Name: Fraccionamento subcelular de espécimes Gastrointestinal frescos e congelados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprenda o fracionamento subcelular de biópsias intestinais frescas e congeladas para separar proteínas citoplasmáticas e nucleares. Este método reprodutível facilita estudos de localização proteica em pesquisas gastroenterológicas.

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Os autores reconhecem a assistência de Ander Lopez e Miren Telletxea para gravação e edição de vídeo. ACR é financiado por uma bolsa de Ikerbasque e um projeto de pesquisa do Asociación de Celiacos de Madrid (ACM). Orc é financiado pelo projeto ISCIII-PI16/00258 e co-financiado pela União Europeia FEDER/FSE "Uma maneira de tornar a Europa". É é financiado por uma concessão do projeto de pesquisa 2015111068 do departamento de saúde Basco. IRG e AJM são suportados pelo companheirismo predoctoral subvenções provenientes da UPV/EHU e o departamento de educação de Basco, respectivamente.

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de ética Cruces University Hospital e as análises foram realizadas após consentimento informado foi obtido de todas as disciplinas ou seus pais.
1. biópsia coleção
Nota: Amostras de biópsia do duodeno distal de pacientes são obtidas durante endoscopia de rotina de diagnóstico, gerenciamento de biópsias que variam entre 2 e 10 mg de peso. Uma biópsia tecido é um tecido complexo composto por diferentes tipos de células incluindo células epiteliais, imunes e endoteliais. Gastroenterologistas clínicas realizar a endoscopia elaboradas diretrizes clínicas.
<ol><li>Coloque a biópsia em um papel de filtro estéril só depois da endoscopia.</li>
	<li>Use fórceps para transferir as biópsias em tubos de 1,5 mL, embeba-os com PBS e colocá-lo em um criotubo.</li>
	<li>Manter os tubos em gelo até a chegada no laboratório.<ol>
<li>Inicie o processamento de biópsias frescas imediatamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para biópsias congeladas, flash congelar a biópsia contendo tubos e armazenar em nitrogênio líquido até o uso. Nota: É importante manter a amostra congelada até que o buffer complementado frio 1 é adicionado.</li>
</ol>2. tampão preparação
Nota: Antes de começar, complementar os buffers como segue.
<ol><li>Adicionar 1 mM DTT (concentração final) e protease e fosfatase inibidor cocktail (1 x concentração final) para o buffer hipotônica hipertônico e 1 tampão 2 (tabela 1).<ol>
<li>Prepare-se 1,5 mL de tampão 1 e 150 µ l de tampão de 2 por amostra. DTT impede a oxidação das amostras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare núcleos de tampão de lavagem, acrescentando 1% de detergente (nonilo phenoxypolyethoxylethanol) a uma concentração final de 0,1% para a reserva já completada 1. Prepare-se 1 mL de tampão de lavagem núcleos por amostra.</li>
</ol>3. biópsia homogeneização
<ol><li>
Biópsias de frescas
	<ol>
<li>Coloque o pilão descartável no misturador motorizado. Certifique-se de que o pilão atinge o fundo do tubo.</li>
		<li>Tirar a biópsia do criotubo e colocá-lo em um tubo de 1,5 mL com uma ponta da pipeta.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de tampão completado 1 para o tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Homogeneizar a biópsia com o pilão, até que o tecido é completamente interrompido e mantê-lo no gelo.</li>
		<li>Uma vez que todas as biópsias são homogeneizadas proceda com o passo 4. Nota: Macacos descartáveis devem ser alterados entre biópsias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biópsias congeladas Atenção: Cuidado com nitrogênio líquido; contato de nitrogênio líquido com a pele ou olhos pode causar lesões graves de congelação. Protege as mãos e os olhos sempre quando se trabalha com nitrogênio líquido.<ol>
<li>Leve o nitrogênio líquido em uma caixa para armazenar o cryotubes obtido o tanque de nitrogênio.</li>
		<li>Encontrar a biópsia no tanque de nitrogênio e coloque o criotubo na caixa com o nitrogênio líquido. Repita este passo para todas as biópsias.</li>
		<li>Transfira a biópsia do criotubo para um tubo de 1,5 mL. Nota: Biópsias serão anexadas ao tubo congelado. Empurre a biópsia com uma ponta de pipeta estéril para que ele irá desanexar do tubo.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de tampão completado 1.</li>
		<li>Homogeneizar o tecido usando o pilão e almofariz, até que o tecido é completamente interrompido, manter a temperatura a 4 ° C ao longo de todo o procedimento. Nota: Não deixe biópsias descongelar antes de adicionar o buffer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. o citoplasma isolamento
<ol><li>Incube a biópsia homogeneizada no gelo por 10 min.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de 1% de detergente (nonilo phenoxypolyethoxylethanol) para cada amostra a uma concentração final de 0,05%. Nota: Células vão inchar e explodir por lise osmótica como o detergente vai interromper a membrana celular.</li>
	<li>Incube no gelo por 5 minutos.</li>
	<li>Vórtice brevemente e centrifugar 400 x g a 4 ˚ c por 2 min.</li>
	<li>Após a utilização do vortex, remover o sobrenadante e transferir para um novo tubo limpo 1,5 mL; Esta será a fração citoplasmática. Não jogue fora a pelota.</li>
</ol>5. nuclear isolamento
<ol><li>Resuspenda o pellet da etapa anterior com 200 µ l de tampão de lavagem de núcleos.</li>
	<li>Centrifugar o tubo por 2 min em 400 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e repita o procedimento de lavagem mais duas vezes. Nota: As lavagens irão remover a contaminação citoplasmática na fração nuclear.</li>
	<li>Após a terceira lavagem, resuspenda o pellet em 100 µ l de tampão de 2.</li>
	<li>Agitar vigorosamente a amostra no 4 ˚ c por 30 min. como alternativa, incubar a amostra em gelo e vórtice cada 5 min.</li>
	<li>Após agitação, centrifugar a amostra durante 10 minutos na velocidade máxima (> 12.000 x g) e 4 ° C.</li>
	<li>Após a utilização do vortex, transferi o sobrenadante para um novo 1.5 limpo. tubo mL. Esta será a fração nuclear.</li>
</ol>6. quantificação da proteína
Nota: Quantificar as proteínas com um kit de ensaio de proteína do ácido (BCA) do bicinchoninic. A concentração de proteínas em frações irá variar entre 0,5 e 5 µ g / µ l, sendo menor na fração nuclear (ver tabela 2 para as concentrações de proteína resultantes de biópsias de 2mg).
<ol><li>Preparar uma curva padrão com o seguinte de montantes (µ g) de albumina de soro bovino (BSA)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>Prepare os reagentes necessários para a utilização de 100 µ l de mistura final do BCA por amostra.</li>
	<li>Pipetar 2 µ l de cada fração de proteína em uma placa de 96 bem, adicione a mistura do BCA e siga as instruções do fabricante para a leitura.</li>
</ol>

<ol><li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li>
<li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreedy%2C+VR+%22Methods+in+disease+investigating+the+gastrointestinal+tract%22">Methods in disease investigating the gastrointestinal tract</a>. , Greenwich Medical Media. (1998).</li>
<li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases%3A+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li>
<li>Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling%2C+cryopreservation%2C+extraction%2C+and+use+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+oncologica+%28Stockholm%2C+Sweden%29%22%5BJournal%5D)">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li>
<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li>
<li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li>
<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li>
<li>Börner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li>
<li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+disease%3A+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+clinical+practice.+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li>
<li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCutler%2C+P+%22Protein+purification+protocols%22">Protein purification protocols</a>. , Humana Press. (2004).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bicinchoninic+Acid+%28BCA%29+Assay+for+Protein+Quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22%5BJournal%5D)">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li>
<li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li>
<li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo descrito aqui é usado para o fraccionamento nuclear e citoplasmático de biópsias intestinais. As proteínas purificadas não são desnaturadas e pode ser usadas não apenas na análise ocidental do borrão como mostrado na Figura 2 e 3 , mas também em ensaios que exigem nativo-dobrado proteínas tais como imunoprecipitação, ensaio de turno de mobilidade electrophoretic (EMSA) ou eletroforese em gel de poliacrilamida nativo (página).
O método ...

As proteínas participam de quase todas as funções biológicas, dentro de uma célula e qualquer variação em sua estrutura, quantidade ou localização pode levar a um cenário de patogenicidade. Métodos de fracionamento de amostras de tecido são uma abordagem útil para reduzir a complexidade da doença relacionadas com análises de proteína. Alguns estudos usam informações de localização de proteínas ou enriquecem uma proteína de um compartimento celular específico, por um protocolo para reprodutível fraccionamento das proteínas intactas, é útil para responder a certas perguntas biológicas. Determinar a Localização subcellular das proteínas e monitorando sua redistribuição compartimental ou interações no basal e condições de doença ajudará a identificar a doença relacionadas com diferenças funcionais1,2. Assim, este método visa reproducibly fractionate biópsias do tecido intestinal, frescas e congeladas, em compartimentos subcellular citoplasmáticos e nucleares.
Amostras de biópsia intestinal são rotineiramente obtidas durante os procedimentos de endoscopia3 (Figura 1) e podem ser efetivamente usadas para quantificação de proteína ou estudos de imunoprecipitação. Desde que as amostras de tecido da intestinal epiteliais conterá proteínas que podem estar diretamente envolvidas na patogênese doença4, amostras de biópsia intestinal são uma fonte muito valiosa para a identificação de sucesso de específica da doença intestinal proteínas. Amostras de tecido congelado, paciente armazenado juntamente com as informações clínicas são recursos úteis para análise de proteínas, e uma preparação de amostras simples e reprodutível é uma questão-chave para fornecer informações compartimental célula usando quantidades limitantes de congelados tecido de5.
Existem vários kits disponíveis comercialmente para a separação de frações celulares, mas estes são mais caros e geralmente mais demorado do que o protocolo aqui apresentado. Protocolos com base em várias etapas centrifugação gradiente e gradientes contínuas também têm sido usados anteriormente para o fraccionamento de diversos compartimentos celulares em diferentes tecidos6,7. No entanto, manter a consistência dos gradientes contínuos é muitas vezes uma tarefa difícil. Protocolos semelhantes baseados o lysis sequencial das membranas têm sido descritos anteriormente mas geralmente precisam de mais de dois buffers e nas mãos na hora é mais8 .
Quando as amostras de tecido de fraccionamento, tenha em mente que o tecido amostras presentes célula-célula e célula-matriz interações que são não presentes em culturas de células e importante quando proceder à extração de proteínas. A repartição adequada entre células e matriz extracelular, sem afetar a qualidade da proteína será um fator crítico do tecido intestinal da proteína isolamento9. Neste protocolo, célula-célula e célula-matriz de contatos primeiro são quebrados, liberando as células e permitindo que o buffer alcançar as células individuais. Para evitar a proteína-compartimento de mistura antes de fracionamento, a repartição dos contatos deve ocorrer sem alterar a integridade das células ou as membranas nucleares.
Devido o enriquecimento de várias proteases na mucosa intestinal10, é importante controlar a degradação proteica durante a extração. Para minimizar a potencial degradação proteica, inibidor de protease múltipla deve ser incluído nos buffers de extração de proteínas. Além disso, se extratos vão ser utilizados para os ensaios funcionais, é essencial para evitar a desnaturação das proteínas ou proteólise, pois isto causará uma perda de proteína atividade11. Para este efeito, o protocolo é realizado a 4 ° C e fluoreto de phenylmethylsulfonyl fresco (PMSF) é adicionado aos buffers em uma concentração final de 0,1 mM apenas antes da utilização para inibir ainda mais a proteólise.
O primeiro passo no fracionamento celular é rompimento de tecido e lise celular. Como mencionado anteriormente, o objetivo é desagregar as células e quebra-los abrir com o mínimo de dano. Amostras de tecido intestinal devem ser homogeneizadas, e as células lysed para alcançar a máxima quebra da membrana celular. Neste protocolo, utilizamos um misturador motorizado pilão para quebrar o tecido intestinal que é homogeneizado em poucos segundos por meio de ação de alta velocidade num Vortex. Após a homogeneização, células do tecido são incubadas em um buffer hipotônica que vai estourar a membrana da célula, mas irá manter os núcleos intactos, seguido pela adição de um detergente não-desnaturação (nonilo phenoxypolyethoxylethanol) e um vórtice curto para separar os núcleos da fração citoplasmática. Após a remoção do citoplasma, a membrana do núcleo celular é de ruptura em um buffer hipertônico com agitação.
O método apresentado aqui é um método adequado para o fraccionamento subcelular de frescos e congelados de biópsias intestinais que foram obtidos durante os procedimentos endoscópicos e intervalo entre 2 e 10 mg de peso. O protocolo é fácil e pode ser reproduzido e pode ser realizado utilizando equipamentos básicos de laboratório e reagentes em menos de uma hora.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Inibidores de proteinase e fosfatase</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>BCA ensaio</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Kit de quantificação de proteínas</td></tr><tr><td>Pilões de plástico descartáveis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador Dounce</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>Shacker</td><td>IKA</td><td>MS3 basic</td><td></td></tr></tbody></table>

fraccionamento subcelular de espécimes gastrointestinal frescos e congelados

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

O propósito do presente protocolo é para fracionar o tecido intestinal humano obtido por endoscopia em compartimentos nucleares e citoplasmáticos para a análise de localização de proteínas específicas ou complexos de proteínas em Estados diferentes de tecido (ou seja, saudável versus doença). Este método é útil para o fraccionamento de ambas as amostras de tecido intestinal frescos e congelados; é facilmente acessível para todos os laboratórios e não demorado.

A Figura 1 mostra uma coloração de eosina hematoxilina de uma seção de biópsia intestinal com vilosidades intactas e estruturas de cripta.
Resultados representativos de fracionamento nuclear e citoplasmático, usando este protocolo são mostrados nas figuras 2 e 3. No experimento mostrado na Figura 2, um fresco (Fh) e um congelado (Fz) bi...

Aqui, apresentamos um protocolo para executar um fracionamento celular simples para a separação subcelular de proteínas citoplasmáticas e nucleares em humanas frescas e congeladas de biópsias intestinais.

Fraccionamento subcelular de espécimes Gastrointestinal frescos e congelados

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

O objetivo do protocolo a seguir é gerar frações subcelulares a partir de amostras gastrointestinais congeladas ou frescas. As proteínas participam de quase todas as suas funções biológicas dentro de uma célula. Em qualquer variação, eles são extraídos entre um local pode levar a um cenário patogênico.Alguns estudos aproveitarão a avaliação da localização da proteína ou precisarão invadir uma proteína de um compartimento celular específico. Portanto, o fracionamento reprodutível de proteínas intactas é importante a esse respeito. Amostras de biópsia intestinal podem ser obtidas recentemente durante procedimentos de endoscopia e podem ser efetivamente usadas para quantificação de proteínas ou estudos de imunoprecipitação.Amostras clínicas intestinais são um recurso importante para a identificação eficaz de proteínas específicas de tecidos e doenças. O nome deste método é fracionar o tecido intestinal humano obtido por endoscopia em compartimentos nucleares e citoplasmáticos para a análise de localização de uma proteína específica ou complexos proteicos. Este método serve para o fracionamento de ambos.Primeiro, nossa biose intestinal congelada acontece. Para o procedimento de tecido congelado, congele as amostras imediatamente após a extração e armazene em nitrogênio líquido até o uso. É importante manter a amostra congelada até que o tampão de homogeneização a frio seja adicionado.Para amostras frescas, transfira a biópsia para um microtubo de 1,5 mL e mantenha no gelo até que o procedimento seja iniciado. Amostras de tecido congelado são geralmente fixadas na parede do criotubo, o tecido pode ser liberado usando uma ponta de pipeta estéril antes de transferir para um microtubo cônico de 1,5 mL. Adicione 200 mL de tampão um suplementado com DDT e inibidores de fosfatase e protease ao microtubo contendo a amostra.Homogeneizar a amostra com um recipiente até que o tecido esteja completamente rompido e mantê-la no gelo. Incubar a amostra no gelo durante 10 minutos. Adicione 10 mL de detergente a 1% a cada amostra até uma concentração final de 0,05% para romper a membrana celular.Incube no gelo por cinco minutos. Agitar brevemente e centrifugar a 400 g a 4 graus durante dois minutos. Remover o sobrenadante que contém a fracção proteica citoplasmática e transferi-lo para um tubo limpo.Não descarte o pellet. Ressuspenda o pellet em 200 mL de tampão dois suplementado com DDT e inibidores de fosfatase e protease. Centrifugue a 400 g por 2 minutos.Rejeitar o sobrenadante e repetir o procedimento de lavagem mais duas vezes. Após a terceira lavagem, suspenda novamente o pellet em 100 mL de tampão dois. Agite vigorosamente a 4 graus por 30 minutos.Centrifugue a 4 graus na velocidade máxima por 10 minutos. Transferir o sobrenadante que contém a fracção de proteínas nucleares para um tubo limpo. As frações citoplasmáticas e nucleares estão agora prontas para quantificação e experimentos a jusante.A mucosa intestinal é rica em várias proteases e, portanto, a degradação da proteína deve ser controlada durante a extração para minimizar a degradação da proteína, vários inibidores de protease devem ser incluídos nos tampões de extração de proteínas. Além disso, os extratos devem ser usados para ensaios adicionais. É essencial evitar a desnaturação ou proteólise de proteínas.Como isso causa uma perda de atividade proteica. Como consequência dos contatos célula-célula e célula-matriz presentes nos tecidos, algumas modificações devem ser implementadas nos protocolos de extração de proteínas rotineiramente utilizados com culturas de células. A separação das células da matriz transcelular sem afetar a qualidade da proteína é um fator crítico para o isolamento eficiente das proteínas do tecido intestinal.À esquerda, a tabela mostra as concentrações de proteína de cada uma das frações das amostras de biópsia de 2 mL frescas e congeladas. As concentrações são mostradas em microgramas por microlitro. Neste experimento, uma amostra fresca e congelada foram fracionadas simultaneamente seguindo o protocolo.E um Western blot foi realizado usando 20 mg de cada amostra. Para verificar a pureza das frações, HSP90 e Tubulina foram utilizadas como controles citoplasmáticos e HDAC1 e H3 como controles nucleares. Como pode ser observado, HSP90 e Tubulina estão localizados principalmente no citoplasma e HDAC1 e H3 no núcleo com mistura muito residual entre as duas frações.Para ver se o protocolo afeta a morte celular, também detectamos CASP3. Ambas as amostras apresentam uma coloração mínima para CASP3, confirmando que o procedimento não afeta a via de morte celular, mesmo após o congelamento rápido das biópsias. As amostras congeladas utilizadas neste experimento vieram de um indivíduo com uma condição inflamatória intestinal e, como esperado, o pSTAT1 aparece no citoplasma desta amostra, confirmando que as modificações proteicas são mantidas após o fracionamento e, portanto, podem ser usadas para análise funcional a jusante.A reprodutibilidade dos resultados em biópsias de congelação é mostrada nesta figura. As frações são limpas com mistura mínima de proteínas compartimentais. Biópsias frescas e congeladas podem ser igualmente usadas nesses protocolos, com biópsias congeladas dando resultados limpos e reprodutíveis, como visto nas Figuras 1 e 2.O protocolo aqui descrito destina-se a gerar as fracções proteicas possíveis. No entanto, alguma variabilidade intrínseca dentro da amostra, incluindo o tamanho e o status do tecido, pode levar a desvios nas quantidades de proteína e nas quantidades de distribuição nas frações.

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

No fracionamento subcelular situ de células de mamíferos em lamínulas de microscópio permite a visualização de localização de proteínas.

Fracionamento em Subcelulares situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos

Este vídeo descreve o protocolo para isolar núcleos únicos de tecido de glioma fresco congelado. Os núcleos únicos isolados podem ser usados como espécimes para técnicas de sequenciamento, como sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA) e sequenciamento de ensaio de núcleo único para cromatina acessível por transposase (snATAC) para obter insights mais profundos sobre a heterogeneidade inter e intratumoral observada no glioma dos tecidos nervosos centrais.

Isolamento de Núcleos de Tecidos de Glioma Frescos Congelados: Um Método para Obter Núcleos Intactos de Amostras de Tumores de Glioma

Aqui descrevemos um método simples para o isolamento de células epiteliais epiteliais do cólon murino espacialmente distintas das células subjacentes à base da cripta.

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e estabelecer culturas primárias de fibroblastos/miofibroblastos (MF) de células gástricas, pequenas intestinais e produtoras de tecido colônico congeladas com fenótipo MF. Essas células expressam CD90, α-SMA e vimentina. Os MFs podem ser usados para uma variedade de ensaios funcionais, incluindo atividade enzimática e produção de citocinas.

Isolamento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais Amostras

O objetivo do presente protocolo é obter amostras de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos isolados de não fixado, recém-ressecados tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). Este protocolo envolve congelado amostras de tecido intestinal humano, cryosectioning, coloração etanólica e desidratação, LCM, a preparar e a extração do RNA.

Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias de células U937 sem o uso de centrifugação de alta velocidade. Esta técnica pode ser usada para purificar as fracções subcelulares para posterior exame de localização de proteínas através de immunoblotting.

Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

Este protocolo descreve vários procedimentos para a preparação de amostras de tecido congelado de alta qualidade no momento da necropsia para uso no ensaio do cometa para avaliar danos no DNA: 1) tecido picado, 2) células epiteliais raspadas do trato gastrointestinal e 3) tecido em cubos amostras, necessitando de homogeneização usando um dispositivo de picar tecido.

Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

A heterogeneidade intra-tumoral é uma característica inerente aos tumores, incluindo gliomas. Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente que utiliza uma combinação de buffers e centrífugas gradientes para isolar núcleos únicos de tecidos glioma congelados frescos para estudos de sequenciamento de núcleo único RNA e ATAC.

Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq

Este protocolo de fracionamento permitirá que os pesquisadores isolem proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriais e de membrana de células de mamíferos. As duas últimas frações subcelulares são ainda purificadas através do gradiente de densidade isopícnico.

Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica

O protocolo fornece uma abordagem confiável e otimizada para o isolamento de núcleos de espécimes tumorais sólidos para sequenciamento de multioma usando a plataforma 10x Genomics, incluindo recomendações para condições de dissociação tecidual, criopreservação de suspensões unicelulares e avaliação de núcleos isolados.

Isolamento Otimizado de Núcleos de Espécimes Sólidos Documentais e Congelados para Sequenciamento Multioma

Descrevemos um modelo murino de íleo paralítico pós-operatório gerado por manipulação intestinal. A função do trânsito gastrointestinal, as alterações patológicas e a ativação das células imunes foram avaliadas 24 h após a cirurgia.

Modelo Murino de Íleo Pós-Operatório

Aprenda o fracionamento subcelular de biópsias intestinais frescas e congeladas para separar proteínas citoplasmáticas e nucleares. Este método reprodutível facilita estudos de localização proteica em pesquisas gastroenterológicas.

Fraccionamento subcelular de espécimes Gastrointestinal frescos e congelados

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