Name: Análise genética de hereditária transtirretina Ala97Ser relacionados a amiloidose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a confirmar mutações pontuais na amiloidose hereditária por transtirretina usando o protocolo Ala97Ser prevalente em Taiwan. Este método viável de extração de DNA, PCR e eletroforese facilita o diagnóstico precoce em laboratórios clínicos.

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Gostaríamos de agradecer a Srta Wu Shin-diversão pela ajuda nos experimentos. Este estudo foi suportado por uma concessão do Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) e IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.

Os testes realizados em laboratório foi realizado em conformidade com os requisitos do clínico laboratório melhoria alterações (CLIA), de 1988, os regulamentos aprovados pela institucional Review Board de Chang Gung Memorial Hospital e Universidade (licença n º 100 - 4470A3 e 2462A3-104). Foi obtido o consentimento de todos os pacientes.
1. coleta de amostras de sangue
<ol><li>Colete sangue total em tubos de EDTA-Tratado comercialmente disponíveis. Misture delicadamente e armazenar a amostra de sangue a 4 ° C até o processamento.</li>
</ol>2. o DNA extraído do sangue periférico
Usar um Kit de extração de DNA para a extração de DNA genômica (ver Tabela de materiais).
<ol><li>Adicione 10 mL de solução 1 para a amostra de sangue de 4,0 mL. Incube a amostra no gelo por 10 min.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 2.000 x g por 5 min a 4 ° C. Remover e descartar o sobrenadante cuidadosamente. Resuspenda o pellet em 3 mL de solução 1.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 2.000 x g por 5 min a 4 ° C novamente e descartar o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 3 mL de solução 2.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de solução-mãe pronase (225 mg/mL) para obter uma concentração final de 100 µ g/mL e misture bem. Incube a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>Refrigere o tubo no gelo durante 10 min. Adicionar 0,8 mL de solução 3 para a amostra e inverter a 3 - 5 vezes. Coloque a amostra no gelo por 5 min.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 3.000 x g por 15 min a 4 ° C. Transferi com cuidado o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico estéril 15 mL.</li>
	<li>Adicione 6 µ l da solução estoque do RNase (10 mg/mL) para obter uma concentração final de 20 µ g/mL. Incube a 37 ° C por 15 min.</li>
	<li>Adicione 2,5 mL de álcool isopropílico e misturar completamente suavemente várias vezes por inversão para precipitar o DNA (fios de material branco, floculante formarão). Usando uma pipeta de grande diâmetro, transferi o dessensibilizador de DNA para um novo tubo de centrifugação de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g por 3 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante cuidadosamente. Pellet de DNA lave adicionando 500 µ l de etanol 70%.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g por 1 min e descartar o sobrenadante. Ar seca pelota do ADN à temperatura ambiente. Adicione 100 µ l de DDQ2O e incubar a 65 ° C por 15 min Ressuspender o DNA.</li>
</ol>3. quantificação de DNA genômica
Use um espectrofotômetro (consulte a Tabela de materiais) para detectar a quantidade e a qualidade do DNA genômico.
<ol><li>Faça logon no computador ligado à máquina Espectrofotômetro. Abra o software.</li>
	<li>Inicialize a máquina espectrofotômetro:<ol>
<li>Clique em "Ácidos nucleicos" sobre o software de Espectrofotômetro.</li>
		<li>Limpe o pedestal com uma toalhita de papel descartáveis e água purificada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Branco o espectrofotômetro:<ol>
<li>Carrega 2 µ l de água filtrada no pedestal.</li>
		<li>Abaixe o braço superior do espectrofotómetro e clique "Em branco" para calibrá-lo.</li>
		<li>Quando estiver pronto, levante o braço e o pedestal com uma limpeza a seco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medida da amostra:<ol>
<li>Clique em "DNA-50" no tipo de amostra.</li>
		<li>Carrega 2 µ l de amostra de DNA no pedestal.</li>
		<li>Abaixe o braço superior e clique em "Medida" para medir a relação A260/A280 e a concentração da amostra.</li>
		<li>Limpe o pedestal entre cada execução com uma limpeza e água purificada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clique em "Print Screen" para coletar os dados.</li>
</ol>4. genéticas análises de mutações
Amplifica o ADN do alvo com a PCR4. Realizar a PCR em uma reação de 25 µ l kit de mistura usando uma DNA polimerase (ver Tabela de materiais). A tabela 1 mostra o gene TTR intrônicas cartilhas.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Gene</td>
			<td>Sequência da primeira demão</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon1</td>
			<td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon2</td>
			<td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon3</td>
			<td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon4</td>
			<td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. As primeiras demão intrônicas de gene TTR. (Sequência de referência NCBI: NC_000018.10)
<ol><li>Adicione os reagentes na tabela 2 , a um tubo PCR de 0,2 mL.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Componentes</td>
			<td>Volume (µ l)</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x Buffer</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>360 GC Enhancer</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>360 da DNA polimerase</td>
			<td>0.2</td>
			<td>2 U/reação</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix (25 mM cada)</td>
			<td>2</td>
			<td>2 mM cada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primeira demão F (10 µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0,4 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primeira demão R (10 µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0,4 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA (100 ng)</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Água da PCR-classe</td>
			<td>13,8</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume total</td>
			<td>25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2. Condições de reação de PCR.
<ol start="2"><li>Misture delicadamente e centrifugue brevemente em uma centrífuga de bancada para coletar todos os componentes para o fundo do tubo. Colocar o tubo em um thermocycler.</li>
	<li>Realize o PCR para 30 ciclos. Cada ciclo consiste de uma etapa de desnaturação por 30 s a 94 ° C, primeira demão recozimento por 30 s a 58 ° C e extensão do polymerase para 45 s a 72 ° C (ver quadro 3).</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Temperatura (° C)</td>
			<td>Tempo</td>
			<td>ciclo de</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturação inicial</td>
			<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Passo de desnaturação do DNA</td>
			<td>94</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 ciclos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Passo de recozimento da primeira demão</td>
			<td>58</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 ciclos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etapa da extensão do polymerase</td>
			<td>72</td>
			<td>45 s</td>
			<td>30 ciclos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etapa de alongamento do post</td>
			<td>72</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Final do PCR ciclismo</td>
			<td>4</td>
			<td>Por tempo indeterminado</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3. Condições de ciclismo para amplificar produtos do PCR.
<ol start="4"><li>Valide o produto do PCR visualizando com eletroforese em gel:<ol>
<li>Prepare um gel de agarose 1,2%:<ol>
<li>Misturar 1,2 g de agarose em pó com 100 mL de 0.5 x TBE num balão microwavable. Microondas por 2 min até a agarose é completamente dissolvido. Arrefecer a mistura de agarose a 55 ° C.</li>
			<li>Adicionar 2 µ l de uma solução de brometo de etídio (10 mg/mL) para a mistura de agarose e misture delicadamente. Despeje a mistura de agarose em uma bandeja de gel para cerca de 5 a 7 mm, em seguida, adicione o comb(s) no lugar. Deixe-o solidificar (pelo menos 30 min) e remova cuidadosamente comb(s).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Carregar amostras e executar um gel de agarose:<ol>
<li>Coloque o gel e bandeja para a célula de electroforese. Preencher a célula de eletroforese com 0,5 x TBE até que o gel é coberto.</li>
			<li>Cuidadosamente, carregar 2 µ l de uma 100 bp DNA ladder (ver Tabela de materiais) para a um faixa do gel como marcador de tamanho molecular. Mistura de corante/amostra de carga (5 µ l do mix de produtos PCR com 1 µ l 6 x tintura de carregamento) em pistas adicionais.</li>
			<li>Ligue a fonte de alimentação. Funcione o gel para 25 min a 100 V.</li>
			<li>Remova o gel da célula de electroforese. Visualize os fragmentos de DNA sob UV luz em um sistema da imagem latente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. sequenciamento de DNA
<ol><li>Purificar os produtos de PCR usando um kit comercial e sequenciar comercialmente ou com um sequenciador automático (consulte a Tabela de materiais).</li>
	<li>Envie sequências de nucleotídeos para o servidor de NCBI BLAST para comparar a consulta de bancos de dados o nucleotídeo10nucleotídeo. Depois que os resultados são exibidos, realizar alinhamentos de sequência e identificar a mutação esperada.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Há duas etapas críticas dentro do protocolo. Em primeiro lugar, a fim de ter o número suficiente de células brancas do sangue, um espécime de hemodiluted deve ser evitada11. Em segundo lugar, o uso de primers PCR apropriados é fundamental para obter resultados fiáveis12. Usamos a ferramenta web de Primer-BLAST para projetar as primeiras demão4,13; um mínimo de 40 pares de base em cada lado dos exões TTR quatro deve ...

Amiloidose transtirretina (TTR) (ATTR) é a forma mais comum de amiloidose sistêmica hereditária1e pode ser causada por uma mutação autossômica dominante herdada no gene transtirretina (TTR)2. Mutações de TTR desestabilizam a estrutura da proteína tetramérica e levam a sua dissociação em monômeros que reagrupa em amiloides2. Mais de 100 mutações de TTR amiloidogénicos foram relatados em todo o mundo1. Análises genéticas com métodos de reação em cadeia (PCR) polimerase confirmam a presença da mutação de ponto TTR e têm vantagens, incluindo evitar a manipulação de sondas radioactivamente etiquetadas em comparação com o borrão do Sul3. PCR é uma técnica rápida, fácil, barata e confiável que tem sido aplicada a inúmeros campos em ciências modernas4.
O diagnóstico precoce desta doença progressiva e fatal é um desafio, dada a sua heterogeneidade fenotípica. Com o aumento da atenção e reconhecimento mais amplo sobre as manifestações iniciais de ATTR, bem como as emergentes de tratamentos5, estudos de diagnóstico apropriados, incluindo teste genético de TTR, portanto, são criticamente fundamentais para melhorar o prognóstico. Além disso, diferentes mutações estão associados com penetrância diferente do traço, idade de início, os padrões de progressão, severidade da doença, a sobrevida mediana, eficácia do transplante de fígado, ou TTR estabilizadores2,6, e graus variáveis de envolvimento neurológico e cardiológico, que têm grandes implicações para o aconselhamento genético7,8,9. Além disso, um teste genético altamente preciso é a única ferramenta que diferencia os dois tipos distintos de ATTR: hereditária (mutante) e tipo selvagem (formulário não mutantes, amiloidose sistêmica senil, SSA)7. É imperativo para confirmar os tipos de ATTR, porque as terapias variam amplamente2. Portanto, há uma necessidade crescente para descrever o protocolo gradual do teste genético de TTR.
A abordagem molecular para detectar a mutação será ilustrada usando o Ala97Ser, a mutação mais comum endémica em Taiwan, por exemplo. Modificações na etapa de extração de DNA, reduzir a quantidade das três soluções usadas e produz uma quantidade suficiente de DNA. Neste protocolo, todos os quatro exões TTR foram analisados, enquanto regiões incluindo 5' montante 3' a jusante, os promotores, os intrões, e regiões untranslated (UTR) não foram sequenciadas.

<table><tbody><tr><td>Tubos tratados com EDTA</td><td>Kit</td> de extração de DNA BD <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stratagen</td><td>200600</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND2000 espectrofotômetro&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Limpeza de Tarefas Delicadas</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td></td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4398823</td><td></td></tr><tr><td>TTR gene intronic primers&nbsp;</td><td>Exon1</td><td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon1</td><td>R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Éxon 2</td><td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon2</td><td>R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon3</td><td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon3</td><td>R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Éxon 4</td><td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon4</td><td>R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td><td></td></tr><tr><td>termociclador</td><td>Sistema de PCR GeneAmp da Applied Biosystems</td><td>9700</td><td></td></tr><tr><td>célula de eletroforese&nbsp;</td><td>Escada de DNA ADVANCE</td><td>Mupid-2plus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corante Protech</td><td>PT-M1-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioLabs</td><td>B7021</td><td></td></tr><tr><td>AlphaImager EC</td><td>Alpha Innotech</td><td>AlphaImager EC</td><td></td></tr><tr><td>sequenciador automático&nbsp;</td>Analisador <td></td>de <td>DNA 3730xl</td> da <td>Applied Biosystems</td></tr></tbody></table>

análise genética de hereditária transtirretina ala97ser relacionados a amiloidose

Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis

Testes genéticos são o teste mais confiável para transtirretina hereditária relacionadas com amiloidose e deve ser realizado na maioria dos casos de amiloidose transtirretina (ATTR). ATTR é uma doença rara mas fatal com fenótipos heterogêneos; Portanto, o diagnóstico é por vezes adiado. Com o aumento da atenção e reconhecimento mais amplo sobre as manifestações iniciais de ATTR, bem como tratamentos emergentes, estudos de diagnósticos adequados, incluindo a transtirretina (TTR) genética teste, para confirmar os tipos e variantes de ATTR são, portanto fundamental para melhorar o prognóstico. Análises genéticas com métodos de reação em cadeia (PCR) polimerase confirmam a presença de mutações pontuais TTR muito mais rápido e mais seguro do que métodos convencionais tais como borrão do Sul. Aqui, demonstramos a confirmação genética da ATTR Ala97Ser mutação, a mutação mais comum endémica em Taiwan. O protocolo é composto por quatro etapas principais: coleta de amostra de sangue total, a extração de DNA, a análise genética de todos os quatro exões TTR com PCR e sequenciamento de DNA.

Electroforese do gel de agarose de dois pacientes e uma saudável individual revelou bandas dos tamanhos esperados, incluindo um produto PCR bp 454 para exon 4 do gene TTR (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57743/57743fig1.jpg"> Figura 1 . Eletroforese em gel retratando PCR amplificados gene TTR. Normal: um indivídu...

Aqui, apresentamos um protocolo para confirmar a presença da mutação de ponto para o diagnóstico de amiloidose hereditária transtirretina, usando Ala97Ser, a mutação mais comum endémica em Taiwan, por exemplo.

Análise genética de hereditária transtirretina Ala97Ser relacionados a amiloidose

Genetic testing is the most reliable test for hereditary transthyretin related amyloidosis and should be performed in most cases of transthyretin ...

Com o aumento da atenção às manifestações precoces da amiloidose por transtirretina, bem como aos tratamentos emergentes, estudos apropriados para confirmar os tipos e variantes da amiloidose por transtirretina são fundamentais para melhorar o prognóstico. A principal vantagem deste protocolo é que este teste é viável e fácil de realizar no laboratório clínico. Para iniciar o protocolo, obtenha um kit de extração de DNA, adicione 10 mililitros de solução um à amostra de sangue de 4,0 mililitros obtida anteriormente e incube a amostra no gelo por 10 minutos.Após a incubação, centrifugar a amostra a 2000 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Suspenda novamente o pellet em três mililitros da solução um.Centrifugar novamente a amostra a 2000 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante. Suspenda novamente o pellet em três mililitros da solução dois.Em seguida, adicione 10 microlitros de solução estoque de Pronase para obter uma concentração final de 100 microgramas por mililitro e misture bem o conteúdo. Incube o DNA a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, leve o tubo ao gelo por 10 minutos.Adicione 0,8 mililitros da solução três à amostra e inverta-a três a cinco vezes. Em seguida, coloque a amostra no gelo por cinco minutos. Centrifugar a amostra a 3000 G durante 15 minutos a quatro graus Celsius.Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de centrifugação cónico estéril de 15 mililitros e adicionar seis microlitros de solução-mãe de RNase para obter uma concentração final de 20 microgramas por mililitro. Incube a amostra, adicione 2,5 mililitros de álcool isopropílico ao tubo e inverta suavemente o tubo várias vezes para precipitar o DNA que aparece como fios de material floculante branco. Com uma pipeta de grande diâmetro, transfira o precipitado para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Centrifugar o precipitado a 12 000 g durante três minutos a quatro graus Celsius. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet de DNA adicionando 500 microlitros de etanol a 70%.Centrifugar o ADN a 12 000 g durante um minuto e rejeitar o sobrenadante. Seque ao ar o pellet de DNA em temperatura ambiente. Adicione 100 microlitros de DDH2O e incube a amostra a 65 graus Celsius por 15 minutos para ressuspender o DNA.Realize PCR em uma mistura de reação de 25 microlitros usando um kit de DNA polimerase. Adicione os reagentes a um tubo de PCR de 0,2 mililitro. Misture o conteúdo delicadamente e centrifugue-o brevemente em uma centrífuga de bancada.Coloque o tubo em um termociclador. Realize a PCR por 30 ciclos com uma etapa de desnaturação por 30 segundos a 94 graus Celsius, habilitação de primer por 30 segundos a 58 graus Celsius e extensão da polimerase por 45 segundos a 72 graus Celsius. Prepare um gel de 1,2% de agarose misturando 1,2 gramas de pó de agarose com 100 mililitros de 0,5 XTBE em um frasco para micro-ondas.Leve a solução ao micro-ondas por dois minutos até que a agarose esteja completamente dissolvida. Resfrie a mistura de agarose a 55 graus Celsius. Adicione dois microlitros de solução de brometo de etídio à mistura de agarose e misture delicadamente.Despeje a mistura em uma bandeja de gel com cerca de cinco a sete milímetros. Em seguida, insira o pente. Deixe o gel solidificar por pelo menos 30 minutos.Depois que o gel solidificar cuidadosamente remova o pente. Coloque o gel e a bandeja na célula de eletroforese. Encha a célula de eletroforese com 0,5 XTBE até que o gel esteja coberto.Carregue cuidadosamente dois microlitros de uma escada de DNA de 100 pares de bases na única pista do gel como um marcador de tamanho molecular. Carregue a mistura de corante e amostra nas pistas adicionais. Ligue a fonte de alimentação e deixe o gel funcionar por 25 minutos a 100 volts.Remova o gel da célula de eletroforese. Finalmente, visualize os fragmentos de DNA sob luz ultravioleta em um sistema de imagem. A eletroforese em gel de agarose de dois pacientes e um indivíduo saudável revela bandas dos tamanhos esperados, incluindo um produto de PCR de 454 pares de bases para o éxon quatro do gene TTR.Os cromatogramas de sequência revelaram uma substituição de nucleotídeo T por G no éxon quatro do gene TTR, resultando em uma mutação missense e uma substituição de alanina por serina na posição de aminoácido 97 em dois pacientes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como confirmar a presença de mutações pontuais para o diagnóstico de amiloidose hereditária por transtirretina.

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Aprenda a confirmar mutações pontuais na amiloidose hereditária por transtirretina usando o protocolo Ala97Ser prevalente em Taiwan. Este método viável de extração de DNA, PCR e eletroforese facilita o diagnóstico precoce em laboratórios clínicos.

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