Name: CRISPR/Cas9 Gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a gerar mutantes condicionais em Plasmodium falciparum usando edição genômica CRISPR/Cas9. Este método facilita o estudo de funções proteicas no parasita da malária humana.

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Agradecemos a Muthugapatti Kandasamy no núcleo microscopia biomédicas Universidade da Geórgia (UGA) para assistência técnica e Jose-Juan Lopez-Rubio por compartilhar o plasmídeo pUF1-Cas9 e pL6. Este trabalho foi financiado pelo prêmio Fundação arcos D.W.C. e H.M.K., concede fundos de inicialização UGA de V.M., bolsas da Fundação de março das moedas de dez centavos (Basil o ' Connor Starter estudioso Research Award) para V.M. e nos institutos nacionais de saúde (R00AI099156 e R01AI130139) para o V.M. e (T32AI060546) para H.M.K.

Cultura contínua de p. falciparum requer o uso de hemácias humanas, e utilizamos o comercialmente adquiridas unidades de sangue que foi despojado de todos os identificadores e anónimos. O Conselho de revisão institucional e o escritório de Biossegurança da Universidade da Geórgia revistos nossos protocolos e aprovaram todos os protocolos utilizados em nosso laboratório.
1. escolher uma sequência de gRNA
<ol><li>Vá para CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) e selecione ' Fasta destino '. Em 'Destino', Cole os 200 pares de base da extremidade 3' do quadro de leitura aberta (ORF) de um gene e 200 pares de base desde o início do 3'-UTR do gene. Em 'In', selecione 'P. falciparum' (3 a 7 v 3.0) e selecione ' CRISPR/Cas9 ' sob 'Using'. Em seguida, clique em ' encontrar Sites de destino '.</li>
	<li>Selecione uma sequência de gRNA as opções apresentadas, dando preferência para a gRNA mais eficiente, que está mais próximo do local da modificação e que tem os menor número locais fora do alvo. Nota: Sequências de gRNA potenciais são identificadas porque eles são imediatamente rio acima de um Protospacer adjacentes Motif (PAM), que é necessário para o recrutamento de Cas9 ao DNA. A sequência que é clonada em pMK-U6, o vetor que impulsiona a gRNA expressão, é as 20 bases imediatamente a montante do PAM. O PAM específico para S. pyogenes Cas9 é a sequência de nucleotídeos NGG e não deve ser incluído na sequência que é clonada em pMK-U6. Nota: CHOPCHOP visualmente classifica as sequências de gRNA, exibindo as melhores opções em verde, as opções menos ideais em âmbar e as piores opções em vermelho. CHOPCHOP dá cada sequência de gRNA um escore de eficiência que é calculado usando os parâmetros mais atualizados encontrados na literatura, e predizem sites fora do alvo que podem ser reconhecidos pela gRNA. Duas ou três sequências de gRNA podem precisar ser tentou encontrar a gRNA melhor adequado para um determinado gene.</li>
	<li>Compra a sequência de gRNA e seu reverso-complemento como oligos purificado por eletroforese em Gel de poliacrilamida. A sequência de gRNA usada para alvo PfHSP70x pode ser encontrada na figura 1B. Nota: Este oligo deve incluir 15 pares de bases homólogas para o plasmídeo expressando a gRNA, que são necessários para a sequência e independente de ligadura da clonagem (SLIC) para o vetor de pMK-U616.</li>
</ol>2. clonagem a gRNA sequência em pMK-U6
<ol><li>
Digeri o pMK-U6 com BtgZI.
	<ol>
<li>Digest 10 μg de pMK-U6 com 5 μL de enzima BtgZI (5.000 unidades/mL) por 3 h a 60 ° C. Siga o protocolo do fabricante enzima para condições de reação.</li>
		<li>Após o período de incubação de 3 h, adicione um adicional 3 μL de BtgZI para a reação para garantir a digestão completa do plasmídeo. Digerir por um adicional 3 h, ainda seguindo as instruções do fabricante para garantir as condições de reação correta.</li>
		<li>Para purificar o pMK-U6 digerido da reação, use um kit de limpeza PCR baseados em colunas de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Separar o DNA digerido usando um gel de agarose 0.7% e extrair a banda base de 4.200 par.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recoze a oligos contendo a sequência de gRNA.
	<ol>
<li>Reconstitua os oligos purificado de página para uma concentração de 100 μM usando água livre de nuclease.</li>
		<li>Combine 10 μL de cada oligo com 2.2 μL de tampão de x 10 2 (ver Tabela de materiais). Certifique-se de que o volume total da reação é 22,2 μL.</li>
		<li>Executar o programa em um thermocycler do recozimento gRNA: passo 1: 95 ° C, 10 min; Passo 2: 95 ° C, 1 s, com uma redução na temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Passo 3: Vá para a etapa 2, 16 vezes; Passo 4: 85 ° C, 1 min; Passo 5: 85 ° C, 1 s, com uma redução na temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Passo 6: Vá para o passo 5, 16 vezes; Passo 7: 75 ° C, 1 min; Passo 8: 75 ° C, 1 s, com uma redução na temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Passo 9: Vá para o passo 8, 16 vezes. Etapas de 10 a 21: repita o procedimento usado nas etapas 4 a 9 até que a temperatura atinja 25 ° C; Passo 22:25 ° C, a 1 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Insira os oligos recozido gRNA o plasmídeo pMK-U6 BtgZI-digerido e gel-purificado.
	<ol>
<li>Combinam 100 ng de pMK-U6 digerido com 1 μL de 10x buffer 2.1 e 3 μL de oligos gRNA recozido. Aumente o volume para 9,5 μL com água livre de nuclease.</li>
		<li>Adicionar 0,5 μL de T4 polimerase e incubar a reação na temperatura de quarto para 2,5 min.</li>
		<li>Mova a reação ao gelo e incubar durante 10 min.</li>
		<li>Imediatamente transforme 5 μL da reação em competentes de Escherichia coli de acordo com as instruções do fornecedor de bactérias. Placa de bactérias em placas de ágar caldo lisogenia (LB), contendo 100 μg/mL ampicilina.</li>
		<li>Permitir que as bactérias transformadas para crescer a 37 ° C durante a noite, em seguida, selecionar colônias e extrair DNA com um kit de miniprep plasmídeo comercialmente disponível.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. criação de regiões de homologia do modelo de reparação
<ol><li>
Projeto escudo mutações dentro do modelo de reparação de homologia para evitar re-corte do DNA que é integrado no genoma. Nota: Uma mutação de escudo normalmente consiste em introduzir uma mutação silenciosa para alterar o PAM para que Cas9 não induzirá uma ruptura no modelo de reparação. O PAM necessários para o Cas9 usado neste protocolo é a sequência de nucleotídeos "NGG", onde "N" é qualquer nucleotídeo. Se possível, mudar um dos nucleotídeos G para um A, C ou T.<ol>
<li>Se o PAM não pode ser mutated silenciosamente, apresente pelo menos 2 mutações silenciosas para os 6 pares de base diretamente adjacentes ao PAM7,8. Nota: Estas mutações poderá impedir o reconhecimento do modelo de reparação pela gRNA e evitar a re-corte do locus reparado pelo Cas9/gRNA complexo. As mutações do escudo podem ser introduzidas na região de homologia amplificando o DNA com primers que contêm a mutação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplifica a região de homologia ORF para o modelo de reparação.
	<ol>
<li>Usando o PCR, amplifica 800 pares de base da extremidade 3' da ORF do gene do alvo. Desenha os primers que serão usados para excluir o codão stop esta amplicon.</li>
		<li>Desenha os primers para a inserção deste amplicon na pHA -MLG tem sido digerido com SacII e AfeI através de uma reação de ligadura do ADN ou SLIC16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplifica a região 3'-UTR de homologia para o modelo de reparação.
	<ol>
<li>Usando o PCR, amplifica as 800 pares de bases, imediatamente após o stop códon do gene do alvo. Desenho de primers para inserção deste amplicon na pHA -MLG tem sido digerido com HindIII e NheI através de uma reação de ligadura do ADN ou SLIC16. Nota: O alto no conteúdo do genoma de p. falciparum pode dificultar a amplificação de regiões como UTRs. Uma abordagem alternativa ao uso de PCR está sintetizando as regiões de homologia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. clonagem de regiões de homologia no plasmídeo de reparação
<ol><li>
Inserir a pHA -MLG, região de homologia ORF.
	<ol>
<li>Digeri a pHA -MLG com SacII e AfeI, de acordo com as instruções do fabricante da enzima. Insira o produto PCR de região de homologia ORF o plasmídeo digerido usando SLIC16.</li>
		<li>Transforme em competentes de Escherichia coli como realizado em etapas 2.3.4 e 2.3.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inserir a região 3'-UTR de homologia em um plasmídeo de pHA-MLG que já contém a região de homologia ORF (consulte a etapa 4.1).
	<ol>
<li>Digeri o plasmídeo com HindIII e NheI de acordo com as instruções do fabricante da enzima. Inserir o plasmídeo digerido usando SLIC16o 3'-UTR homologia região amplicon.</li>
		<li>Transformar em competentes de Escherichia coli e extrair o plasmídeo (etapas 2.3.4 e 2.3.5).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. precipitação de DNA para transfeccao
<ol><li>Adicione 40 μg de pMK-U6, pUF1-Cas9 e pHA -MLG DNA (para um total de 120 μg de DNA) em um tubo de microcentrifuga estéril 1,5 mL.</li>
	<li>Adicionar 1/10th do volume de DNA de 3 M de acetato de sódio em água (pH 5.2) para o tubo e misture bem, usando um vórtice (por exemplo, se o volume na etapa 5.1 foi 100 μL, adicionar 10 μL de acetato de sódio).</li>
	<li>Adicionar 2,5 vezes o volume de 100% de etanol ao tubo e misture bem, usando um vórtice pelo menos 30 s (por exemplo, se o volume em 5.1 foi 100 μL, adicionar 250 μL de 100% de etanol).</li>
	<li>Coloca o tubo no gelo ou a-20 ° C por 30 min.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 18.300 x g durante 30 min a 4 ° C.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo. Não perturbe a pelota.</li>
	<li>Adicionar 3 vezes o volume de etanol a 70% para o tubo e misture rapidamente, usando um vórtice (ex., se o volume em 5.1 foi 100 μL, adicionar 300 μL de etanol a 70%).</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 18.300 x g durante 30 min a 4 ° C. Nota: Esta etapa deve ser realizada em condições estéreis em uma câmara de segurança biológica.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo. Não perturbe a pelota. Deixar o tubo aberto e permitir a pelota secar ao ar durante 15 minutos.</li>
	<li>Armazene o DNA precipitado a-20 ° C até que ela é necessária para transfeccao.</li>
</ol>6. isolamento humanos glóbulos vermelhos do sangue inteiro em preparação para transfeccao
<ol><li>Alíquota sangue fresco em tubos cônicos de estéril 50 mL (aproximadamente 25 mL por tubo).</li>
	<li>Centrifuga os tubos a 1.088 x g durante 12 min, com freios de centrífuga definidos como 4.</li>
	<li>Aspire pelo casaco o sobrenadante e buffy. Ressuspender o RBC com um volume igual de RPMI incompleta. Nota: RPMI incompleta é preparado completando RPMI 1640 com 10.32 timidina μM, 110.2 hipoxantina μM, piruvato de sódio 1 mM, 30 mM de bicarbonato de sódio, 5 mM HEPES, glicose 11,1 mM e gentamicina 0,02% (v/v).</li>
	<li>Repita as etapas de 6.2 – 6.3 duas vezes. Após a última lavagem, Ressuspender as hemácias em um volume igual de RPMI incompleta e armazenar os tubos a 4 ° C.</li>
</ol>7. transfecting hemácias com o plasmídeo CRISPR/Cas9 (para ser feito em condições assépticas)
Nota: P. falciparum culturas são mantidas conforme descrito em outros relatórios de17. Manter todas as culturas a 37 ° C em 3% O2, 3% de CO2e 94% N2 , salvo indicação em contrário. Sempre que o sangue é usado no presente protocolo, ele está se referindo as células vermelhas do sangue puras preparadas no passo 6. O sangue utilizado não deve ser mais de 6 semanas, como normalmente há uma diminuição da proliferação do parasita no sangue mais velho. As etapas a seguir descrevem hemácias pre-carregamento com DNA e adicionando uma cultura parasita as células transfectadas. Outros protocolos de transfeccao estabelecidos são compatíveis com transfecting estas construções18,19.
<ol><li>Prepare um 1 buffer de x cytomix na água (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 2mm EGTA, 5 mM MgCl2, 10mm K2HPO4, 25mm HEPES, pH 7,6). Filtro-esterilize o buffer usando um filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Adicione 380 μL do cytomix 1x para o DNA precipitado na etapa 5 e o vórtice para dissolver. Permitir que o DNA se dissolva no cytomix 1 x por 10 minutos, num Vortex cada 3 min para 10 s.</li>
	<li>Em um tubo cônico estéril 15ml, combinar 300 μL de glóbulos vermelhos (hematócrito de 50%, da etapa 6) no RPMI incompleto com 4 mL de 1x cytomix.</li>
	<li>Centrifugar as hemácias de passo 7.3 a 870 x g durante 3 min e em seguida retire o sobrenadante a pelota de RBC.</li>
	<li>Resuspenda o pellet de RBC com a mistura de DNA/cytomix da etapa 6.2 e transferência para uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm.</li>
	<li>Electroporate as hemácias usando as seguintes condições: 0.32 kV, 925 μF, capacitância, definida como "Alta Cap" e a resistência definida como "Infinito".</li>
	<li>Seguindo electroporation, transferi o conteúdo da cubeta para um 15ml cónico contendo 5 mL de RPMI completa (cRPMI). Centrifugar o tubo a 870 x g durante 3 minutos a 20 ° C e em seguida decante o sobrenadante. Nota: cRPMI é preparado por meio do mesmo método como RPMI incompleta com a adição de 0,25% (p/v) rica em lipídios albumina de soro bovino.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 4 mL de cRPMI e a transferência de um bem em uma placa de cultura de tecidos de 6-poços. Adicionar 400 μL de uma cultura de alta-schizont (7 – 10% schizont parasitemia é ideal) para as hemácias transfectadas. Nota: Parasitemia é definida como a porcentagem de hemácias infectadas por parasita.</li>
	<li>No dia seguinte, lave a cultura com 4 mL de cRPMI. Centrifugar a cultura a 870 x g por 3 min e aspirar o sobrenadante. Resuspenda a cultura em 4 mL de cRPMI.</li>
	<li>48 h após completar o passo 7,6, lave a cultura com 4 mL de cRPMI. Resuspenda então a cultura em cRPMI contendo 1 μM DSM1 para selecionar para o plasmídeo Cas9.</li>
	<li>
Continue lavando as culturas cada dia com cRPMI até parasitas não são mais visíveis por esfregaço de sangue. Após este ponto, substitua o meio de cultura fresco cRPMI mais 1 μM DSM1 cada 48 h.
	<ol>
<li>Para fazer um sangue manchar, pipetar 150 μL da cultura para um tubo de centrífuga de 0,6 mL. As células de pelotas por centrifugação a 1.700 x g durante 30 s.</li>
		<li>Aspire o sobrenadante. Utilize uma pipeta para transferir as células peletizadas para uma lâmina de vidro. Usar uma lâmina de vidro a segunda realizada em um ângulo de 45° para o primeiro slide, manchar a gota de sangue. Mancha o slide usando um kit de coloração comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Ver os parasitas usando um 100 X objetivo de imersão de óleo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Começando a 5 dias pós-transfecção (etapa 7,6), remover 2 mL da cultura com hemácias resuspended em meio de cultura. Adicionar fundos a 2 mL de meio fresco (cRPMI e mais 1 μM DSM1) e sangue em 2% do hematócrito. Adicione sangue fresco desta forma uma vez por semana até parasitas reaparecem, conforme determinado pelo esfregaço de sangue fino (etapa 7.11). Nota: Se a integração for bem-sucedida, parasitas geralmente reaparecem na cultura por transfecção pós um mês.</li>
	<li>Uma vez que os parasitas ressurgir, remova DSM1 pressão de drogas. Como alternativa, remova a pressão de drogas depois de parasitas foram clonadas para fora.</li>
</ol>8. verificação de parasitas para a integração do modelo de reparação
<ol><li>Quando os parasitas são visíveis novamente por esfregaço de sangue fino, isole o DNA da cultura através do kit apropriado.</li>
	<li>
Use PCR para amplificar a região modificada do genoma para determinar se o locus de destino foi alterado com êxito e se o locus do selvagem-tipo não modificado (indicativo de parasitas do tipo selvagem) é detectável.
	<ol>
<li>Para detectar parasitas que integraram o modelo de reparação, use um primer para a frente que fica no início da ORF, fora da região de homologia clonado. Use um primer reverso que senta-se no 3'-UTR. Nota: Como esta amplificação inclui as sequências das etiquetas HA e MLG ribozima, amplicons de parasitas integradas será maior do que a mesma região amplificada no selvagem-tipo parasitas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. clonagem parasitas limitando a diluição
<ol><li>
Realize diluições em série da cultura parasita da etapa 7.13 a obter uma concentração final de 0,5 μL de parasitas/200. Adicione 200 μL da cultura diluída para os poços de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Nota: Porque a parasitemia é definida como a porcentagem de hemácias infectadas e o hematócrito é também um número definido (2%), o número de parasitas por unidade de volume é inferido facilmente.<ol>
<li>Prepare-se 1 mL da cultura em cRPMI em 5% parasitemia e 2% de hematócrito (a estes níveis de parasitemia e hematócrito, a cultura contém 1 x 107 parasitas/mL).</li>
		<li>Dilua esta cultura 1: 100 com cRPMI. Dilua novamente 1: 100 com cRPMI.</li>
		<li>Dilua 1: 400. Execute esta diluição adicionando 62,5 μL da cultura de 25 mL de cRPMI e 1 mL de sangue. Esta diluição resulta na concentração desejada de 0,5 μL de parasitas/200.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Manter a placa de clonagem até parasitas são detectáveis em poços.
	<ol>
<li>Todos os 48 h, substitua o meio da placa de 96 poços de meio fresco.</li>
		<li>Uma vez por semana, a partir de 5 dias após o início da placa de clonagem (passo 9.1), remover 100 μL de cada poço e adicionar de volta 100 μL de meio fresco + sangue (2% do hematócrito).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Identifica qualquer poços contendo parasitas.
	<ol>
<li>Coloque a placa de 96 poços em um ângulo de 45°, por aproximadamente 20 min, permitindo que o sangue ao acordo em um ângulo dentro da placa.</li>
		<li>Coloque a placa de 96 poços em uma caixa de luz. Observe que os poços contendo parasitas contenham a mídia que é amarela na cor, em comparação com os meios de comunicação-de-rosa de poços livre de parasita, devido à acidificação do meio por parasitas.</li>
		<li>Usando uma pipeta sorológica, mover o conteúdo dos poços contendo parasita para uma placa de cultura de tecidos de 24-bem para permitir a expansão da parasitemia.</li>
		<li>Usando a análise PCR conforme descrito na etapa 8, verifique estas linhas parasita clonal para integração correta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. knockdown da proteína por tratar parasitas com glucosamina e confirmação via análise ocidental do borrão
<ol><li>Prepare uma 0,5 M GlcN (glucosamina) solução stock, que pode ser armazenada a-20 ° C.</li>
	<li>Adicionar GlcN para as culturas de parasita MLG e permitir-lhes a crescer na presença de GlcN. Nota: A concentração final e o tempo de tratamento GlcN depende da linha de experimento e parasita. GlcN podem afetar o crescimento do parasita, então a tensão parasita parental deve ser exposta a uma gama de GlcN concentrações para determinar sua sensibilidade ao composto. Muitas vezes, uma concentração de 2,0-7.5 mM GlcN é usado13,14,20.</li>
	<li>Isole amostras da proteína do GlcN-Tratado parasitas13.</li>
	<li>
Utilize amostras de proteínas para análise ocidental do borrão para detectar reduções na proteína13.
	<ol>
<li>Use um anticorpo anti-HA, de acordo com as instruções do fabricante para detectar a proteína HA-MLG-marcados. Compare a banda HA para um controle de carregamento, como PfEF1α.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A implementação de CRISPR/Cas9 em p. falciparum tanto aumentou a eficiência de e diminuiu a quantidade de tempo necessária para modificar o genoma do parasita, em comparação com os métodos anteriores de manipulação genética. Este protocolo abrangente descreve as etapas necessárias para a geração de mutantes condicionais usando CRISPR/Cas9 em p. falciparum. Enquanto o método aqui é voltado especificamente para a geração de HA -MLG mutantes, esta estratégia pode ser adaptada para uma variedade de...

A malária é uma doença devastadora causada por protozoários parasitas do gênero Plasmodium. Por p. falciparum, parasita da malária humana mortal mais, faz com que aproximadamente 445.000 mortes por ano, principalmente em crianças menores de cinco1. Plasmodium parasitas têm um ciclo de vida intrincado envolvendo um vetor mosquito e um hospedeiro vertebrado. Os seres humanos primeiro tornar-se infectado quando um mosquito infectado leva uma refeição de sangue. Então, o parasita invade o fígado, onde cresce, se desenvolve e divide-se por aproximadamente uma semana. Após este processo, os parasitas são liberados na corrente sanguínea, onde passam a replicação assexuada em glóbulos vermelhos (hemácias). Crescimento dos parasitas dentro as hemácias são diretamente responsáveis pelos sintomas clínicos associados com malária2.
Até recentemente, a produção de transgênicos por p. falciparum era um processo trabalhoso, envolvendo várias rodadas de seleção de drogas que levou muitos meses e tinha uma taxa de falhas elevada. Este procedimento demorado relieson a geração de DNA aleatória quebra na região de interesse e a capacidade endógena do parasita para emendar o seu genoma no entanto reparo homólogo3,4,5,6 . Recentemente, agrupado regularmente intercaladas Palindromic Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) genoma edição tem sido com sucesso utilizada no p. falciparum7,8. A introdução desta nova tecnologia na investigação da malária tem sido fundamental para fazer avançar a compreensão da biologia desses parasitas Plasmodium mortal. CRISPR/Cas9 permite a segmentação específica de genes através de guia de RNAs (gRNAs) que são homólogas ao gene de interesse. O complexo de gRNA/Cas9 reconhece o gene através a gRNA e Cas9 então introduz uma ruptura da dobro-costa, forçando a iniciação dos mecanismos de reparação no organismo9,10. Porque por p. falciparum não possui a maquinaria para reparar quebras de DNA através de fim não-homóloga juntando, ele utiliza mecanismos de recombinação homóloga e integra modelos de DNA homólogos transfectados para reparar o Cas9/gRNA-induzido ruptura da dobro-Costa11,12.
Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de mutantes "knockdown" condicionais em p. falciparum usando CRISPR/Cas9 edição do genoma. O protocolo demonstra o uso da ribozima MLG para níveis da proteína condicionalmente knockdown de PfHsp70x (PF3D7_0831700), um acompanhante exportados pelo p. falciparum em host de hemácias13,14. A ribozima MLG é ativada pelo tratamento com glucosamina (que é convertido em glucosamina-6-fosfato nas células) para decompor seu mRNA associado, levando a uma redução na proteína14. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para utilizar outras ferramentas knockdown condicionais, como domínios de desestabilização ou RNA aptamers4,5,15. Nossos detalhes de protocolo a geração de um plasmídeo de reparo que consiste de uma ribozima hemaglutinina (HA) de marca e MLG sequência flanqueada por sequências de código que são homólogas ao frame de leitura aberto PfHsp70x (ORF) e 3'-UTR. Também descrevemos a geração de um plasmídeo segundo a expressão de unidade da gRNA. Estes dois plasmídeos, juntamente com um terceiro que impulsiona a expressão de Cas9, são transfectados em hemácias e usados para modificar o genoma de parasitas por p. falciparum . Finalmente, descrevemos uma reação em cadeia do polymerase (PCR)-com base técnica para verificar a integração da ribozima tag e MLG . Este protocolo é altamente adaptável para a modificação ou nocaute completo de quaisquer genes de p. falciparum , aumentando nossa capacidade de gerar novos insights sobre a biologia do parasita da malária.

<table><tbody><tr><td>Pulsador de Genes Xcell Eletroporador</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Pulsador de Genes Xcell Eletroporador</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td>Compramos os que são embalados individualmente</td></tr><tr><td>Acetato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250g</td><td></td></tr><tr><td>DSM1</td><td>Presente do laboratório Akhil Vaidya</td><td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços para cultura de tecidos TPP</td><td>MIDSCI</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>TPP Placas de cultura de tecidos de 100 mm (placa de 12 mL)</td><td>Placas de</td><td></td> 96 poços para cultura de tecidos MIDSCI TP93100 <td></td></tr><tr><td>TPP Placas de 96 poços</td><td>MIDSCI</td><td>TP92096</td><td></td></tr><tr><td>TPP Placas de 24 poços</td><td>MIDSCI</td><td>TP92024</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7202S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZI</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0703L</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0157L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>#R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Afe1</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0652S</td><td></td></tr><tr><td>Nhe1-HF</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td>#R3131L</tr><tr><td>T4 DNA Polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0203S</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Unidade de filtro superior de garrafa Steritop</td><td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td>Você pode usar qualquer tamanho que atenda às suas necessidades</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>pMK-U6</td><td>Gerado pelo Laboratório Muralidharan</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pHA-glmS</td><td>Gerado pelo Laboratório Muralidharan</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pUF1-Cas9</td><td>Presente do Laboratório Jose-Juan Lopez-Rubio</td><td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hipoxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636-25g</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Timidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895-1G</td><td></td></tr><tr><td>PL6-eGFP BSD</td><td>Gerado pelo Laboratório</td><td></td><td></td>Muralidharan</tr><tr><td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td><td>Gerado pelo Laboratório</td><td></td><td></td>Muralidharan</tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.250</td><td></td></tr><tr><td>Albumax I</td><td>Life Technologies</td><td>N/A</td><td>Você vai querer experimentar alguns lotes para descobrir o que os parasitas vão crescer no melhor</td></tr><tr>Banco<td>de Sangue Interestadual de Glóbulos Vermelhos Humanos</td><td>, Inc</td><td>Envie um e-mail ou ligue diretamente para eles para fazer o pedido</td><td>Normalmente usamos sangue O+</td></tr><tr><td>linha de parasitas 3D7</td><td>Disponível mediante solicitação</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Lisogenia (LB)</td><td>Fisher</td><td>BP1426-2</td><td>Você pode fazer o seu próprio, não é necessário usar exatamente este</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td>Fazemos um estoque de 1000X a 100mg/ml em água e armazenamos no -20C</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Clonetech</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EF1alpha</td><td>Laboratório do Dr. Daniel Goldberg</td><td>Universidade de Washington em St. Louis</td><td>Você pode usar seu controle de carga preferido para western blots. Este é apenas o que usamos em nosso laboratório</td></tr><tr><td>Clone Anti-HA de Rato 3F10, monoclonal</td><td>Fabricado pela Roche, vendido pela Sigma</td><td>11867423001</td><td>Você pode usar seu anticorpo anti-HA preferido</td></tr><tr><td>Tubos de 0,6 mL</td><td>Fisher</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Fisher HealthCare* PROTOCOLO* Hema 3* Sistema de Coloração Manual (Fixador+Solução I e II)</td><td>Fisher</td><td>22-122-911</td><td>Você também pode usar coloração</td></tr> <tr><td>giemsaLâminas de Microscópio Frosted Premium Fisherfines - Tamanho: 3 x 1 pol.</td><td>Pescador</td><td>12-544-3</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

A malária é uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Esta doença, que afeta principalmente aqueles que vivem em regiões tropicais e subtropicais, é causada pela infecção por parasitas Plasmodium . O desenvolvimento de drogas mais eficazes para combater malária pode ser acelerado por melhorar a nossa compreensão da biologia do parasita deste complexa. Manipulação genética destes parasitas é a chave para entender a biologia deles; no entanto, historicamente o genoma de p. falciparum tem sido difícil de manipular. Recentemente, a edição de genoma CRISPR/Cas9 tem sido utilizada em parasitas da malária, permitindo a proteína mais fácil tagging, geração de knockdowns proteína condicional e a supressão de genes. Edição de CRISPR/Cas9 genoma provou para ser uma ferramenta poderosa para fazer avançar o campo da investigação de malária. Aqui, descrevemos um método CRISPR/Cas9 para gerar MLG-baseado condicionais mutantes knockdown no p. falciparum. Este método é altamente adaptável a outros tipos de manipulações genéticas, incluindo a proteína de marcação e nocautes de gene.

Um esquema do plasmídeo utilizado este método, bem como um exemplo de uma mutação do escudo são mostrados na Figura 1. Como um exemplo de como identificar parasitas mutantes depois de transfeccao, resultados de PCRs para verificar a integração da construção deMLG HA - são mostrados na Figura 2. Uma imagem representativa de uma placa de clonagem é mostrada na Figura 3 , para demonstrar a muda...

Nós descrevemos um método para gerar MLG-baseado condicionais "knockdown" mutantes do Plasmodium falciparum usando CRISPR/Cas9 edição do genoma.

CRISPR/Cas9 Gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na biologia do parasita da malária humana, P.Falciparum, ajudando a descobrir a função proteica através de knockdown condicional. A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma geração relativamente fácil de mutantes condicionales em comparação com os métodos anteriores. Para começar, vá para Chop Chop e selecione Fasta Target'Under Target, cole os 200 pares de base a partir da extremidade inicial do quadro de leitura aberto de um gene e 200 pares de base desde o início dos três principais UTR do gene.Em 'Select P.Falciparum'and select CRISPR/Cas9'under Using'Next, clique em Encontrar sites de destino'Selecionar uma sequência de gRNA das opções apresentadas, dando preferência ao gRNA mais eficiente que está mais próximo do site de modificação e que tem o menor número de sites fora do alvo. Compre a sequência de gRNA e seu complemento reverso como eletroforese de gel de poliacrilamida purificada oligos. A sequência de gRNA usada para atingir o PfH-sp70x pode ser encontrada no protocolo de texto.Adicione 40 microgramas cada um de pMK-U6, pUF1-Cas9 e DNA pHA-glmS em um tubo de centrífugo estéril de 1,5 milímetros. Adicione um décimo do volume de DNA de três acetato de sódio molar na água ao tubo e misture-o bem usando um vórtice. Em seguida, adicione 2,5 vezes o volume de 100% de etanol ao tubo e misture-o bem usando um vórtice por pelo menos 30 segundos.Coloque o tubo no gelo ou a menos 20 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, centrifugar o tubo a 18,300 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenante do tubo sem perturbar a pelota.Adicione três vezes o volume de 70% de etanol ao tubo e misture-o brevemente usando um vórtice. Centrifugar o tubo a 18,300 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Novamente, remova cuidadosamente o supernatante do tubo sem perturbar a pelota.Deixe o tubo aberto e deixe a pelota secar por 15 minutos. Armazene o DNA precipitado a menos 20 graus Celsius até que seja necessário para transfecção. Para transfectar RBCs, prepare o buffer de 1X cytomix, bem como o RPMI incompleto e completo, conforme descrito no protocolo de texto.O filtro esteriliza o buffer usando um filtro de 0,22 míces. Adicione 380 microliters do 1X citomix ao DNA e vórtice para dissolver. Deixe o DNA dissolver-se no citomix 1X por 10 minutos, vórtice a cada três minutos por 10 segundos.Em um tubo cônico estéril de 15 mililitros, combine 300 microliters de RBCs humanos isolados no RPMI incompleto com quatro mililitros de 1X citomix. Centrifugar os RBCs a 870 vezes G por três minutos. Em seguida, remova o supernatante da pelota RBC.Suspenda a pelota RBC com a mistura DNA-citomix e transfira-a para um cuvette de eletroporação de 0,2 centímetros. Porate os RBCs usando as condições listadas no protocolo de texto. Após a eletroporação, transfira o conteúdo da cuvette para um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de RPMI completo.Centrifugar o tubo a 870 vezes G por três minutos a 20 graus Celsius. Então, decantar o supernatante. Agora, suspenda a pelota em quatro mililitros de RPMI completo e transfira para um poço em uma placa de cultura de tecido de seis poços.Adicione 400 microliters de uma cultura esquizofrênica alta às RBCs transferidas. Mantenha todas as culturas a 37 graus Celsius sob 3% de oxigênio, 3% de CO2 e 94% de nitrogênio. No dia seguinte, lave a cultura com quatro mililitros de RPMI completo.Centrifugar a cultura a 870 vezes G por três minutos. Aspire o supernatante. Suspenda a cultura em quatro mililitros de RPMI completo.48 horas depois, lave a cultura com quatro mililitros de RPMI completo. Em seguida, suspenda novamente a cultura em RPMI completo contendo um DSM1 micromolar para selecionar para o plasmídeo Cas9. Após este ponto, substitua o meio de cultura por RPMI completo fresco mais um DSM1 micromolar a cada 48 horas.Continue lavando as culturas todos os dias com RPMI completo até que os parasitas não sejam mais visíveis pela mancha de sangue. Para fazer uma mancha de sangue, pipeta 150 microliters de cultura em um tubo centrífuga de 0,6 mililitro. Depois de pelotizar as células por centrifugação a 1.700 vezes G por 30 segundos, aspire fora do supernante.Use uma pipeta para transferir as células pelotas para um escorregador de vidro. Usando um segundo deslizamento de vidro mantido em um ângulo de 45 graus até o primeiro slide, borrue a gota de sangue. Manche o slide usando um kit de coloração comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.Veja os parasitas usando o objetivo de imersão 100 vezes no óleo. Começando cinco dias após a transfecção, remova dois mililitros da cultura com RBCs restamsuados no meio da cultura. Adicione dois mililitros de meio fresco e sangue a 2% de hematócrito.Adicione sangue fresco desta maneira uma vez por semana até que o parasita reapareça, como determinado pela mancha de sangue fina. Realizar diluições seriais da cultura parasita para alcançar uma concentração final de 0,5 parasitas por 200 microliters. Adicione 200 microliters da cultura diluída aos poços de uma placa de cultura tecidual de 96 poços.Mantenha a placa de clonagem até que os parasitas sejam detectáveis nos poços. A cada 48 horas, substitua o meio na placa de 96 poços por meio fresco. Uma vez por semana, começando cinco dias após o início da placa de clonagem, remova 100 microliters de cada poço e adicione de volta 100 microliters de meio fresco mais sangue.Para identificar quaisquer poços que contenham parasitas, coloque a placa de 96 poços em um ângulo de 45 graus por aproximadamente 20 minutos, permitindo que o sangue se acomode em um ângulo dentro da placa. Em seguida, coloque a placa de 96 poços em uma caixa de luz. Observe que os poços contendo parasitas contêm mídia de cor amarela, em comparação com a mídia rosa de poços livres de parasitas, devido à acidificação do meio pelos parasitas.Usando uma pipeta sorológica, mova o conteúdo dos poços contendo parasitas para uma placa de cultura tecidual de 24 poços para permitir a expansão da parasitamia. Usando a análise pcr, verifique estas linhas de parasitas clonais para uma integração correta. Os resultados de um ensaio de imunofluorescência são mostrados aqui, demonstrando a marcação HA com sucesso de PfH-sp70x.Os parasitas pfH-sp70x glmS foram fixados e manchados com DAPI como marcador de núcleo, bem como anticorpos para HA. Proteína rica em histidina associada à membrana, um marcador de exportação de proteínas para o hospedeiro RBC. Uma análise de Western Blot do nível de proteína PfH-sp70x após o tratamento com glucosamina é mostrada aqui. Como esperado, o nível de proteína diminui durante a duração do tratamento.Essa técnica abre caminho para pesquisadores do campo da parasitologia investigarem questões fundamentais na biologia do parasita da malária. É importante lembrar que P.Falciparum é um patógeno transmitido pelo sangue e equipamentos de proteção individual apropriados devem ser usados durante a realização deste procedimento.

crisprcas9-gene-editing-to-make-conditional-mutants-human-malaria

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Os detalhes são apresentados sobre como o mapeamento de QTL com um mapa genético baseado em seqüências genômicas inteiras pode ser usado para identificar um gene de resistência a drogas em Toxoplasma gondii e como isso pode ser verificado com o sistema CRISPR / Cas9 que edita eficientemente um alvo genômico, neste caso o Gene de resistência a drogas.

Mapeamento QTL e edição CRISPR / Cas9 para identificar um gene de resistência a medicamentos em<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Gene alvo edição usando CRISPR/Cas9 facilitou muito a compreensão das funções biológicas dos genes. Aqui, nós utilizamos a metodologia CRISPR/Cas9 a mutações de calreticulin modelo em células hematopoiéticas dependentes de citocina para estudar sua atividade oncogênica.

Usando CRISPR/Cas9 Gene edição para investigar a atividade oncogênica do mutante Calreticulin em células hematopoiéticas dependentes de Cytokine

Aqui, nós descrevemos um protocolo para introduzir um nocaute do gene no amastigotas extracelular de Trypanosoma cruzi, usando o sistema de crispr/Cas9. O phenotype do crescimento pode ser seguido acima pela contagem da pilha da cultura axênicos do amastigotas ou pela proliferação de amastigotas intracelular após a invasão da pilha de anfitrião.

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

O CRISPR/Cas9 é cada vez mais usado para caracterizar a função genética em organismos não-modelo. Este protocolo descreve como gerar linhas de knock-out de Culex pipiens, desde o preparo de misturas de injeção, até a obtenção e injeção de embriões de mosquitos, bem como como criar, atravessar e tela injetar mosquitos e sua prole para mutações desejadas.

Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9

Este protocolo detalha as etapas da mutagênese direcionada do CRISPR/Cas9 em moscas de areia: coleta de embriões, injeção, criação de insetos e identificação, bem como seleção de mutações de interesse.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

O objetivo deste protocolo é permitir a edição perfeita do genoma C. elegans usando complexos de ribonucleoproteína montados e o marcador co-CRISPR dpy-10 para triagem. Este protocolo pode ser usado para fazer uma variedade de modificações genéticas em C. elegans incluindo inserções, exclusões, substituições genéticas e substituições de codon.

CRISPR/Cas9 Edição do Gene C. elegans rbm-3.2 utilizando o marcador de triagem co-CRISPR dpy-10 e complexos de ribonucleoproteína montados.

O protocolo descreve como alcançar modificações direcionadas ao local no genoma dos mosquitos anofelinos da malária usando o sistema φC31 . As modificações descritas incluem tanto a integração quanto a troca de fitas transgênicas no genoma das linhas de acoplamento de rolamento attP.

Integração mediada pelo site φC31 e troca de em vetores anofelinos da malária

Este artigo detalha um protocolo para identificação rápida de indels induzidos pelo CRISPR/Cas9 e seleção de linhas mutantes no mosquito Aedes aegypti utilizando análise de derretimento de alta resolução.

Detecção indel seguindo CRISPR/Cas9 Mutagenesis usando análise de derretimento de alta resolução no mosquito Aedes aegypti

Este protocolo descreve como realizar uma edição eficiente da base de adenina sem limitação de PAM para construir um modelo preciso de doença do peixe-zebra usando zSpRY-ABE8e.

Edição de Base Eficiente sem PAM para Modelagem de Zebrafish de Doenças Genéticas Humanas com zSpRY-ABE8e

A genética química envolve a substituição de um resíduo de gatekeeper por um aminoácido contendo uma cadeia lateral diferente no locus alvo. Aqui, geramos um parasita mutante contendo um alelo hipomórfico de cdpk1 e identificamos vias compensatórias adotadas pelo parasita no fundo mutante.

Compreendendo o desenvolvimento de vias compensatórias em um parasita mutante da malária que abriga alelo hipomórfico de quinases semelhantes a plantas

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para edição do genoma por meio de microinjeção embrionária no mosquito A. aegypti usando a tecnologia CRISPR-Cas9.

Edição do genoma no mosquito da febre amarela Aedes aegypti usando CRISPR-Cas9

Aprenda a gerar mutantes condicionais em Plasmodium falciparum usando edição genômica CRISPR/Cas9. Este método facilita o estudo de funções proteicas no parasita da malária humana.

CRISPR/Cas9 Gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum

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