Name: Formação de biofilme oral em diferentes materiais para implantes dentários (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda a avaliar a formação de biofilme oral em titânio e zircônia para implantes dentários usando microscopia avançada. Este método ajuda pesquisadores a analisar viabilidade bacteriana e características morfológicas.

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Os autores graças a José Augusto Maulin do laboratório multiusuário de microscopia (Faculdade de medicina de Ribeirão Preto) pela ajuda generosa com o EDS e SEM análises e Hermano Teixeira Machado, por sua generosa assistência técnica na edição de vídeo.

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da escola de Odontologia de Ribeirão Preto, e o participante voluntário assinou o termo de consentimento (processo 2011.1.371.583).
1. biofilme formação in Situ
<ol><li>
Seleção dos participantes
	<ol>
<li>Selecionar os pacientes com base nos seguintes critérios de inclusão: um indivíduo saudável, com uma dentição completa e sem sinais clínicos de doenças orais.</li>
		<li>Excluir os pacientes com base nos seguintes critérios de exclusão: gravidez, lactação, cárie dentária, doença periodontal ou tratamento com antibióticos nos últimos 3 meses, fumante ou qualquer doença sistêmica que pode influenciar o estado periodontal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação do dispositivo intraoral
	<ol>
<li>Registro do arco maxilar por meio de uma impressão de alginato.</li>
		<li>Prepare tipo IV pedra adicionando 19 mL de água para 100 g de pó de pedra. Despeje a pedra do molde de alginato para fazer um modelo do arco maxilar.</li>
		<li>Projetar e fabricar um dispositivo intraoral acrílico para apoiar os provetes (discos de cerâmicos e titânio).<ol>
<li>Fabricar fechos retentivos do fio de NiCr (0,7 mm no diâmetro) usando alicates ortodônticos #139 e posicioná-los sobre o modelo. Para posicionar a pinça entre os pré-molares superiores, dobre uma das extremidades de cada fio para que eles formam um loop.<ol>
<li>Adapte o loop na região da papila interdental. A oclusal, inserir uma curvatura suave para não interferir com os pontos de contacto e a oclusão. Fazer um 90° dobre no fim da mordaça para uma retenção no acrílico.</li>
				<li>Para encaixar o molar superior segundo o grampo, adaptar-se a curvatura do fio no terço cervical (vestibular) para contornar o dente (distal) e fazer um 90° dobre no fim da mordaça para uma retenção no acrílico. Nota: A fim de fornecer retenção/estabilidade adequada para o dispositivo intraoral, os fechos retentivos foram posicionados entre os pré-molares superiores e aspecto distal do segundo molar de ambos os lados da arcada dentária.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Manipular a resina acrílica autopolimerizável de acordo com as instruções do fabricante e pressione a resina acrílica entre 2 placas de vidro (com um espaçador de espessura de 3mm interposta) durante a fase de plástico, para fazer uma folha de espessura de 3 mm.</li>
			<li>Coloque a folha acrílica na região palatal do modelo, de acordo com o projeto do dispositivo e retire a excesso da resina acrílica com um carver, antes de polimerização.</li>
			<li>Fabrica discos de cera, usando uma matriz metálica [10 mm de diâmetro, 2 mm de espessura (área de superfície de 78,5 mm2)] colocando cera derretida na matriz e esperando a cera para solidificar. Manualmente incorpore a resina acrílica, 2 deles entre os pré-molares e os outros 2 ao lado do segundo molares 4 discos de cera.</li>
			<li>Deixe a resina acrílica polimerizar-se em uma panela de pressão abaixo dos 20 psi de ar comprimido por 20 min.</li>
			<li>Terminar o dispositivo intraoral com um handpiece de laboratório de prótese dentária elétrica e cortador e lustrá-la com borracha abrasiva.</li>
			<li>Ajuste o dispositivo para um ajuste apropriado na boca usando o equipamento descrito acima.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação das amostras de titânio e zircônio Nota: As amostras (n = 14) são 10 mm de diâmetro e 2 mm de espessura e tem uma área de 78,5 mm2.<ol>
<li>Polir as superfícies dos espécimes com lixas Water-cooled decrescente de abrasividade (600, 1200 e 2000 grão), por aproximadamente 20 min. Nota: O polimento das amostras foi realizado para padronizar a rugosidade da superfície de 0,2 µm.</li>
		<li>Limpar e desinfectar os espécimes e dispositivo intraoral com detergente líquido e água da torneira e em seguida, use álcool isopropílico banho de ultra-sons para 15 min. seque-as com toalhas de papel absorvente.</li>
		<li>Corrigi os espécimes no dispositivo intraoral oral com cerca de 0,1 mL de adesivo quente do derretimento tóxicos (Figura 1).</li>
		<li>Instale o dispositivo, contendo os espécimes na cavidade oral. Nota: O dispositivo intraoral, contendo os espécimes deve ser usado por 48 h. O dispositivo foi removido e armazenado em salina tamponada fosfato (PBS), enquanto o paciente estava comendo e realizando a limpeza oral.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. avaliação da viabilidade bacteriana
Nota: de tamanho da amostra n = 10.
<ol><li>Preparar uma solução de tingimento, adicionando 3 µ l de SYTO9 (verde tintura fluorescente ácido nucleico) e água destilada, 3 µ l de iodeto de propidium (corante vermelho fluorescente de ácidos nucleicos) a 1 mL de estéril. Nota: Prepare soluções, protegidas da luz.</li>
	<li>Transferir as amostras para uma placa de 24 e lave-as com PBS para remover todas as células não-aderentes.</li>
	<li>Adicione o volume apropriado (1 mL) da solução de tintura fluorescente para cobrir a amostra contendo biofilme. Adicione o corante com muito cuidado para não desorganizar o biofilme.</li>
	<li>Incube a amostra por 20-30 min à temperatura ambiente, protegida da luz.</li>
	<li>Lave delicadamente a biofilme amostra com água destilada esterilizada para remover qualquer corante em excesso.</li>
	<li>Colocar a amostra em um prato fundo de vidro e executar do laser do multiphoton microscopia para a análise de biofilme. Nota: A análise da viabilidade de células bacterianas foi realizada usando um sistema de microscopia do multiphoton. A fluorescência de iodeto de propidium foi detectada usando um filtro com um comprimento de onda de excitação/emissão de 546/680 nm e 477/600 nm para SYTO9. O tamanho das imagens obtidas foi 5.16188 x 5.16188 mm, o que corresponde a 26,64 mm2 de área total de cada amostra (78,5 mm2) ou 33.94% da área total. As imagens foram feitas a partir da porção mais central da amostra, com resolução de 1.024 x 1.024 pixels. O canal vermelho e verde canal imagens foram analisadas separadamente, usando software de Fiji31. Cada célula foi Selecionadoda usando uma ferramenta de seleção e a intensidade da fluorescência foi medida através da densidade integrada dos pixels, subtraindo-se o fundo da imagem.</li>
</ol>3. análise da composição química dos espécimes por espectroscopia de energia dispersiva (EDS)
Nota: de tamanho da amostra n = 3.
<ol><li>Selecione 3 amostras de cada material de teste livre de biofilme e avaliar a composição química de cada amostra, usando um microscópio eletrônico de varredura acoplado a um espectrômetro de energia dispersiva, com uma tensão de feixe de elétrons de 10 kV32em 2 áreas diferentes.</li>
</ol>4. morfológica análise do biofilme bacteriano por microscopia eletrônica
Nota: de tamanho da amostra n = 1.
<ol><li>Corrigi o biofilme por imersão dos espécimes em glutaraldeído 2,5% diluído em buffer de cacodylate de sódio 0,1 M, pH 7,0-7.3, por 24 h.</li>
	<li>Lavar a amostra em tampão PBS (pH = 7,6).</li>
	<li>O postfix o biofilme com tetróxido de ósmio 1% por 1h.</li>
	<li>Lavar a amostra em tampão PBS (pH = 7,6).</li>
	<li>Desidrate as amostras de biofilme cuidadosamente, mantendo-os imersos em concentrações crescentes de soluções de etanol (50%, 70%, 90%, 95% e 100%). Nota: Execute 3 trocas de etanol em uma concentração de 100%. A etapa de desidratação total leva cerca de 2 h.</li>
	<li>Transferir as amostras do ponto crítico secador e fazer várias substituições com dióxido de carbono (CO2) até que os espécimes estão secos.</li>
	<li>Remova as amostras secas do aparelho e montá-los para os titulares de microscópio eletrônico de varredura.</li>
	<li>Revestimento por pulverização catódica uma camada de 20 nm de ouro na superfície do espécime para 120 s.</li>
	<li>Inserir os discos de ouro-revestido na câmara de microscópio eletrônico de varredura. Obter imagens de 5 diferentes áreas de cada amostra, em 20-30 kV sob pressão variável e em 650 X ampliação12.</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo descrito neste estudo foi desenvolvido para avaliar a formação de biofilme em titânio e zircônio materiais para pilares protéticos, incluindo a análise de viabilidade celular bacteriana e características morfológicas. Para realizar isso, foi desenhado um modelo in situ de formação de biofilmes, constituído por um dispositivo intraoral capaz de acomodar amostras dos materiais teste e mantê-los expostos ao ambiente oral dinâmico por 48 h. O dispositivo foi considerado confortável e fácil de inserir, re...

Biofilmes bacterianos são complexas, funcionalmente e estruturalmente organizaram comunidades microbianas, caracterizam por uma diversidade de espécies microbianas que sintetizam uma matriz extracelular, biologicamente ativo polímero1,2. A aderência bacteriana às superfícies bióticas ou abióticas é precedida por uma formação da película adquirida, composta principalmente de glicoproteínas salivares1,3,4. Fracas físico-químicas interações entre os microrganismos e o pellicle são inicialmente estabelecidas e seguidas por interações mais fortes entre adesinas bacterianas e receptores de glicoproteína da película adquirida. Diversidade microbiana aumenta gradualmente através do coaggregation de colonizadores secundários aos receptores das bactérias já anexados, formando uma comunidade terminousua1,3,4, 5.
Homeostase da microbiota oral e sua relação simbiótica com o host é importante na manutenção da saúde bucal. A disbiose dentro biofilme oral pode aumentar o risco para o desenvolvimento da cárie e doença periodontal2,5. Estudos clínicos demonstram uma relação de causa-efeito entre o acúmulo de biofilme sobre dentes ou implantes dentários e o desenvolvimento de gengivite ou peri-implante mucosite6,7. A progressão do processo inflamatório leva à peri-implantite e a consequente perda do implante8.
Implantes dentários e seus componentes protéticos são propensos a colonização bacteriana e formação de biofilme9. O uso de materiais com uma composição química e a topografia da superfície que fornece baixa adesão microbiana pode reduzir a prevalência e progressão de doenças de peri-implante9,10. O titânio é o material mais utilizado para a fabricação de pilares protéticos para implantes; no entanto, materiais cerâmicos foram introduzidos recentemente e estão ganhando popularidade como uma alternativa ao titânio devido a suas propriedades estéticas e biocompatibilidade11,12. Também importante, os materiais cerâmicos têm sido associados com um potencial supostamente reduzido para aderir aos microrganismos, principalmente devido à sua rugosidade da superfície, molhabilidade e energia de superfície livre10,13.
Estudos in vitro têm contribuído para avanços significativos na compreensão da adesão microbiana a Pilar protético superfícies9,14,15,16,17. No entanto, o ambiente dinâmico da cavidade oral, caracterizada pela sua variação de temperatura e pH e disponibilidade de nutrientes, bem como pela presença de forças de cisalhamento, não é reproduzível em vitro protocolos experimentais18, 19. Para superar este problema, uma alternativa é o uso de modelos em situ da formação de biofilme, que vantajosamente preserva sua estrutura tridimensional por ex vivo análise10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
A análise da estrutura complexa do biofilme formado em substratos orais requer o uso de técnicas de microscopia capazes de exibir matéria densa opticamente25. Microscopia eletrônica de varredura do laser do multiphoton é uma opção moderna para análise estrutural de biofilme26. É caracterizada pelo uso de óptica não-linear com uma fonte de iluminação perto do comprimento de onda infravermelho, pulsada femtoseconds27. Este método é indicado para a aquisição de imagens de autofluorescência marcados por fluorophores, além de imagens geradas por sinais ópticos não-lineares derivados de um fenômeno conhecido como segunda geração harmônica ou materiais. Entre as vantagens da microscopia do multiphoton é a profundidade da imagem grande obtida com mínima célula danos causados pela intensidade da luz da excitação27.
Para uma análise de viabilidade de biofilme em superfícies abióticas por microscopia do multiphoton, o uso de fluorescente ácido nucleico tinge-se com diferentes características espectrais e uma capacidade de penetração nas células bacterianas é necessário28. Fluorophores SYTO9 (verde-fluorescente) e iodeto de propidium (vermelho-fluorescente) podem ser usados para uma diferenciação visual entre bactérias vivas e mortas28,29,30. Iodeto de propidium penetra apenas bactérias com membranas danificadas, enquanto SYTO9 entra em células bacterianas, com uma membrana intacta e comprometida. Quando ambos os corantes estão presentes dentro de uma célula, iodeto de propidium tem uma maior afinidade para os ácidos nucleicos e desloca SYTO9, marcando-o vermelho28,30.
Tendo em conta o ambiente oral complexidade e oral biofilme heterogeneidade, microscopia, são necessárias técnicas que pode permitir a análise de biofilme das superfícies dos dentes e materiais dentários. Este artigo descreve uma série de protocolos implementados para comparar a formação de biofilme oral em titânio e materiais cerâmicos para pilares protéticos, bem como os métodos envolvidos em análises de biofilmes oral a nível morfológico e celular.

<table><tbody><tr><td>Hydrogum 5</td><td>Zhermack Dental</td><td>C302070</td><td></td></tr><tr><td>Durone IV</td><td>Dentsply</td><td>17130500002</td><td></td></tr><tr><td>fio NiCr&nbsp;</td><td>Morelli</td><td>55.01.070</td><td></td></tr><tr><td>JET auto polimerização acrílica</td><td>Cl&aacute; ssico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cera dental&nbsp;</td><td>Cl&aacute; ssico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pote de pressão&nbsp;</td><td>Essencedental</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lixas 600 grão</td><td>NORTON</td><td>T216</td><td></td></tr><tr><td>Lixas 1200 grão</td><td>NORTON</td><td>T401</td><td></td></tr><tr><td>Lixas 2000 grão</td><td>NORTON</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de polimento metalográfico</td><td>Arotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo hot melt</td><td>TECSIL</td><td>PAH M20017</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer LIVE/DEAD Kit de Viabilidade de Biofilme</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta, 10 &micro; L</td><td>KASVI</td><td>K8-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta, 1.000 &micro; L</td><td>KASVI</td><td>K8-1000B&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços&nbsp;</td>Prato com Fundo de Vidro <td>KASVI</td><td>K12-024</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido AxioObserver&nbsp;</td><td>Laser ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision II</td><td>Objetivo Coerente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plano EC-Neofluar 40x/1.30 Óleo Sensores SDD DIC</td><td>ZEISS</td><td>440452-9903-000</td><td></td></tr><tr><td>- X-Max 20mm&sup2;</td><td>Solução de</td> glutaraldeído da Oxford Instruments <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de cacodilato de sódio&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>97068&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S9638</td><td>Usado para preparação de solução salina tamponada com fosfato</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9791&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>1.06404</td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9333&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto para análise EMSURE</td><td>MERK</td><td>1.00983</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 Secador de Ponto Crítico</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JSM-6610 Série Microscópio Eletrônico de Varredura</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD 050 Revestidor de pulverização catódica</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

formação de biofilme oral em diferentes materiais para implantes dentários

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Implantes dentários e seus componentes protéticos são propensos a colonização bacteriana e formação de biofilmes. O uso de materiais que fornece baixa adesão microbiana pode reduzir a prevalência e a progressão das doenças peri-implante. Tendo em conta o ambiente oral complexidade e oral biofilme heterogeneidade, microscopia, são necessárias técnicas que pode permitir uma análise de biofilme das superfícies dos dentes e materiais dentários. Este artigo descreve uma série de protocolos implementados para comparar a formação de biofilme oral em titânio e materiais cerâmicos para pilares protéticos, bem como os métodos envolvidos em análises de biofilmes oral a nível morfológico e celular. O modelo in situ para avaliar a formação de biofilme oral em titânio e zircônio materiais para pilares de prótese dentária, conforme descrito neste estudo fornece uma boa conservação de biofilme a 48 h, mostrando assim a adequação metodológica. Microscopia do multiphoton permite a análise de um representante da área do biofilme formado sobre os materiais de teste. Além disso, o uso de fluorophores e o processamento das imagens usando microscopia do multiphoton permite a análise da viabilidade bacteriana em uma população muito heterogénea de microorganismos. A preparação de espécimes biológicos para microscopia eletrônica promove a preservação estrutural do biofilme, imagens com boa resolução e sem artefatos.

A densidade de colonização do biofilme após 48 h de crescimento em situ foi representada neste estudo pela proporção da área colonizada sobre os discos de titânio e zircônio em relação à área total digitalizada da amostra usando microscopia do multiphoton ( 26.64 mm2). A Figura 2 representa a densidade de colonização bacteriana na superfície dos 3 materiais testados. Uma maior densidade de biofilme foi observada sobre as superfícies do ele...

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a formação de biofilme oral em titânio e zircônio materiais para pilares de prótese dentária, incluindo a análise de viabilidade de células bacterianas e características morfológicas. Um modelo in situ associado com técnicas de microscopia poderoso é usado para a análise do biofilme oral.

Formação de biofilme oral em diferentes materiais para implantes dentários

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

Formação de biofilme oral em diferentes materiais para implantes dentários. Os biofilmes bacterianos são comunidades microbianas complexas, funcional e estruturalmente organizadas, caracterizadas por uma diversidade de espécies microbianas que sintetizam matriz polimérica extracelular biologicamente ativa. Os implantes dentários e seus componentes protéticos são propensos à colonização bacteriana e à formação de biofilme.O uso de materiais com composição química e topografia superficial que proporcione baixa adesão microbiana pode reduzir a prevalência e a progressão das doenças peri-implantares. Tendo em vista a complexidade geral do ambiente e a heterogeneidade do biofilme oral, são necessárias técnicas microscópicas que possam permitir a análise estrutural do biofilme dos dentes e das superfícies do material dentário. Este artigo descreve uma série de protocolos implementados para comparar a formação de biofilme oral em diferentes materiais para implantes dentários.As etapas envolvidas no uso da formação de biofilme neste estudo foram as seguintes:Registrar a arcada superior por meio de uma impressão de alginato. Despeje a impressão de alginato com pedra Tipo IV para fabricar um modelo de arco maxilar. Fabrique clipes retentores de fio microcromado e localize-os no modelo.Manipule a resina acrílica autopolimerizável de acordo com as instruções do fabricante e pressione a resina acrílica entre duas placas de vidro durante a fase plástica para fazer uma folha de três milímetros de espessura. Coloque a folha de acrílico na região palatina do modelo, de acordo com o design do dispositivo, e corte o excesso de resina acrílica antes da polimerização. Fabrique discos de cera usando uma matriz com 10 milímetros de diâmetro e dois milímetros de espessura.Incorpore quatro discos de cera na resina acrílica, dois deles entre os pré-molares e os outros dois próximos aos segundos molares. Deixe a resina acrílica polimerizar em um pote de pressão sob 20 libras de ar comprimido por 20 minutos. Finalize o dispositivo intraoral usando uma peça de mão elétrica e pontos de fresagem e polimento.Polir as superfícies da amostra com lixas resfriadas a água para diminuir a abrasividade. Limpe as amostras com detergente líquido e água da torneira e banho ultrassônico de álcool isopropílico por 15 minutos. Em seguida, seque com papel toalha absorvente.Fixe as amostras no dispositivo intraoral com adesivo hot-melt não tóxico. Instale o dispositivo que contém as amostras na cavidade oral. O dispositivo intraoral contendo as amostras deve ser usado por 48 horas.Prepare uma solução moribunda adicionando três microlitros de SYTO 9 e três microlitros de iodeto de propídio a um mililitro de água destilada estéril. Transfira as amostras para uma placa de 24 poços e lave bem com PBS para remover as células não aderentes. Adicione o volume apropriado de solução de corante fluorescente para cobrir a amostra contendo biofilme.Adicione o corante com muito cuidado para não desorganizar o biofilme. Incubar a amostra por 20 a 30 minutos em temperatura ambiente protegida da luz. Lave suavemente a amostra de biofilme com água destilada estéril para remover o excesso de corante.Coloque a amostra em um prato com fundo de vidro para análise de biofilme, usando microscopia de varredura a laser multifóton. O tamanho das imagens obtidas foi de 5,16 x 5,16 mm, o que corresponde a 26,64 milímetros quadrados da área total de cada espécime ou 33,94% da área total. As imagens foram analisadas usando o software Fiji.Cada célula foi selecionada usando a ferramenta de seleção e a intensidade da fluorescência foi medida através da densidade integrada de pixels, subtraindo o fundo da imagem. Selecionar três amostras de cada material de teste e avaliar a composição química em duas áreas diferentes de cada amostra, usando um microscópio eletrônico de varredura acoplado a um espectrômetro de energia dispersiva. Fixe o biofilme imergindo os espécimes em 2,5% de glutaraldeído diluído em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M por 24 horas.Lave em tampão PBS. Pós-fixação com tetróxido de ósmio a 1% por uma hora. Lave em tampão PBS.Desidrate as amostras de biofilme com cuidado, mantendo-as imersas em concentrações crescentes de soluções de etanol. Transferir os provetes para o secador de pontos críticos e fazer várias substituições por dióxido de carbono até que os provetes estejam secos. Remova as amostras secas do aparelho e monte-as nos suportes do microscópio eletrônico de varredura.Disperse uma camada de 20 nanômetros de camada de ouro nas superfícies da amostra por 120 segundos. A densidade de colonização do biofilme após 48 horas de crescimento in situ foi representada neste estudo pela proporção da área colonizada em relação aos discos de titânio e zircônia em relação à área total escaneada do espécime por microscopia multifotônica. A figura mostra bactérias aderidas às superfícies dos materiais de teste.Uma maior densidade de biofilme foi observada nas superfícies dos discos de titânio fundidos e usinados do que nos discos de zircônia. Esta figura mostra bactérias vivas e mortas aderidas à superfície dos espécimes. Neste protocolo, o iodeto de propídio tingido com ácido nucleico penetra apenas em bactérias com membrana danificada e, portanto, emite um sinal fluorescente vermelho relacionado a células mortas.O SYTO 9 penetra nas células bacterianas com membrana intacta ou comprometida e emite sinal fluorescente verde de microrganismos vivos. A viabilidade bacteriana celular foi semelhante entre os materiais de teste com predominância de microrganismos vivos em todos os grupos. Rachaduras, ranhuras ou defeitos de abrasão produzidos durante o processo de polimento e/ou usinagem estavam presentes na superfície dos diferentes materiais analisados.Nos discos de Zircônia, foram observadas grandes áreas com ausência de microrganismos e presença de pequenos agregados microbianos polimórficos constituídos principalmente por cocos e bacilos e bactérias filamentosas. A presença de cocos e bacilos estava espalhada nas superfícies dos discos de titânio usinados. Espécimes de titânio fundido apresentaram colônias de microrganismos envolvidos em uma matriz com aparência de biofilme na superfície.Menos material de matriz foi observado na superfície dos discos de zircônia, em comparação com os discos de titânio usinado e titânio fundido. A análise da EDS revelou nos discos de zircônia 70,83% de zircônia. Nos discos de titânio fundido, 95,16% de titânio e nos discos de titânio usinados, 89,86% de titânio.O protocolo descrito neste estudo proporcionou preservação satisfatória do biofilme de 48 horas, demonstrando, portanto, adequação metodológica. O uso da fonte de flúor e o processamento das imagens por meio de microscopia multifotônica permitiram a análise da integridade bacteriana em uma população muito heterogênea de microrganismos de uma área representativa deste espécime com dano celular mínimo. A preparação de espécimes biológicos para microscopia eletrônica promoveu a preservação estrutural do biofilme, o que resultou em imagem com boa resolução e sem artefatos.Isso permitiu a visualização e caracterização morfológica dos microrganismos aderidos.

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