Formação de biofilme oral em diferentes materiais para implantes dentários

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a formação de biofilme oral em titânio e zircônio materiais para pilares de prótese dentária, incluindo a análise de viabilidade de células bacterianas e características morfológicas. Um modelo in situ associado com técnicas de microscopia poderoso é usado para a análise do biofilme oral.

Formação de biofilme oral em diferentes materiais para implantes dentários. Os biofilmes bacterianos são comunidades microbianas complexas, funcional e estruturalmente organizadas, caracterizadas por uma diversidade de espécies microbianas que sintetizam matriz polimérica extracelular biologicamente ativa. Os implantes dentários e seus componentes protéticos são propensos à colonização bacteriana e à formação de biofilme.

O uso de materiais com composição química e topografia superficial que proporcione baixa adesão microbiana pode reduzir a prevalência e a progressão das doenças peri-implantares. Tendo em vista a complexidade geral do ambiente e a heterogeneidade do biofilme oral, são necessárias técnicas microscópicas que possam permitir a análise estrutural do biofilme dos dentes e das superfícies do material dentário. Este artigo descreve uma série de protocolos implementados para comparar a formação de biofilme oral em diferentes materiais para implantes dentários.

As etapas envolvidas no uso da formação de biofilme neste estudo foram as seguintes:Registrar a arcada superior por meio de uma impressão de alginato. Despeje a impressão de alginato com pedra Tipo IV para fabricar um modelo de arco maxilar. Fabrique clipes retentores de fio microcromado e localize-os no modelo.

Manipule a resina acrílica autopolimerizável de acordo com as instruções do fabricante e pressione a resina acrílica entre duas placas de vidro durante a fase plástica para fazer uma folha de três milímetros de espessura. Coloque a folha de acrílico na região palatina do modelo, de acordo com o design do dispositivo, e corte o excesso de resina acrílica antes da polimerização. Fabrique discos de cera usando uma matriz com 10 milímetros de diâmetro e dois milímetros de espessura.

Incorpore quatro discos de cera na resina acrílica, dois deles entre os pré-molares e os outros dois próximos aos segundos molares. Deixe a resina acrílica polimerizar em um pote de pressão sob 20 libras de ar comprimido por 20 minutos. Finalize o dispositivo intraoral usando uma peça de mão elétrica e pontos de fresagem e polimento.

Polir as superfícies da amostra com lixas resfriadas a água para diminuir a abrasividade. Limpe as amostras com detergente líquido e água da torneira e banho ultrassônico de álcool isopropílico por 15 minutos. Em seguida, seque com papel toalha absorvente.

Fixe as amostras no dispositivo intraoral com adesivo hot-melt não tóxico. Instale o dispositivo que contém as amostras na cavidade oral. O dispositivo intraoral contendo as amostras deve ser usado por 48 horas.

Prepare uma solução moribunda adicionando três microlitros de SYTO 9 e três microlitros de iodeto de propídio a um mililitro de água destilada estéril. Transfira as amostras para uma placa de 24 poços e lave bem com PBS para remover as células não aderentes. Adicione o volume apropriado de solução de corante fluorescente para cobrir a amostra contendo biofilme.

Adicione o corante com muito cuidado para não desorganizar o biofilme. Incubar a amostra por 20 a 30 minutos em temperatura ambiente protegida da luz. Lave suavemente a amostra de biofilme com água destilada estéril para remover o excesso de corante.

Coloque a amostra em um prato com fundo de vidro para análise de biofilme, usando microscopia de varredura a laser multifóton. O tamanho das imagens obtidas foi de 5,16 x 5,16 mm, o que corresponde a 26,64 milímetros quadrados da área total de cada espécime ou 33,94% da área total. As imagens foram analisadas usando o software Fiji.

Cada célula foi selecionada usando a ferramenta de seleção e a intensidade da fluorescência foi medida através da densidade integrada de pixels, subtraindo o fundo da imagem. Selecionar três amostras de cada material de teste e avaliar a composição química em duas áreas diferentes de cada amostra, usando um microscópio eletrônico de varredura acoplado a um espectrômetro de energia dispersiva. Fixe o biofilme imergindo os espécimes em 2,5% de glutaraldeído diluído em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M por 24 horas.

Lave em tampão PBS. Pós-fixação com tetróxido de ósmio a 1% por uma hora. Lave em tampão PBS.

Desidrate as amostras de biofilme com cuidado, mantendo-as imersas em concentrações crescentes de soluções de etanol. Transferir os provetes para o secador de pontos críticos e fazer várias substituições por dióxido de carbono até que os provetes estejam secos. Remova as amostras secas do aparelho e monte-as nos suportes do microscópio eletrônico de varredura.

Disperse uma camada de 20 nanômetros de camada de ouro nas superfícies da amostra por 120 segundos. A densidade de colonização do biofilme após 48 horas de crescimento in situ foi representada neste estudo pela proporção da área colonizada em relação aos discos de titânio e zircônia em relação à área total escaneada do espécime por microscopia multifotônica. A figura mostra bactérias aderidas às superfícies dos materiais de teste.

Uma maior densidade de biofilme foi observada nas superfícies dos discos de titânio fundidos e usinados do que nos discos de zircônia. Esta figura mostra bactérias vivas e mortas aderidas à superfície dos espécimes. Neste protocolo, o iodeto de propídio tingido com ácido nucleico penetra apenas em bactérias com membrana danificada e, portanto, emite um sinal fluorescente vermelho relacionado a células mortas.

O SYTO 9 penetra nas células bacterianas com membrana intacta ou comprometida e emite sinal fluorescente verde de microrganismos vivos. A viabilidade bacteriana celular foi semelhante entre os materiais de teste com predominância de microrganismos vivos em todos os grupos. Rachaduras, ranhuras ou defeitos de abrasão produzidos durante o processo de polimento e/ou usinagem estavam presentes na superfície dos diferentes materiais analisados.

Nos discos de Zircônia, foram observadas grandes áreas com ausência de microrganismos e presença de pequenos agregados microbianos polimórficos constituídos principalmente por cocos e bacilos e bactérias filamentosas. A presença de cocos e bacilos estava espalhada nas superfícies dos discos de titânio usinados. Espécimes de titânio fundido apresentaram colônias de microrganismos envolvidos em uma matriz com aparência de biofilme na superfície.

Menos material de matriz foi observado na superfície dos discos de zircônia, em comparação com os discos de titânio usinado e titânio fundido. A análise da EDS revelou nos discos de zircônia 70,83% de zircônia. Nos discos de titânio fundido, 95,16% de titânio e nos discos de titânio usinados, 89,86% de titânio.

O protocolo descrito neste estudo proporcionou preservação satisfatória do biofilme de 48 horas, demonstrando, portanto, adequação metodológica. O uso da fonte de flúor e o processamento das imagens por meio de microscopia multifotônica permitiram a análise da integridade bacteriana em uma população muito heterogênea de microrganismos de uma área representativa deste espécime com dano celular mínimo. A preparação de espécimes biológicos para microscopia eletrônica promoveu a preservação estrutural do biofilme, o que resultou em imagem com boa resolução e sem artefatos.

Isso permitiu a visualização e caracterização morfológica dos microrganismos aderidos.