Name: Análise de marcha de idade-dependente de perturbações Motor em camundongos com neurodegeneração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprenda análise cinemática da marcha para monitorar alterações motoras em camundongos com neurodegeneração. Este método permite detectar precocemente déficits de coordenação relacionados ao envelhecimento.

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Agradecemos a cuidadores de animais em instalações de animais do ENI para ajuda com a criação e Dr. Nuno Raimundo para comentários úteis sobre o manuscrito. I.M. é suportado por subvenções da Fundação pesquisa alemã (DFG) através do centro de investigação em colaboração SFB-889 (projeto A8) e SFB-1190 (projeto P02) e o Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.M.R. é suportado pela sociedade da escola de pós-graduação de Göttingen para Neurociências, biofísica e Biociências moleculares (GGNB).

Todas as experiências com animais aqui relatadas são conduzidas de acordo com as orientações europeias para o bem-estar animal (2010/63/UE) com aprovação o Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (elevam), número de registro 14 / 1701.
1. estudo Design
<ol><li>Como trabalho de comportamento animal requer um planejamento cuidadoso, considere os seguintes parâmetros ao projetar o experimento.<ol>
<li>Número de animais necessários por grupo.<ol>
<li>Use um software estatístico (por exemplo, de passagem, EDA ou GPower) para calcular o tamanho de grupo necessários. Nota: O tamanho de grupo varia de acordo com a variação entre os animais e a severidade do fenótipo. Para a análise cinemática da marcha, o número de ratos é normalmente 10-20 por grupo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sexo dos animais experimentais.<ol>
<li>Considere o efeito dos níveis de estrogênio sobre o experimento, dependendo da estirpe animal. Nota: Muitos estudos de comportamento focar os machos para evitar a influência dos níveis de estrogênio sobre o experimento. Essas influências são mais ou menos fortes, dependendo da estirpe de fundo animal.</li>
			<li>Se ambos os sexos serão usados, testar a influência do sexo e avaliar os dois sexos de forma independente, quando necessário.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Idade dos animais experimentais.<ol>
<li>Use animais adultos (2 meses de idade, ou mais) se apenas o único ponto é necessária.</li>
			<li>Selecione vários pontos de tempo quando a mudança de comportamento motor com o avançar da idade está a ser estudado. O mais antigo ponto de tempo possível é 1 mês, depois que os ratos são desmamados de suas mães. Teste os animais em intervalos regulares, por exemplo, a cada 1, 2 ou 3 meses.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solicitar autorização das autoridades locais para realizar testes de comportamento animal.</li>
	<li>Faça planos para adquirir os animais de teste.<ol>
<li>Fazer um plano de reprodução ou contacte um distribuidor de animais em tempo hábil para que suficiente animais experimentais estão disponíveis no dia quando começaram os experimentos.</li>
		<li>Permitir que os animais possam se habituar durante uma semana, se forem mantidos em uma sala nova/configuração durante os experimentos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. vídeo gravação
Nota: Para ilustrar o uso da análise cinemática da marcha, aqui um sistema de imageamento comercialmente disponível com seu acompanhamento de imagem e software de análise (ver a Tabela de materiais) são utilizados.
<ol><li>Inicie o computador e o software de sistema de imagem.</li>
	<li>Determine o estado de saúde e o bem-estar de cada animal por observá-la em sua gaiola em casa e pesando em um equilíbrio.</li>
	<li>Quando necessário, aplica suavemente a tinta vermelha para as patas do animal com uma escova. Permitir que a tinta secar por ~ 5 min em uma gaiola limpa sobressalente. Nota: Evite pintar o abdômen do animal, como a tinta é usada para realçar o contraste entre as patas e o corpo. É útil ter a pintura a dedo preto útil para correções. Este passo é necessário para animais com pelo marrom, ou no caso as patas têm sido tatuadas para identificação. Se escolhida para pintar as patas de um animal, todos os animais do mesmo grupo e grupo controle precisam ser pintada também.</li>
	<li>Definir a velocidade da esteira no lado superior direito do aparelho; Se mais de uma velocidade de marcha será aplicada, comece com a menor velocidade.</li>
	<li>Colocar o animal na câmara de teste (evitar aperto a cauda ou patas, quando a câmara fechada). Cobrir a câmara com um pano escuro e permitir que cada animal ajustar para 1-2 min.</li>
	<li>Acenda a luz na câmara de teste, rodando o selector de luz de esteira para a posição "on". Gire o botão rotativo de esteira para "encaminhar", para começar a esteira e, em seguida, clique no botão "gravar" no software gerador de imagens. Nota: Enquanto a esteira está em execução, é importante observar o desempenho animal com cuidado e constantemente: parar a esteira imediatamente se o animal não consegue acompanhar a velocidade da esteira, ou mostra os sintomas secundários não relacionadas a locomoção (por exemplo, ataques epilépticos). Condições de testes podem precisar ser reajustado.</li>
	<li>Quando o animal corre de forma estável (não escapa rápida para os lados, de frente ou costas), gravar pelo menos 5 s antes de parar a esteira. Parar de gravar clicando em "parar" do software de sistema de imagem e coloque o selector de esteira volta para a posição "off". Nota: Para evitar execução instável dos animais pode ser útil para deixá-los correr por alguns segundos, ou para permitir a correr na direção contrária (rodando o selector de esteira para "reverter" em vez de "Avançar").</li>
	<li>Clique no botão "processamento" no software gerador de imagens para abrir um menu em que podem ser definidos o início e o ponto final da seção de vídeo (para ser usado para análise). Para fazer isso, use o controle deslizante na parte inferior da tela para navegar através do vídeo.</li>
	<li>Para selecionar o ponto de tempo atual como o início ou o ponto final, clique em "do frame #" e "para", respectivamente. Certifique-se que a seção contém pelo menos 7 passos/pata (14 passos no total) do animal funcionando de forma estável a uma velocidade constante.</li>
	<li>Digite a identificação dos animais, data de nascimento, peso e sexo. Salve os dados em um local desejado no computador ou no servidor. Clique em "câmera" para retornar à interface de gravação.</li>
	<li>Se múltiplas velocidades de execução precisam ser gravado, repita as etapas de 2,6-2.10 com as velocidades de execução desejadas. Antes de gravar o próximo vídeo, certifique-se de que a tinta vermelha ainda está presente sobre a pata, caso contrário repita a etapa 2.3.</li>
	<li>Depois da gravação, liberar o animal para sua gaiola em casa. Depois de remover um animal, limpe a correia de esteira com água e sabão seguida de desinfectante para prepará-lo para o próximo animal experimental.</li>
</ol>3. a transformação
<ol><li>Inicie o software de análise e clique em "Selecionar pasta de estudo" para selecionar a pasta com os vídeos gravados.</li>
	<li>Selecione um vídeo, ou vários vídeos que podem ser processados consecutivamente e clicam "go".</li>
	<li>Use a função de "redesenho" para selecionar a área onde o mouse está em execução; Esta seção deve conter apenas o mouse e o fundo branco.</li>
	<li>Se a função de "reverso" esteira foi usada anteriormente, selecione "verificar se o nariz do sujeito é a sua direita >>>" para espelhar o vídeo, desde que o software é projetado para analisar apenas animais correndo para a esquerda. Clique em "aceitar" para prosseguir.</li>
	<li>Use a função "refresh" para ver a máscara padrão e pata a impressão que o software detecta. Nota: O vídeo original é exibido à esquerda, e uma imagem preto e branca da proposta de pata é à direita.</li>
	<li>Insira valores nas caixas de "comprimento" e "largura" para alterar a máscara que exclui a área vermelha ao redor do focinho do animal para análise; como a cor é semelhante para as patas, não mascarando naquela área poderia resultar no software acidentalmente classificando a área como uma pata de focinho.</li>
	<li>Ajuste os controles deslizantes "ruído filtro" e "filtrar a pele e manchas escuras" para otimizar a impressão da pata preto e branco. Defina o controle deslizante "filtrar ruído" ~ 800-950 para animais pretos e ~ 700-800 para animais marrons ou brancos, dependendo da cor exata da pele do animal. Selecione "okey" quando as configurações são satisfatórias. Nota: O controle deslizante "filtrar a pele e manchas escuras" depende em como "vermelha" a pata é. Para patas pintadas, o valor é geralmente ao redor 100-120 e pelas patas não envernizadas o melhor valor é em torno de 50-100. Estas definições dependem os matizes de cor da pele e patas e precisam ser otimizado para cada animal. A cópia da pata preto e branco deve ter representações claras das patas com como pouco ruído de fundo quanto possível.</li>
	<li>Selecione um ou vários vídeos que passado o primeiro ajuste (rotulada com "@" antes do nome do vídeo) e selecione a função "ir" para iniciar a análise destes vídeos. Nota: A análise leva 2-5 min por vídeo. É possível executar a análise de vários vídeos durante a noite, desde que esta etapa exige sem a participação do experimentador.</li>
	<li>Selecione um vídeo analisado (rotulada com "@") e clique em "ir". Observe que a área de pata (em cm2) em contacto com o cinto ao longo do tempo (dinâmica de marcha) para cada pata separado agora pode ser vista. Para comparar o vídeo original e a cópia para uma área selecionada da pata calculado, use a função "reproduzir vídeo".</li>
	<li>Use as seguintes ferramentas (3) para corrigir pequenos erros cometidos pelo software.<ol>
<li>Use a opção "correta" para excluir um sinal errado, por exemplo, quando o software grava um sinal, mesmo que a pata correspondente não está em contacto com o cinto. Clique uma vez para ampliar a área relevante e marque a borda esquerda do objeto para remover com o segundo clique e borda direita com o terceiro clique.</li>
		<li>Use a opção "conectar" para combinar dois sinais, por exemplo, quando nenhum sinal é gravado por alguns quadros, mesmo que a pata está em contacto com o cinto. Clique uma vez para ampliar a área relevante e clique duas vezes no meio de dois objetos para combinar.</li>
		<li>Use a opção 'excluir' para remover pontos de tempo de análise completamente. Use esta opção somente se o erro não pode ser corrigido com o "correto" ou "conectar" função, por exemplo, quando um sinal da pata do membro anterior esquerdo acidentalmente é registrado para a pata esquerda membro posterior. Clique uma vez para ampliar a área relevante e marque a borda esquerda da área para remover com o segundo clique e borda direita com o terceiro clique. Nota: As ferramentas podem ser utilizadas para corrigir pequenos erros; erros sistemáticos (por exemplo, se o sinal de uma pata era extremamente fraco) não podem ser corrigidos: o vídeo deve ser excluído da análise e repete-se, quando possível, a gravação do respectivo animal. Nota que a opção "reproduzir vídeo" não está mais disponível após o "correto", "ligar", ou a opção "excluir" tem sido usado, e clique no botão "desfazer" redefinirá todas as 3 ferramentas de edição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione "seguida de um membro" proceder através de 4 membros; Quando "próximo membro" é clicado após a última pata, o software conclui a análise e mostra os resultados para este animal em 4 telas.</li>
</ol>4. análise de marcha
<ol><li>Quando são analisados todos os vídeos de um experimento, selecione todos os vídeos e clique em "re-organizar resultados" para exportar os resultados (uma lista de parâmetros em arquivos de planilha).</li>
	<li>Abra o arquivo com o final "reorganized_stride_info" e adicionar informações que não estão incluídas nesta planilha: informações (por exemplo, genótipo, tratamento), idade e as medições de largura e comprimento de animais que são salvos em outro grupo arquivo de planilha com o final "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info".</li>
	<li>Normalizar os parâmetros da marcha para animal largura ou comprimento, sempre que necessário, por exemplo, SL para animal comprimento e SW para largura do animal.</li>
	<li>Classificar os resultados por grupo, idade e velocidade de corrida: analisar todas essas condições de forma independente. Nota: As idades diferentes ou velocidades de execução não podem ser combinadas dentro de um mesmo grupo.</li>
	<li>Calcule os valores de média (média), desvio padrão e erro padrão da média para cada parâmetro para todas as condições experimentais.</li>
	<li>Realizar análise estatística de acordo com o projeto experimental, por exemplo, usar um-de-cauda-2 t-teste para comparar animal mutante/tratados para um selvagem-tipo (WT) / controle ou ANOVA para comparar vários grupos independentes.</li>
	<li>Olha medido em todos os parâmetros: é útil traçar cada parâmetro para visualizar melhor os resultados. Se existem diferenças estatísticas em um determinado parâmetro, verifique se outros parâmetros dependentes alterar correspondentemente. Nota: por exemplo, se o SL é significativamente diminuída em um determinado grupo de teste, isto também causará uma maior frequência de passo (pois a velocidade é a mesma) e pode resultar em um aumento SW (a fim de manter a estabilidade da postura).</li>
	<li>Selecione os parâmetros que são mais relevantes para um modelo, e/ou são comparáveis às observações da doença humana. Para uma apresentação, criar vídeos representativos para cada grupo e complementá-las por gráficos mostrando a leitura para os parâmetros pertinentes, desde alterações sutis da marcha muitas vezes não são óbvias dos vídeos.</li>
</ol>5. resolução de problemas
Nota: Alguns animais, especialmente os modelos de rato com um fenótipo de ansiedade, podem ter dificuldades para realizar até mesmo uma simples tarefa como correr em uma esteira. A seguir estão as etapas que podem ser tomadas para reduzir os níveis de ansiedade e incentivam a execução.
<ol><li>Habituação e aplicação positiva.<ol>
<li>Em 2-3 dias antes do primeiro teste, posicione o mouse na câmara de teste, cubra-o com um pano escuro e deixar a luz desligada. Deixe o mouse ajustar ao novo ambiente para ~ 5 min Add chow ou manteiga chocolate/porca (por exemplo, Nutella) para a câmara de teste, então pode ser criada uma associação positiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplicação da negativa por limite de sopros/parte traseira do ar.<ol>
<li>Ratos não como sopros de ar ou um movimento por trás deles e vão fugir a perturbação. Para motivar a execução, use sopros de ar suave, ou movimento rítmico da barra flexível que forma o limite posterior da câmara de teste, para incentivar o mouse para correr em direção à parte frontal da câmara de teste.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Comece devagar.<ol>
<li>Ao testar a velocidades de execução rápidas, comece a esteira a uma velocidade inferior e então lentamente aumentar a velocidade da esteira para a condição de teste desejada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Minimize a livre circulação.<ol>
<li>O comprimento de câmara de teste é limitado por duas barras ajustáveis na frente e atrás. Se um teste animal mantém-se com a velocidade, mas não é executado continuamente, limite o comprimento da câmara para resultar no funcionamento mais constante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se as medidas acima mencionadas não são bem sucedidas, grave a correr no dia seguinte. Se o animal ainda se recusa a executar após o teste em três dias, gravar isto como o achado e excluir o animal de mais testes. Nota: Os resultados da análise da marcha dependem de gravação de vídeo de boa qualidade. Não há nenhuma razão para excluir vídeos durante a análise, se os vídeos foram cuidadosamente registrados. Se a qualidade do vídeo é insuficiente, ele se tornará óbvio durante a etapa de 3.6 quando estão sendo definidos os parâmetros para a criação da impressão digital de pata. Se qualquer outra parte do corpo exceto as patas e focinho aparece vermelho (por exemplo, devido a pele falta em torno da genitália ou sprinklings de pintura de dedo no abdômen), a qualidade cai significativamente. Os ajustes na etapa 3.6 permitem corrigir apenas pequenas questões e se isso não pode trazer o vídeo para uma relação sinal/ruído aceitável, o vídeo precisa ser excluídos da análise e gravação precisa ser repetido. Assim, é aconselhável analisar vídeos logo após as gravações são realizadas.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Estudar a coordenação motora é uma abordagem útil na caracterização de modelos de doenças neurodegenerativas, especialmente para doenças como a PD em que a coordenação motora é severamente afectada. Com a ajuda de um ensaio funcional de análise cinemática da marcha, podemos identificar mudanças sutis na marcha de animais no início dos problemas de locomoção, ou em modelos com neurodegeneração fraca e, portanto, relativamente modesto fenótipo. Dada a grande variedade de fenótipos em vários modelos de doenças neurodegenera...

Doenças neurodegenerativas imponham um encargo significativo para a sociedade, os doentes e as famílias e se tornará ainda maior preocupação com o aumento da expectativa de vida, e a população mundial continua a envelhecer. Um dos sintomas mais comuns de doenças neurodegenerativas são problemas de equilíbrio e mobilidade. Assim, a caracterização do comportamento motor no envelhecimento dos mamíferos (por exemplo, roedores) modelos, e/ou modelos mostrando neurodegenerativas fenótipos, é uma ferramenta valiosa para demonstrar a relevância na vivo , o modelo animal específico, ou terapêutica tratamentos que visam melhorar os sintomas da doença. Quase cada abordagem para tratar doenças neurodegenerativas, finalmente, requer testes em um modelo animal antes do início de um ensaio clínico em humanos. Portanto, é crucial ter testes de comportamento confiável e reproduzível que podem ser usados para quantificar consistentemente fenótipos doença relevantes ao longo da progressão da idade, a fim de garantir que uma droga de candidato, que mostrou potencial em um modelo in vitro , pode efetivamente melhora o fenótipo em um animal vivo.
Um dos aspectos da avaliação do comportamento motor em roedores é análise cinemática da marcha, que pode ser executada por VPI (também chamado plano ventral Videografia)1,2. Este método estabelecido capitaliza sobre gravação contínua da parte inferior dos roedores andando em cima de uma esteira motorizada e transparente correia1,2,3,4. Análise do vídeo alimentar dados cria "digital de pata" de todos os quatro membros que dinamicamente e confiantemente recapitular padrão ambulante do roedor, como originalmente descrita por Kale et al 2 e Amende et al 3.
O princípio da análise da marcha com base em imagem é medir a área de pata em contato com a correia de esteira ao longo do tempo, para cada pata individual. Cada postura é representada por um aumento na área de pata (em fase de travagem) e uma diminuição na área da pata (a fase de propulsão). Isto é seguido pela fase de balanço em que nenhum sinal é detectado. Balanço e postura junto formam um tranco. Além de parâmetros de dinâmica de marcha, parâmetros de postura podem também ser extraídos os vídeos gravados. Parâmetros exemplares e sua definição estão listados na tabela 1 e incluem postura largura (SW; a distância combinada as patas dianteiras ou traseiras ao eixo focinho-cauda), comprimento (SL; distância média entre dois avanços da mesma pata) do passo ou pata de colocação ângulo (o ângulo da pata ao eixo focinho-cauda). Os dados de postura e marcha dinâmica permitem tirar conclusões sobre equilíbrio animal (por parâmetros de postura e sua variabilidade ao longo de várias etapas) e coordenação (pelos parâmetros de dinâmica de marcha). Outros parâmetros, tais como coeficiente de ataxia (SL variabilidade calculada por [(max. SL−min. SL) / quero dizer SL]), membro posterior compartilhado postura (tempo que ambos os membros posteriores estão em contacto com o cinto), ou arrastar pata (área total da pata no cinto de postura completo para decolagem de pata) também podem ser extraídos e foram relatados para ser alterada em vários neurodegenerativas di Sease modelos5,6,7,8 (ver tabela 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parâmetro</td>
			<td>Unidade</td>
			<td>Definição</td>
		</tr>
<tr>
<td>tempo de balanço</td>
			<td>MS</td>
			<td>duração de tempo que a pata não está em contacto com o cinto</td>
		</tr>
<tr>
<td>tempo de postura</td>
			<td>MS</td>
			<td>duração de tempo que a pata está em contato com a correia</td>
		</tr>
<tr>
<td>% de freio</td>
			<td>% de tempo de postura</td>
			<td>porcentagem de tempo de postura, que as patas estão em fase de freio</td>
		</tr>
<tr>
<td>propel %</td>
			<td>% de tempo de postura</td>
			<td>porcentagem de tempo de postura, que as patas estão na fase de propulsão</td>
		</tr>
<tr>
<td>largura de postura</td>
			<td>cm</td>
			<td>distância combinada das patas dianteiras ou traseiras ao eixo focinho-cauda</td>
		</tr>
<tr>
<td>comprimento do passo</td>
			<td>cm</td>
			<td>distância média entre dois passos a pata mesmo</td>
		</tr>
<tr>
<td>frequência de passo</td>
			<td>passos/s</td>
			<td>número de passos completos por segundo</td>
		</tr>
<tr>
<td>ângulo de colocação de pata</td>
			<td>DEG</td>
			<td>ângulo da pata em relação ao eixo de focinho-cauda do animal</td>
		</tr>
<tr>
<td>coeficiente de ataxia</td>
			<td>u.a.</td>
			<td>Variabilidade de SL calculado por [(max SL-min SL)/média SL]</td>
		</tr>
<tr>
<td>posição compartilhada %</td>
			<td>% de postura</td>
			<td>tempo de postura de membro posterior compartilhado; vez que ambos os membros posteriores estão em contacto com o cinto, ao mesmo tempo</td>
		</tr>
<tr>
<td>pata de arrastar</td>
			<td>mm2
</td>
			<td>área total da pata no cinto de postura completo para pata de decolagem</td>
		</tr>
<tr>
<td>carregamento de membro</td>
			<td>cm2
</td>
			<td>MAX dA/dT; máxima taxa de variação da área de pata na fase de quebra</td>
		</tr>
<tr>
<td>variação do ângulo de passo</td>
			<td>DEG</td>
			<td>desvio-padrão do ângulo entre o hind patas em função do SL e SW</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Definição de parâmetros de chave da marcha que pode ser testado por imagem avião ventral.
Avaliar o comportamento motor dos modelos de roedores para doenças neurodegenerativas pode ser desafiador dependendo da gravidade do fenótipo de um modelo específico em uma determinada idade. Várias doenças, mais proeminentemente PD, mostrar forte comportamento motor (locomoção) déficits, tanto em pacientes e em modelos animais. Um dos quatro principais sintomas em PD é bradicinesia, que progride com o envelhecimento e se manifesta em deficiências severas da marcha já em estágios iniciais de PD9. Estudos do modelo PD agudo, roedores tratados com 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), já utilizados de11,de10,para análise de marcha VPI12. No entanto, dada a natureza aguda deste modelo, estes estudos não se dirija a progressão relacionadas com a idade de déficit motor. Vários estudos recentes têm realizado análise de marcha em ratos envelhecidos com alterações neurodegenerativas, por exemplo,13,14,15, enfatizando a importância de compreender a progressão da doença com o avançar da idade .
Além do déficit motor, modelos animais de doenças neurodegenerativas frequentemente têm dificuldades, enfocando as tarefas de exame e mostram deficiências cognitivas proeminentes, em especial com o avançar da idade. Tal um fenótipo pode influenciar o resultado dos testes de comportamento motor. Ou seja, um dos testes mais utilizados para examinar os défices de motor, o teste rotarod16, baseia-se na cognição, atenção e esforço17,18. Enquanto a vontade de andar em uma esteira motorizada também depende desses fatores, a leitura gravada está em execução, que é uma característica mais padronizada e muito menos influenciada pela cognição alterada. Efeitos do estresse e atenção podem ser visíveis em parâmetros específicos, como tempo de balanço/postura para estresse e SL para atenção19,20, mas não na capacidade de execução global.
A abordagem de análise cinemática da marcha ainda oferece a vantagem de ter opções para ajustar o desafio para os modelos de roedores. A esteira com ângulo ajustável e velocidade permite andar a velocidades de 0,1 - 99,9 cm/s, para que os roedores com graves deficiências ambulante podem ainda ser capazes de correr a uma velocidade lenta (~ 10 cm/s). Animais com deficiência não podem ser medidos em correr mais rápido velocidades (30 - 40 cm/s). A observação de ou não os animais testados são capazes de executar em uma certa velocidade proporciona um resultado por si só. Além disso, o roedor pode ser adicionalmente desafiado para executar um plano inclinado, ou para baixo de um declínio, pela inclinação da esteira para um ângulo desejado com o auxílio de um goniômetro, ou anexando um trenó ponderado a mouse ou rato membros posteriores.
Além de numerosos estudos de proteínas simples que são uma mutação em pacientes, há uma crescente conscientização recente das ligações entre defeituoso endocitose processo e neurodegeneração13,21,22, 23,24,25,26,,27,28. Modelos com níveis reduzidos de endophilin-A de rato (doravante endophilin), um jogador-chave em ambos endocitose mediada por Clatrina13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 e independente de Clatrina endocitose34, foram encontrados para mostrar a neurodegeneração e deficiências de idade-dependente na atividade locomotora13,21. Três genes codificam a família de proteínas de endophilin: endophilin 1, endophilin 2 e endophilin 3. Notavelmente, o fenótipo resultante da depleção de proteínas endophilin varia muito consoante o número de desaparecidos endophilin genes13,21. Enquanto triplo nocaute (KO) de todos os endophilin de genes é letal apenas algumas horas após o nascimento e os ratos sem ambos endophilin 1 e 2 não conseguem prosperar e morrem dentro de 3 semanas após o nascimento, KO único para qualquer um dos três endophilins não mostra nenhum fenótipo óbvio para testados condições de21. Outros genótipos mutantes endophilin mostram vida útil reduzida e desenvolvem deficiências motor com o aumento da idade13. Por exemplo, endophilin 1KO-2HT-3KO ratos exposição ambulante alterações e problemas de coordenação motora (como testado pelo rotarod e análise cinemática da marcha) já aos 3 meses de idade, enquanto seus littermates, endophilin 1KO-2WT-3KO animais, exibir um significativo redução da coordenação motora, somente em 15 meses de idade13. Devido a vasta diversidade de fenótipos nestes modelos, é necessário identificar e aplicar um teste que pode integrar uma variedade de desafios correspondente ao motor do animal e cognição habilidades, bem como a idade. Aqui, detalhamos os procedimentos experimentais que capitalizar a análise cinemática da marcha para avaliar o início e a progressão da deficiência motor em um modelo do rato que mostra alterações neurodegenerativas (i.e., endophilin mutantes). Isso inclui a medição de parâmetros da marcha em várias idades e diferentes severidades de deficiências de locomoção.

<table><tbody><tr><td>DigiGait</td><td>Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, EUA</td><td></td><td>O DigiGait Imager and Analysis Software está incluído com o cobertor</td></tr><tr><td>não transparente do hardware ou pano</td><td></td><td></td> escuro <td>cobre a câmara de teste para reduzir a sensação de equilíbrio de exposição/estresse do animal</td></tr><tr><td></td><td>, por exemplo, equilíbrio Satorius</td><td></td><td>com precisão de 0,1 g e uma carga máxima de pelo menos 100 g</td></tr><tr><td>vermelho pintura a dedo</td><td>, por exemplo, Kreul ou Staedtler</td><td></td><td>para aumentar o contraste entre patas e animais' s corpo</td></tr><tr><td>pincel</td><td></td><td></td> pequeno <td>escova macia para aplicar tinta a dedo nas patas do animal</td></tr><tr><td>detergente</td><td></td><td></td> diluído para desinfetante <td>de limpeza</td></tr><tr><td>, por exemplo, Meliseptol ou etanol 70%,</td><td>por exemplo, B.Braun</td><td></td><td>para desinfecção</td></tr></tbody></table>

análise de marcha de idade-dependente de perturbações motor em camundongos com neurodegeneração

Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration

Testes de comportamento motor são comumente usados para determinar a relevância funcional de um modelo de roedor e testar recentemente desenvolvido tratamentos nestes animais. Especificamente, a análise de marcha permite doença recaptura fenótipos relevantes que são observados em pacientes humanos, especialmente em doenças neurodegenerativas que afetam as habilidades de motor tais como a doença de Parkinson (PD), a doença de Alzheimer (AD), amiotrófica esclerose lateral (ALS) e outros. Em estudos iniciais ao longo desta linha, a medição de parâmetros da marcha foi trabalhoso e dependida em fatores que foram difíceis de controle (por exemplo, velocidade, running corredor contínuo). O desenvolvimento de sistemas de imagens de avião ventral (VPI) viabilizados para realizar análise de marcha em grande escala, tornando este método uma ferramenta útil para a avaliação do comportamento motor em roedores. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado de como usar a análise cinemática da marcha para examinar a progressão de idade-dependente de déficit motor em modelos do rato de neurodegeneração; linhas de rato com diminuição dos níveis de endophilin, em que danos neurodegenerativas progressivamente aumenta com a idade, são usadas como um exemplo.

Para ilustrar o uso da análise cinemática da marcha, efetuamos análise de marcha em camundongos C57BL/6J de WT com o avançar da idade, bem como várias linhas de mutante endophilin, usando a instrumentação disponível comercialmente e software (consulte a tabela de de Materiais). Nesta configuração, uma câmera de alta velocidade sob uma esteira transparente registra o funcionamento de um rato (figura 1A). Em seguida, o software reconhece o cont...

Neste estudo, vamos mostrar o uso da análise cinemática da marcha com base no plano ventral da imagem latente para monitorar as mudanças sutis na coordenação motora, bem como a progressão de neurodegeneração com o avançar da idade em modelos do rato (por exemplo, endophilin mutante linhas de rato).

Análise de marcha de idade-dependente de perturbações Motor em camundongos com neurodegeneração

Motor behavior tests are commonly used to determine the functional relevance of a rodent model and to test newly developed treatments in these animals. ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave na Pesquisa de Envelhecimento e Neurodegeneração, como o início e a progressão da marcha e anormalidades motoras com a idade e, em particular, em modelos de camundongos de doenças neurodegenerativas. O resultado de tal status pode ser traduzido em uma compreensão muito melhor das deficiências motoras em pacientes com doenças neurodegenerativas, por exemplo, doença de Parkinson ou ataxias. A principal vantagem de usar a análise de marcha baseada em vídeo é que ela permite estudar deficiências motoras sutis e graves em modelos de neurodegeneração em camundongos.Comece determinando o estado de saúde de cada animal, examinando-o de perto e pesando-o em uma balança. Aplique suavemente tinta vermelha nas patas do animal com um pincel. Coloque o animal em uma gaiola sobressalente e limpa enquanto a tinta seca.Em seguida, defina a velocidade da esteira no painel superior direito do aparelho. Em seguida, coloque o animal na câmara de teste e cubra-o com um pano escuro para permitir que cada animal se ajuste por um a dois minutos. Acenda a luz na câmara de teste girando o interruptor rotativo da luz da esteira para a posição ligado.Abra um pouco a tampa para que você possa observar o animal durante a tarefa. Inicie a esteira por cerca de meio segundo para avisar o animal de que a tarefa está prestes a começar. Gire a chave rotativa da esteira para frente para iniciar a esteira.Em seguida, clique no botão Gravar no software do gerador de imagens. Quando o animal correr de maneira estável, registre por pelo menos cinco segundos antes de parar a esteira. Pare a gravação clicando em Parar no software do gerador de imagens e gire a chave rotativa da esteira de volta para a posição desligada.Em seguida, clique no botão Editar no software de imagem para abrir um menu no qual o ponto inicial e final da seção de vídeo pode ser definido. Navegue pelo vídeo usando o controle deslizante na parte inferior da tela. Para selecionar o ponto de tempo atual como o ponto inicial ou final, clique em Do número do quadro e Até, respectivamente.Certifique-se de que a seção contenha pelo menos sete passos por pata ou quatorze passos no total do animal correndo de forma estável a uma velocidade constante. Por fim, insira a identificação do animal, data de nascimento, peso e sexo. Salve os dados em um local desejado no computador ou servidor.O princípio da análise de marcha baseada em vídeo é medir a área da pata em contato com a superfície ao longo do tempo para cada pata individual. Muitas dinâmicas de marcha e parâmetros de postura podem ser extraídos dos vídeos gravados, por exemplo, o tempo de balanço, tempo e largura de apoio, comprimento da passada e frequência. Outras características da marcha, como coeficiente de ataxia ou variabilidade do ângulo do passo, podem ser calculadas a partir das medições primárias.Inicie a análise de vídeo iniciando o software de análise e clicando em Selecionar pasta de estudo para selecionar a pasta com os vídeos gravados. Selecione um vídeo e clique em Ir.Use a função de redesenhar para selecionar a área onde o mouse está sendo executado. Observe que esta seção deve conter apenas o mouse e o fundo branco.Em seguida, insira valores nas caixas de comprimento e largura para alterar a máscara que exclui a área vermelha ao redor do focinho do animal para análise. Ajuste os controles deslizantes, filtre o ruído e filtre o pelo e manchas escuras para otimizar a impressão da pata em preto e branco. Defina o controle deslizante de ruído do filtro para 800 a 950 para animais pretos e para 700 a 800 para animais marrons ou brancos, dependendo da cor exata do pelo do animal, e selecione OK.Em seguida, selecione um vídeo que passou no primeiro ajuste e selecione a função Ir para iniciar a análise do vídeo. Em seguida, selecione um vídeo analisado e clique em Ir.Observe que a área de impressão da pata em contato com o cinto ao longo do tempo para cada pata separada agora pode ser vista. Para comparar o vídeo original e a impressão pata calculada para a área selecionada, selecione a função Reproduzir vídeo.Para corrigir pequenos erros, use a opção Corrigir, Conectar ou Excluir. Use a opção Corrigir para excluir um sinal errado. Clique uma vez para ampliar a área relevante e marque a borda esquerda do objeto a ser removido com um segundo clique e a borda direita com o terceiro clique.Use a opção Conectar para combinar dois sinais. Clique uma vez para ampliar a área relevante e clique duas vezes no meio dos dois objetos a serem combinados. Use a opção Excluir para remover completamente os pontos de tempo da análise.Clique uma vez para ampliar a área relevante e marque a borda esquerda da área a ser removida com o segundo clique e a borda direita com o terceiro clique. Em seguida, selecione Próximo membro para prosseguir pelos quatro membros. Observe que, depois que o Next Limb é clicado após a última pata, o software conclui a análise e mostra os resultados do animal em quatro telas.Por fim, depois que todos os vídeos de um experimento forem analisados, selecione todos os vídeos e clique em Reorganizar resultados para exportar os resultados. Cerca de 50 parâmetros de marcha são calculados e listados no arquivo exportado. Classifique o resultado por grupo, idade e velocidade de corrida e analise todas essas condições de forma independente.Na análise da marcha em camundongos selvagens com o avanço da idade, os resultados indicaram que a postura com a largura normalizada do animal não se altera com o avanço da idade. No entanto, o suporte duplo dos membros posteriores e a carga dos membros aumentam com a idade em animais selvagens. Além disso, enquanto todos os animais testados podem correr a 30 metros por segundo em um mês, os mutantes da endofilina desenvolvem déficits de corrida à medida que envelhecem.Além disso, o ritmo da marcha é prejudicado em mutantes de endofilina. Por exemplo, o tempo de propulsão diminui nos mutantes de endofilina à medida que os camundongos envelhecem. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar que a etapa mais crítica é a gravação do vídeo original.Todas as análises posteriores dependem de vídeos de boa qualidade. A análise da marcha é um método útil para categorizar a marcha e o comportamento motor em modelos de neurodegeneração em camundongos. No entanto, alguns aspectos do comportamento motor, por exemplo, a força muscular, não são adequadamente avaliados por esse método.Mas, portanto, um comando complementando a análise de marcha baseada em vídeo com uma bateria de outros testes de comportamento motor, como força de preensão e caminhada na trave. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a análise da marcha em modelos de camundongos que desenvolvem comprometimento motor com o envelhecimento.

gait-analysis-age-dependent-motor-impairments-mice-with

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Déficits na coordenação motora fina podem ser avaliados com o teste de trave de equilíbrio. Desempenho na trave é quantificado pela velocidade com que o feixe é percorrida eo número de vezes que o mouse desliza na trave.

Avaliação do Equilíbrio e Coordenação Motor em camundongos usando o feixe de equilíbrio

Neste vídeo, descrevemos o procedimento de teste de pegada e análise relacionada para avaliar a marcha e a coordenação motora em camundongos.

Avaliação da marcha por análise de pegadas: um método para testar a coordenação motora em camundongos

Análise cinemática da marcha no plano sagital produz informações altamente precisas sobre como o movimento é executado. Descrevemos a aplicação destas técnicas para identificar déficits da marcha de ratos submetidos a desmielinização mediada por doença auto-imune. Esses métodos também podem ser usados para caracterizar os déficits da marcha para outros modelos de rato com locomoção prejudicada.

Análise cinemática da marcha de sagital em camundongos C57BL/6 sujeitado a MOG35-55 induzido encefalomielite auto-imune Experimental

A avaliação precisa da resposta de dor em um modelo animal neuropática é crítica para investigar a fisiopatologia das doenças dor e desenvolver novos analgésicos. Apresentamos um método sensível e objetivo para determinar a função sensorial do roedor hind pata por um sistema de análise de marcha automática.

Análise de marcha automatizados em ratos com lesão crônica de constrição

A análise de pegada é uma alternativa de baixo custo para programas digitalizados de análise da marcha para pesquisadores que quantifiquem anormalidades de movimento em camundongos. Devido à sua velocidade, simplicidade e potencial longitudinal, é ideal para a fenotipagem comportamental de modelos de mouse.

Análise de marcha de baixo custo para fenotipagem comportamental de modelos de camundongo de doença neuromuscular

A análise automatizada da marcha é uma ferramenta viável para avaliar a recuperação funcional em modelos de roedores de lesão nervosa periférica e lesão de contusão medular. Embora exija apenas uma configuração para avaliar a função locomotor em vários modelos experimentais, o ajuste meticuloso e macio e o treinamento dos animais é altamente importante.

Análise automatizada da marcha para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesão de contusão do nervo periférico ou da medula espinhal

Aqui descrevemos o sistema RatWalker, construído redesenhando o aparelho MouseWalker para acomodar o aumento do tamanho e peso dos ratos. Este sistema usa reflexão interna total frustrada (FTIR), captura de vídeo de alta velocidade e software de análise de acesso aberto para rastrear e quantificar os parâmetros da marcha.

Aplicando o Sistema RatWalker para Análise de Marcha em um Modelo de Rato Genético da Doença de Parkinson

Este manuscrito apresenta um conjunto de testes comportamentais altamente reprodutíveis para validar um modelo de camundongo com síndrome de Angelman.

Caracterização comportamental de um modelo de camundongo com síndrome de Angelman

Um pipeline experimental para descrever quantitativamente o padrão locomotor de camundongos que caminham livremente usando a caixa de ferramentas MouseWalker (MW) é fornecido, variando de gravações de vídeo iniciais e rastreamento até análise pós-quantificação. Um modelo de lesão por contusão medular em camundongos é empregado para demonstrar a utilidade do sistema MW.

Uso do MouseWalker para Quantificar a Disfunção Locomotora em um Modelo de Lesão Medular em Camundongos

O presente estudo descreve um teste de comportamento motor fino para examinar déficits motores em modelos de roedores, incluindo o rato TgF344-AD, usando aprendizado de máquina.

Uma tarefa motora fina para estudar a cinemática articular em um modelo pré-clínico de doença neurodegenerativa

Aprenda análise cinemática da marcha para monitorar alterações motoras em camundongos com neurodegeneração. Este método permite detectar precocemente déficits de coordenação relacionados ao envelhecimento.

Análise de marcha de idade-dependente de perturbações Motor em camundongos com neurodegeneração

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