Avaliando o papel da função mitocondrial em fadiga relacionadas ao câncer

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a disfunção mitocondrial associada à fadiga em pacientes com câncer. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do tratamento do câncer de suporte, como se a disfunção mitocondrial está associada à fadiga em pacientes com câncer após receber radioterapia. A principal vantagem dessa técnica é que ela é menos invasiva e pode ser facilmente usada na clínica para identificar pacientes com risco de toxicidades da terapia do câncer.

Essa técnica não apenas avança nossa compreensão do papel da disfunção mitocondrial na fadiga relacionada ao câncer, mas também pode melhorar a avaliação e otimizar seu gerenciamento. Embora esse método possa fornecer informações sobre os mecanismos subjacentes da fadiga relacionada ao câncer, ele também pode ser aplicado a outras condições de doenças fatigantes, como condições metabólicas e inflamatórias. Geralmente, pode ser um desafio para indivíduos novos neste método injetar inibidores respiratórios em cada porta do cartucho do sensor adequadamente, sem demonstração visual prévia.

Demonstrando este procedimento estará o Sr. Quang Nguyen, um bolsista de pós-bacharelado de nosso laboratório. Para hidratar o cartucho do sensor, primeiro remova-o da embalagem. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução calibrante a cada poço da placa de utilidade.

Encha também cada fosso com 400 microlitros de solução calibrante. Em seguida, retorne a placa do sensor para a placa de utilidade e comece a hidratar o cartucho em uma incubadora sem dióxido de carbono a 37 graus Celsius durante a noite. Meça o nível de fadiga com base na avaliação funcional de 13 itens da terapia de doenças crônicas.

Fadiga no início do estudo, ponto médio, na conclusão da EBRT e um ano após a EBRT. Primeiro prepare o meio de ensaio para a medição da função mitocondrial. Depois de preparar o meio, aqueça-o até 37 graus Celsius e ajuste o pH para 7,4.

É importante garantir que o meio de ensaio seja preparado no dia do experimento e aquecido até 37 graus antes de ajustar o PH para 7,4. Em seguida, semeie os PBMCs em cada poço para atingir 80 a 90 por cento de confluência. Em seguida, gire a placa a 200 vezes g por 2 minutos para que as células adiram ao fundo dos poços.

Após a centrifugação, remova o meio de cada poço e enxágue os poços uma vez com o meio de ensaio. Adicione 180 microlitros de meio de ensaio em cada poço, incluindo os poços de fundo. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora sem dióxido de carbono por 45 a 60 minutos.

Para reconstituir os medicamentos, adicione 252 microlitros de meio de ensaio ao medicamento para gerar uma solução estoque de 50 micromolares de oligomicina. Adicione 288 microlitros de meio de ensaio ao medicamento para gerar uma solução estoque de 50 micromolares de FCCP. Finalmente, adicione 216 microlitros de meio de ensaio para gerar uma solução estoque de 25 micromolares de antimicina a / rotenona.

Depois de reconstituir todos os três medicamentos, vortex a suspensão do medicamento por um minuto e depois diluir as soluções de trabalho. Em seguida, pipete 20 microlitros de oligomicina 10 micromolar na porta A para uma concentração final de um micromolar em cada poço. Em seguida, pipete 22 microlitros de FCCP de 10 micromolares na porta B para uma concentração final de um micromolar em cada poço.

Por fim, pipetar 25 microlitros de antimicina a/rotenona 5 micromolares na porta C até uma concentração final de 0,5 micromolar em cada poço. Em seguida, selecione o Teste de Estresse Mito no instrumento de fluxo extracelular. Em seguida, insira o cartucho do sensor seguindo o prompt do instrumento.

O instrumental executará automaticamente a calibração do sensor. Uma vez concluída a calibração, insira a placa celular do instrumento para terminar o restante do ensaio. Para preparar a solução de ensaio de proliferação celular, adicione 5,76 microlitros de corante de ácido nucleico e 28,8 microlitros de supressor de fundo a 1,405 mililitros de solução salina tamponada com fosfato.

Após o término do Teste de Estresse Mito, adicione 180 microlitros de solução de trabalho 2x diretamente no meio em cada poço. Em seguida, incube as células com a solução de ensaio de proliferação celular a 37 graus Celsius por 45 a 60 minutos. Quantifique o número de células vivas em um leitor de placas com excitação de 508 nanômetros e emissão de 527 nanômetros, seguido pela normalização dos dados de OCR.

Ao realizar a titulação do FCCP, um micromolar é a concentração ideal do medicamento que é usada para avaliar a função mitocondrial do PBMC. A investigação da respiração mitocondrial e PBMCs recém-isoladas mostra que o OCR começa a diminuir em três horas e continua até oito horas. No entanto, a respiração máxima provocada pela injeção de FCCP também não excede o nível basal de OCR.

Aqui é mostrada a normalização da função mitocondrial, onde as células são isoladas de dois indivíduos saudáveis. De fato, o OCR normalizado para células vivas representadas pelo corante de ligação ao DNA de fluorescência verde é semelhante em ambos os indivíduos saudáveis. De fato, nenhuma diferença significativa no OCR basal é observada entre um indivíduo saudável e um fatigado.

No entanto, o sujeito fatigado apresenta diminuição do consumo máximo de oxigênio e da capacidade respiratória sobressalente em comparação com o controle. Não são encontradas diferenças no consumo de oxigênio não mitocondrial e relacionado ao ATP ou na eficiência de acoplamento entre os indivíduos saudáveis e os fatigados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em quatro horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de determinar primeiro a densidade celular ideal e as concentrações de FCCP. Seguindo este procedimento, outros métodos, como o isolamento de diferentes populações de células, podem ser realizados para orientar futuras investigações mecanicistas focadas em tipos específicos de células. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo dos cuidados de suporte explorarem o papel da disfunção mitocondrial em pacientes com câncer fatigado.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a função mitocondrial e amostras clínicas que também podem ser usadas para identificar proativamente pacientes em risco de desenvolver toxicidades relacionadas ao tratamento do câncer, incluindo fadiga. Não se esqueça de que trabalhar com inibidores respiratórios como oligomicina e rotenona pode ser extremamente perigoso. Precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.