormente.Depois de repetir as etapas de centrifugação e ressuspensão duas vezes, remova o sobrenadante e raspe a sílica em cadinhos de cerâmica. Seque a sílica no forno durante a noite a 85 graus Celsius. Em um frasco de plástico de cinco mililitros, dilua 300 microlitros de reagente azul de molibdênio previamente preparado com três mililitros de água deionizada.Em seguida, adicione 10 microlitros de solução de teste de ácido sálico e agite para misturar. Após 15 minutos, adicione 1,6 mililitros de agente redutor de sulfato de para-aminofenol previamente preparado para reduzir o complexo de silicomolibdato amarelo ao seu isômero azul. Em seguida, medir a absorvância da amostra a 810 nanômetros em um espectrofotômetro UV-vis e calcular a concentração de silício em relação a uma curva de calibração.Usando ponteiras de pipeta descartáveis, adicione uma quantidade pré-determinada de reagente de Bradford e amostra em cada cubeta atribuída. Misture cada cubeta invertendo três vezes e deixe repousar por 10 minutos. Em seguida, meça a absorbância em 595 nanômetros usando sobrenadante puro como um branco.Calcular a absorbância original de cada cubeta subtraindo a absorbância da amostra de controlo a cada medição. Agora, crie uma curva de calibração para cada conjunto de experimentos, traçando a absorbância medida em relação à concentração de BSA para evitar flutuações aleatórias que possam afetar a sensibilidade do ensaio. Finalmente, determine o teor de proteína para cada amostra durante a ressuspensão para monitorar a possível perda de proteína.O rendimento da reação de formação de sílica é tipicamente de 58 mais ou menos 6,5% O método espectroscópico de azul de molibdênio detectou a quantidade de espécies de silicato monomérico não reagidas, bem como aquelas espécies que reagiram para formar polissilicatos ou oligômeros, mas não conseguiram atingir tamanho suficiente para coagular. Uma vez que a coagulação esteja completa, as superfícies do material podem ser prontamente modificadas através do uso de eluição ácida, o que permite o ajuste fino das propriedades do material, como composição, porosidade e atividade química do aditivo. Cerca de 50% da BSA foi detectada no sobrenadante após a primeira centrifugação, o que se relaciona com 50% de eficiência de imobilização.Como não foi detectada BSA nas lavagens seguintes, a BSA pôde ser encapsulada com segurança durante a síntese sem lixiviação. O espectro FTIR da sílica apresentou bandas de amida características nas amostras com BSA, mas não nas amostras controle. Quando a BSA foi adicionada aos reagentes que não reagiram, não houve diferenças consideráveis na eficiência da imobilização ou na quantidade de BSA no compósito resultante.Quando a BSA foi adicionada durante a formação da sílica, a eficiência de imobilização e a quantidade de BSA no produto foram significativamente menores. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de cinco minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser preciso com pesos e volumes de reagentes e adicionar rapidamente o ácido em uma dose.Após este procedimento, outros métodos como FTIR, SCM, porosimetria e ensaios enzimáticos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as propriedades e morfologia do material, bem como a atividade das biomoléculas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da formação de sílica bioinspirada explorarem um método rápido, fácil, controlável e ecologicamente correto de sintetizar sílica com a capacidade de encapsulamento in situ de biomoléculas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar sílica usando um método bioinspirado, encapsular biomoléculas in situ, medir a eficiência de encapsulamento e realizar a eluição pós-sintética dos aditivos.Não se esqueça que trabalhar com aminas, ácidos, biomoléculas pode ser extremamente perigoso e precauções como EPI e prevenção de derramamento devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

preparation-of-functional-silica-using-a-bioinspired-method

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Uma nova maneira de produzir aerogéis à base de biopolímeros por gelificação induzida por dióxido de carbono (CO2) é mostrada. A técnica utiliza dióxido de carbono pressurizado (5 MPa) para a produção de hidrogéis de biopolímero e CO2 supercrítico (12 MPa) para converter géis em aerogéis. Os únicos solventes necessários além do CO2 são água e etanol.

Preparação de Biopolymer Aerogels utilizando solventes verdes

Aprenda a sintetizar sílica bioinspirada com imobilização enzimática in situ usando neutralização ácida rápida. Este método rápido e ecológico permite personalizar propriedades do material para aplicações em biomateriais.

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