Name: Exosomes de lavagem broncoalveolar em lesão pulmonar séptico induzidas pelo lipopolissacarídeo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a isolar exossomos de lavagem broncoalveolar em modelo de lesão pulmonar aguda induzida por LPS em camundongos. Este método permite estudar a comunicação intercelular e o papel dos exossomos na inflamação pulmonar.

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Os autores declararam que não há conflito de interesses.

O protocolo global requer 2 dias, incluindo o primeiro dia da indução de sepse e isolamento do fluido BAL de animais e o segundo dia para isolamento de exosomes do mouse BALF. Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pelo Comitê de uso no centro médico do VA de Atlanta e institucional Cuidado Animal.
1. modelo de lesão pulmonar aguda séptico Mouse
<ol><li>Use 6-8 semanas - velho selvagem-tipo C57BL/6J camundongos machos (20 a 22 g de peso) para o animal modelo e executar todos os procedimentos utilizando técnicas assépticas e instrumentos. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo fórceps e a tesoura por 20 min a 121 ° C.</li>
	<li>Distribua aleatoriamente os ratos na experimental e grupo controle. Controle de ratos em um quadro de cirurgias. Trate ratos com Escherichia coli lipopolissacarídeo (LPS, 15 mg/kg) por via intraperitoneal. De acordo com o peso do corpo individual, diluir dosagens adequadas de LPS de 0,1 mL de PBS por rato, em seguida, injetar solução LPS utilizando uma seringa de 1 mL com agulha 27G e injetar uma quantidade equivalente de PBS para controle de animais.</li>
	<li>Manter os ratos na instalação de BSL2 animal, que consiste em gaiolas limpas à temperatura adequada.</li>
	<li>24h depois, eutanásia em ratos com inalação de CO2 .</li>
	<li>Selecione a área cirúrgica no centro do pescoço do mouse. Faça uma pequena incisão (cerca de 5 mm) e separar suavemente os músculos para o acesso à traqueia usando fórceps rombudo até a traqueia é exposta.</li>
	<li>Retire o fluido de BAL rato com seringa estéril de 10 mL com agulha 27G. Delicadamente, introduza a agulha na traqueia e injectar 1 mL de PBS estéril lentamente para a traqueia, depois desenhar BALF uma seringa descartável de 3 mL com agulha 27G. Após a conclusão do procedimento, descarte de seringas e agulhas em recipiente de objectos cortantes de risco biológico.</li>
	<li>Tratar de instrumentos cirúrgicos com dióxido de cloro, conforme descrito anteriormente por Chauret et al 27e em seguida esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave por 20 min a 121 ° C.</li>
</ol>2. Exosomes isolamento-série Ultracentrifugação e caracterização
<ol><li>Recolha o líquido de BAL rato nos tubos cônico de 15 mL. A colheita de células alveolares, centrifugar amostras durante 10 minutos a 1.000 g, a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para novos tubos de 15ml cónico e, em seguida, centrifugar amostras durante 30 min a 4.000 x g a 4 ° C para remover os resíduos de célula.</li>
	<li>Recolha o sobrenadante em tubos se e centrifugar amostras para 60 min a 10.000 x g a 4 ° C para remover as partículas maiores do celulares.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para novos tubos cónicos e, em seguida, filtrar as amostras através de 0,2 µm seringa-filtro para remover restantes partículas maiores.</li>
	<li>Coletar amostras em tubos de se e equilibrar os tubos. Centrifugar as amostras por 2 h a 140.000 x g a 4° C para o exosomes de Pelotas. Nota: O tamanho de exosomes varia de 20-200 nm. 0,2 µm filtro é usado para a remoção de partículas maiores que são mais de 200 nm de tamanho.</li>
	<li>Descarte os sobrenadantes suavemente. Dissolva a pelota com 100 µ l PBS ou solução de Lise e transferência exosomes amostras para tubos de 1,5 mL e armazenar a-80 ° C até o uso. Nota: Microscópio eletrônico de transmissão é recomendado para verificar exosomes isolado.</li>
	<li>Siga a amostra-padrão TEM protocolo28de processamento. Analisar amostras de exosomes usando microscopia eletrônica de transmissão e tirar fotos, escala bar 200 nm.</li>
</ol>3. preparação de miRNA e Performing miRNA-q-RT-PCR
Nota: miRNA-q-RT-PCR é aconselhável analisar o nível de expressão dos miRNAs.
<ol><li>Seguir o protocolo de isolamento padrão miRNAs e certifique-se de usar uma quantidade igual de RNAs purificadas na transcrição reversa do único-fio24.</li>
	<li>Siga o protocolo padrão de PCR em tempo real para detectar o nível de microRNA exosomal no fluido de BAL. Uso específicos iniciadores de PCR em tempo real contra miR-155 e miR-146 U6 SnRNA. Executar a reação de PCR com o aparelho PCR quantitativo e normalizar os valores de expressão para controle interno U6 snRNA. Nota: Cada grupo consiste de três vias amostras24.</li>
</ol>4. Exosomes de rotulagem e de purificação
<ol><li>Suspender o sedimento exosomes com solução de suspensão de 100 µ l em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e, em seguida, adicione 0,4 µ l do corante exosomes no outro tubo com 100 µ l da solução de suspensão.</li>
	<li>Rapidamente adicionar exosomes na solução para a solução de corante e misture completamente por pipetagem. Manter amostras por 5 min à temperatura ambiente, proteger da luz.</li>
	<li>Colocar uma coluna de rotação exossomo em um tubo de eluição de 1,5 mL. Transfira a mistura de solução para o centro da coluna exossomo de rotação.</li>
	<li>Gire a coluna por 2 min a 800 x g, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Descartar a coluna e armazenar a amostra eluted a-20 ° C até o uso.</li>
</ol>5. validação de Exosomes Up tomadas pelo destinatários células
<ol><li>Sementes de 1 x 104 12 MLE /cell em um slide de câmara de 8 poços e células de cultura a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>Adicione 10 µ l fluorescente-etiquetadas exosomes para as células. Incubar durante 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Remover os meios de cultura e lavam-se células com PBS e, em seguida, corrigir células com paraformaldeído 1% por 10 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Monte o slide no meio de montagem com DAPI.</li>
	<li>Analisar as amostras através de um microscópio de fluorescência e tirar fotos, ampliação de 40 X.</li>
</ol>6. verificação da interação entre Exosomes e células destinatários
<ol><li>Semente de 2 x 105 MLE12/poço em uma placa de cultura de 12 poços, contendo meio de cultura apropriado e células de cultura a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>Adicionar 20 µ g exosomes de fluido do mouse BAL para células MLE12 e configurar repetições por grupo experimental.</li>
	<li>24h depois, lavam-se células com PBS e adicionar tampão de Lise 600 µ l em poço. Homogeneizar a placa e coletar amostras de Lise no tubo de 1,5 mL com pipeta.</li>
	<li>Siga o protocolo de isolamento de RNA total padrão e protocolo de transcrição reversa do cDNA, completar a transcrição reversa de cDNA da único-Costa29.</li>
	<li>Siga o protocolo padrão de PCR em tempo real para detectar o nível de expressão do mRNA em células destinatário29. Uso específicos iniciadores de PCR em tempo real contra o TNF-α, IL-6 e ZO-1. Executar as reações de PCR com o aparelho PCR quantitativo e normalizar os valores de expressão para o controle interno GAPDH. Nota: Cada grupo consiste de amostras de três vias.</li>
</ol>

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Este trabalho foi apoiado pela revisão de mérito VA 2I01BX001786-06A1 financiamento para RS.

Modelos de mouse de doenças são comumente usados para avaliar a função fisiológica de genes específicos e para reduzir o custo de experimentação2. A lesão pulmonar aguda séptico descrita aqui imita a resposta inflamatória nos seres humanos com SDRA. Este modelo é relevante para investigar a patogénese molecular, desenvolvimento de biomarcadores e testar potenciais novas terapias5.
Sistemas de co-cultura são relevantes para estudos em vivo</em...

ALI e Sara é as formas de vida-ameaçando de insuficiência respiratória com hipoxemia grave causada por edema pulmonar não-cardiogênico, que afeta cerca de 1 milhão pessoas no mundo anualmente1. A etiologia da SDRA inclui lesão direta para os pulmões de infecções ou aspiração e uma variedade de insultos indiretas. Na última década, tem havido uma maior compreensão da patogênese molecular da SDRA, no entanto, tratamentos alvo específicos para SDRA estão ainda a ser desenvolvido,2,3.
Foram desenvolvidos vários modelos animais de lesão pulmonar aguda que fornecem uma ponte para traduzir terapias experimentais para estudos humanos4,5. Modelos comumente usados incluem a instalação local do ácido oleico, bactérias, LPS e bleomicina. Outras abordagens incluem isquémia-reperfusão, punção cecal ligadura, lesão de estiramento induzida pela ventilação mecânica, hiperóxia ou administração sistémica de bactérias e LPS-5. Esses modelos fornecem um sistema biológico útil para testar hipóteses clínicas e para o desenvolvimento de terapias potenciais. Para simular a SDRA humana, modelos animais devem reproduzir inflamação e lesão aguda para as células epiteliais e endoteliais com defeitos na função de barreira nos pulmões.
Exosomes são vesículas de membrana com 20-200 nm de diâmetro, cujo conteúdo molecular contém proteínas, DNA, RNA e lipídios, e facilitar a comunicação intercelular no microambiente tecido via transferência de composição molecular. Exosomes são secretadas por vários tipos de células, como células endoteliais, células epiteliais, células musculares lisas e células tumorais e existem em fluidos do corpo humano. Estudos indicam que a exosomes regular conversas cruzadas entre células do estroma e células do sistema imunológico durante doenças inflamatórias, infecciosas e estéril, e sua liberação anormal parece ser regulada por vários estímulos naturais e experimentais durante fisiológica e processos patológicos6. Essa rede de comunicação pode desempenhar um importante papel na patogênese de doenças pulmonares e pode afetar a progressão fisiopatológicos7,8. 18-22 como nucleotídeos RNAs não-codificantes, miRNAs existem em ambos os tecidos e fluidos corporais, plasma, soro e modulam a expressão de RNAm no nível pós-traducional9,10.
MiRNAs embalados em exosomes influenciam a diferenciação e função dos vários tipos de células, e níveis excessivos são associados com uma variedade de doenças, incluindo câncer, doenças pulmonares, obesidade, diabetes e doença cardiovascular11, 12,13,14,15,16. Entrada em células da destinatários e vaivém de miRNAs exosomal facilitar a comunicação intercelular, modificando a hemostasia do microambiente17,18. Lesão pulmonar aguda é um processos complexos, envolvendo vários tipos de células com extensa comunicação intercelular através de exosomes8. miR-155 e miR-146 compartilham o mecanismo regulador transcricional comum e contribuam para a resposta inflamatória e a tolerância imunológica19,20. Estudos recentes indicam que ambos modulam a resposta inflamatória via exosomal miRNAs vaivém entre células do sistema imunológico21. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes moduladora efeitos de miRNAs exosomal na resposta alveolar a endotoxina permanecem pouco claras, sem dúvida, o potencial relevância clínica e translacional implicação mérito mais investigações.
Modelos de co-cultura estão sendo empregados para definir a interação dos tipos de célula específica no complexo ambiente, tais como inflamação e câncer22,23. Estas plataformas fornecem uma estratégia alternativa para interrogar conversas cruzadas entre tipos de células, particularmente por células imunes e estruturais.
Intratraqueal, aerossol, intraperitoneal ou sistêmica administração de LPS são amplamente utilizados para induzir a lesão de pulmão experimental a24,25,26e mostraram para induzir permeabilidade endotelial e epitelial defeitos de fabricação. Aqui usamos LPS intraperitoneal para induzir um fossa séptico modelo de lesão pulmonar aguda em camundongos. Dentro de 24 horas da administração intraperitoneal de LPS, permeabilidade defeitos são induzidos nos pulmões com recrutamento de células inflamatórias. Além disso, mostramos que exosomes de BAL contêm miRNA-155 e miR-146, e exosomes de fluido BAL induzir a expressão de citocinas pró-inflamatórias em pilhas epithelial do destinatários, incluindo IL-6 e TNF-α. Estes dados são os primeiros a mostrar que os miRNAs exosomal são secretadas no BAL neste modelo de lesão pulmonar aguda séptico.

<table><tbody><tr><td>lipopolissacarídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Escherichia coli 055:B5</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH7.2(1X)</td><td>Life technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>kit de isolamento de miRNA mirVana</td><td>Thermo Fisher</td><td>449774</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>mmu-miR-155 (002571) primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-146a (000468) primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>U6snRNA primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;( Mm00443258_m1 ) primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 (Mm00446190_m1&nbsp; &nbsp; )primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 (Mm00493699_m1&nbsp; )primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>meio essencial mínimo (MEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11095-072</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Trysina-EDTA(0,05%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Os exossomos foram marcados com PKH67 através de PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit&nbsp;</td>Colunas de Rotação de Exossomos <td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>(MW3000)</td><td>Thermo Fisher</td><td>4484449</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrífuga&nbsp;</td>Tubos de centrífuga ultra-claros <td>Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 Sistema de PCR em tempo real rápido</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópios eletrônicos de transmissão (TEM)</td><td>JEOL Ltd</td><td>120 kV TEM</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Olympus BX41 Olympus</td><td></td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

exosomes de lavagem broncoalveolar em lesão pulmonar séptico induzidas pelo lipopolissacarídeo

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Lesão pulmonar aguda (LPA) e síndrome da angústia respiratória (Sara) representam um grupo heterogêneo de doenças pulmonares, que continua a ter uma alta taxa de morbidade e mortalidade. A patogénese molecular de ALI está sendo melhor definido; no entanto, devido à natureza complexa da doença terapias moleculares ainda precisam ser desenvolvido. Aqui nós usamos um modelo de rato induzida de lipopolissacarídeo (LPS) de lesão pulmonar aguda séptico para delinear o papel do exosomes na resposta inflamatória. Usando este modelo, fomos capazes de mostrar que os ratos expostos a LPS intraperitoneal secretam exosomes no líquido de lavagem (BAL) bronco-alveolar dos pulmões que são embalados com miRNA e citocinas que regulam a resposta inflamatória. Ainda mais usando um sistema de modelo co-cultura, mostramos que exosomes lançados de macrófagos interromper a expressão de proteínas de junção apertada nas células epiteliais brônquicas. Estes resultados sugerem que 1) conversas cruzadas entre inatas células imunes e estruturais através do vaivém exosomal contribuem para a resposta inflamatória e rompimento de barreira estrutural e 2) segmentação destes miRNAs pode fornecer uma nova plataforma para tratar ALI e SDRA.

Para induzir lesão pulmonar séptico, os ratos foram tratados com LPS intraperitoneal (15 mg/kg). Dentro de 24 horas da administração de LPS, neutrofílico influxo foi visto nos pulmões, conforme mostrado na figura 1A. Fluido de mouse BAL foi desenhado, seguido pelo isolamento e purificação de exosomes. Morfologia do LBA exosomes foi confirmada por microscopia eletrônica de transmissão (figura 1B).
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Os ratos expostos ao LPS intraperitoneal secretam exosomes no líquido de lavagem (BAL) bronco-alveolar que são embalados com miRNAs. Usando um sistema de co-cultura, mostramos que exosomes lançados no fluido BAL perturbará a expressão de proteínas de junção apertada nas células epiteliais brônquicas e aumentar a expressão de citocinas pró-inflamatórias que acentuam a lesão pulmonar.

Exosomes de lavagem broncoalveolar em lesão pulmonar séptico induzidas pelo lipopolissacarídeo

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

O objetivo geral deste experimento é delinear o papel dos exossomos nas respostas inflamatórias em um modelo de camundongo com lesão pulmonar séptica aguda induzida por LPS. Portanto, esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave relacionadas à conversa cruzada celular na lesão pulmonar aguda e na síndrome do desconforto respiratório agudo. Especialmente a comunicação intercelular dentro do microambiente alveolar via transporte de exossomos.A principal vantagem desta técnica é que ela permite o isolamento e caracterização de exossomos de lavagem broncoalveolar altamente purificados derivados de camundongos sépticos tratados com endotoxina com lesão pulmonar aguda. Demonstrando o procedimento está o Dr. Zhihong Yuan e o Dr. Chetna Bedi. Para começar, carregue uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 27 com 0,1 mililitros de LPS e PBS por mouse e prenda manualmente o primeiro camundongo C57 preto 6J macho de seis a oito semanas.Entregue o LPS intraperitonealmente e retorne o animal à sua gaiola. 24 horas depois, faça uma incisão de cinco milímetros no centro do pescoço do primeiro animal e use uma pinça romba para separar suavemente os músculos para expor a traqueia. Em seguida, insira suavemente uma agulha de calibre 27 presa a uma seringa estéril de 10 mililitros na traqueia e injete um mililitro de PBS estéril.Em seguida, substitua imediatamente a seringa de 10 mililitros por uma seringa de três mililitros equipada com uma nova agulha de calibre 27. Aspire o fluido de lavagem broncoalveolar ou BOLF e adicione o BOLF a um tubo cônico de 15 mililitros devidamente rotulado no gelo. Para isolar os exossomos, centrifugue as amostras de BOLF e transfira os sobrenadantes para novos tubos de 15 mililitros.Centrifugue as amostras novamente e transfira os sobrenadantes para tubos de ultracentrífuga para remover as partículas celulares maiores. Transfira os sobrenadantes para novos tubos cônicos e carregue as amostras em filtros de seringa de 0,2 mícron para remover quaisquer partículas maiores restantes. Adicione as amostras filtradas a novos tubos de ultracentrífuga para peletar os exossomos.Descarte cuidadosamente os sobrenadantes e ressuspenda os pellets em 100 microlitros de PBS por tubo. Em seguida, transfira as amostras de exossomos para tubos individuais de 1,5 mililitro para seu armazenamento de menos 80 graus Celsius. Para purificar os exossomos, adicione 0,4 microlitros do corante exossômico apropriado a um tubo contendo 100 microlitros de solução de suspensão por amostra e adicione rapidamente uma amostra de exossomo descongelada a cada tubo de corante.Misture bem os exossomos com o corante e incube as amostras em temperatura ambiente por cinco minutos, protegidas da luz. No final da incubação, coloque uma coluna de rotação do exossomo por amostra em um tubo de ilusão de 1,5 mililitro e transfira as soluções do exossomo para o centro de cada coluna de rotação. Em seguida, centrifugue as amostras, descarte as colunas e armazene as amostras aludidas a menos 20 graus Celsius.Para medir a absorção de exossomos pelas células receptoras, primeiro semeie uma vez 10 para o quarto epitelial do pulmão de camundongo 12 células em 0,5 mililitros de meio em cada poço de uma lâmina de câmara de oito poços para uma cultura de 16 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Após o descongelamento, adicione 10 microlitros dos exossomos marcados com fluorescência purificada a cada poço e retorne as culturas de células à incubadora por uma hora. No final da incubação, lave as células com PBS e fixe cada co-cultura com 1% de paraformaldeído por 10 minutos em temperatura ambiente.Remova o meio e, em seguida, monte a lâmina com meio complementado com DAPI e obtenha imagens das amostras por microscopia de fluorescência com uma ampliação de 40 vezes. Para verificar a interação do exossomo com as células receptoras, semeie duas vezes 10 até o quinto epitelial do pulmão do camundongo 12 células em dois mililitros de meio por poço em uma placa de cultura de 12 poços contendo o meio de cultura apropriado para uma incubação de duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No final da incubação, adicionar 20 microgramas de exossomas a três poços de células epiteliais por grupo experimental e devolver as células à incubadora.Após 24 horas, remova o meio, lave as células com PBS e adicione 600 microlitros de tampão de lise a cada poço com agitação suave. Em seguida, transfira todo o conteúdo de cada poço para tubos individuais de 1,5 mililitro e analise as amostras de acordo com os protocolos padrão de PCR em tempo real. Dentro de 24 horas após a administração de LPS, o influxo neutrofílico é observado nos pulmões dos animais tratados com LPS.Após seu isolamento e purificação, como acabamos de demonstrar, a presença de exossomos no BOLF de animais com lesão pulmonar séptica pode ser confirmada por microscopia eletrônica de transmissão. A expressão de micro RNA pró-inflamatório selecionado é significativamente aumentada em exossomos de fluido broncoalveolar de animais tratados com LPS em comparação com camundongos tratados com PBS controlado. Os exossomos tratados com LPS são absorvidos pelas células epiteliais do bronquíolo de camundongo, conforme evidenciado pela co-localização de exossomos marcados com corante fluorescente com células marcadas com DAPI após uma hora de co-cultura.A expressão do mediador pró-inflamatório é significativamente aumentada em células epiteliais co-cultivadas com exossomos de animais tratados com LPS em comparação com co-cultura com exossomos de camundongos tratados com PBS controle. Além disso, as células tratadas com exossomos de camundongos tratados com LPS demonstram uma expressão significativamente atenuada de zonula occludens em comparação com os controles, indicando uma integridade celular menos intacta após a co-cultura de exossomos tratada com LPS. A injeção intraperitoneal de LPS, a extração da lavagem broncoalveolar e a delegação de exossomos da lavagem broncoalveolar podem ser concluídas em um período de tempo relativamente curto.Após este procedimento, outros métodos, como co-cultura de exossomos e células epiteliais, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a conversa cruzada entre células inatas e estruturais no microambiente alveolar pulmonar. A conversa cruzada entre células imunes e estruturais inatas por meio do transporte de exossomos contribui para a resposta inflamatória e para a ruptura da barreira estrutural, sugerindo que o direcionamento de micro-RNA exossômico pode fornecer uma plataforma normal para o tratamento de lesão pulmonar aguda e síndrome do desconforto respiratório agudo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir lesão pulmonar séptica em camundongos, isolar o fluido de lavagem broncoalveolar de camundongos, isolar exossomos do fluido de lavagem e usar um modelo de co-cultura para interrogar a conversa cruzada intracelular.Não se esqueça de que trabalhar com LPS pode ser perigoso e que precauções como usar o equipamento de proteção individual adequado devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

bronchoalveolar-lavage-exosomes-lipopolysaccharide-induced-septic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

A resposta imune do hospedeiro à infecção do agente patogénico é um processo fortemente regulado. Utilizando um modelo de exposição do pulmão lipopolissacarídeo em ratos, é possível realizar avaliações de alta resolução dos complexos mecanismos associados à patogênese da doença.

A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos

Descreve-se um método para a indução de inflamação pulmonar neutrofílica desafio por aerossol para lipopolissacarídeo por nebulização, para modelar a lesão pulmonar aguda. Além disso, também são descritas as técnicas cirúrgicas básicas para isolamento pulmonar, intubação traqueal e lavado bronco-alveolar.

Um método para gerar Pulmonar Neutrofilia Usando Aerosolized Lipopolysaccharide

lavagens pulmonares repetidas em porcos anestesiados induzir lesão pulmonar que assemelha-se os principais aspectos da síndrome da angústia respiratória aguda humana (ARDS). Para este efeito, os pulmões são repetidamente lavados com solução salina a 0,9% a 37 ° C. O objetivo do protocolo é uma atenuação reprodutível de trocas gasosas e hemodinâmica para a investigação em ARDS.

induzida por lavagem de surfactante Esgotamento em porcos como modelo da Síndrome da Angústia Respiratória Aguda (SARA)

O estado de saúde do pulmão é refletido pelo tipo e número de células imunes que estão presentes nos bronquíolos do pulmão. Descrevemos uma técnica de lavagem broncoalveolar que permite o isolamento e estudo de células não aderentes e fatores solúveis do trato respiratório inferior de camundongos.

Lavagem Broncoalveolar de Pulmões Murinos para Analisar a Infiltração de Células Inflamatórias

Aqui, descrevemos dois protocolos de isolamento de vesículas extracelulares, centrifugação de ultrafiltração e ultracentrifugação com centrifugação gradiente de densidade, para isolar vesículas extracelulares de amostras de fluido de lavagem broncoalveolar murino. As vesículas extracelulares derivadas do líquido de lavagem broncoalveolar murino por ambos os métodos são quantificadas e caracterizadas.

Isolamento das vesículas extracelulares de fluido broncoalveolar murino, usando uma técnica de centrifugação de ultrafiltração

É apresentado aqui um procedimento passo a passo para induzir ferimento de pulmão agudo nos ratos pela instilação intratraqueal direta do lipopolissacarídeo e para executar a análise de FACS de amostras de sangue, de líquido broncoalveolar do lavagem, e de tecido do pulmão. A invasividade mínima, o manuseio simples, a boa reprodutibilidade e a titulação da severidade da doença são vantagens dessa abordagem.

Induzindo lesão pulmonar aguda em camundongos por instilação de lipopolissacárido intratraqueal direto

Ozônio combinado e endotoxina bacteriana exposição de camundongos mostram morte celular generalizada, incluindo a de neutrófilos. Observamos adaptações celulares como interrupção da lamellipodia citoesquelética, aumento da expressão celular da complexa subunidade de synthase V ATP β e angiostatina na lavagem bronco-alveolar, supressão da resposta imune pulmonar e recrutamento retardado de neutrófilos.

Visualizando adaptações celulares pulmonares durante a lesão pulmonar aguda de ozônio e LPS induzidas por LPS

Neste estudo, uma técnica não invasiva de instilação endotraqueal demonstrou desenvolver ALI em ratos usando um laringoscópio básico para garantir a entrega precisa de LPS aos pulmões. O LPS é injetado por meio de um tubo endotraqueal usando um laringoscópio. A magnitude da lesão pulmonar é avaliada em vários momentos.

Administração endotraqueal não invasiva de lipopolissacarídeo para induzir lesão pulmonar aguda em roedores

Este protocolo descreve um método para eficazmente transfectar siARN em citotrofoblastos vilosidades humanos isolados de fresco utilizando formação de microporos e identificação de complexos de ADN-proteína nestas células. As células transfectadas pode ser monitorado por análises Western blot e EMSA durante o tempo de cultura de 4 dias.

As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos

Aprenda a isolar exossomos de lavagem broncoalveolar em modelo de lesão pulmonar aguda induzida por LPS em camundongos. Este método permite estudar a comunicação intercelular e o papel dos exossomos na inflamação pulmonar.

Exosomes de lavagem broncoalveolar em lesão pulmonar séptico induzidas pelo lipopolissacarídeo

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