Name: Métodos para o estudo da regeneração em Stentor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda métodos para cultivar e induzir regeneração em Stentor coeruleus, um modelo de organismo unicelular. Este protocolo detalha técnicas de fragmentação celular e tratamento com sacarose para estudar biologia celular.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH grant R01 GM113602 (WFM) e NSF 1144247 (AL). Reconhecemos o Mark Slabodnick e Natalie Kirkland para desenvolver as versões iniciais de alguns desses protocolos e discussões informativas. Agradecemos a Karina Perlaza e Greyson Lewis pela leitura crítica do manuscrito.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Cultivo de Stentor apresenta uma série de desafios. Em primeiro lugar, para realizar experimentos que exigem um grande número de células, é necessário manter um grande número de culturas Stentor , como as culturas se tornam insalubres quando Stentor concentração excede 20 células/mL. Em segundo lugar, os organismos que podem contaminar Stentor culturas muitas vezes dividem mais rápido que Stentor e oprimem a cultura (um contaminante comum é rotíferos). Assim, é necessário verificar periodicamente o a cultura sob um microscópio e remover os contaminantes. Ocasionalmente, uma nova cultura precisa ser iniciado a partir de um pequeno número de células manualmente resgatou uma cultura contaminada. Isto aumenta o tempo necessário para se manter saudável Stentor culturas. Em terceiro lugar, expandindo uma única célula em uma cultura de 400 mL requer pelo menos um mês, porque o ciclo celular de Stentor é 3-5 dias. Em quarto lugar, ao contrário de outro modelo ciliados, Stentor raramente entram em forma de cisto e eles não podem ser congelados.
Um aspecto importante de cultivo Stentor é a seleção de um organismo de alimentação adequada. Vários métodos para cultivo Stentor foram descritos anteriormente. Um deles sugere para usar leite desnatado para bactérias de cultura que alimentam então Stentor. Tal técnica é eficaz em cultivo Stentor; no entanto, aplicação de técnicas de genômicas requer amostras puras para evitar confusões resultantes de leituras genômicas de organismos comida indefinido. Usando o protocolo atual, Stentor podem ser cultivadas em massa e, porque a comida deles, Chlamydomonas, foi sequenciada, a presença de contaminação genômica do organismo comida pode ser detectada e controlada para. Por razões desconhecidas, o tártaro tinha que reabastecer seus estoques, retornando para onde ele encontrou Stentor antes. Com o protocolo atual, fomos capazes de manter Stentor por anos.
Experimentos de regeneração com Stentor são geralmente simples, mas existem alguns detalhes importantes para manter em mente. Em relação à seção 2, corte Stentor células ao meio podem ser dominadas em minutos. Dominar os procedimentos mais avançados Microcirurgia de Stentor pode exigir uma semana de treinos. Enquanto realizando um tratamento de sacarose ou de ureia (seção 3), se no início da imagem latente, a maioria das células ainda tem suas bandas membranellar, aumentar o tempo de incubação por 10-30 s para quando o tratamento de sacarose é executado em seguida. Não aumentam o tempo de tratamento de sacarose, além de incubação de 3 min porque ele irá resultar em morte celular.
Imagem de Stentor regeneração requer métodos de grandes células de imagem durante longos períodos de tempo. O método de imagem detalhado na seção 4 só pode ser usado com um microscópio vertical. Se um microscópio invertido está disponível, em vez disso, as células podem ser colocadas em um slide ou lamela em câmaras pequenas. Um método é criar uma câmara sem vaselina e cobrir com outra lamela para evitar a evaporação. Alternativamente, uma câmara para uma célula individual pode ser feita por fazer um buraco com um furador do tamanho desejado em um 1 x 1 cm2 quadrados de espaçador de silicone (tabela de materiais), colocação do espaçador em uma lamela, colocando as células na câmara e cobrindo a câmara com outra lamela. Quando a imagem, se não vai a orientação correta para observar as características de cada etapa de regeneração Stentor , toque a placa firmemente, para fazer o contrato de célula. Assistir a célula estender para identificar o estágio de regeneração (extensão completa leva cerca de 45 s). Se a célula estiver ainda na orientação errada, repita as batidas. As imagens mostradas na Figura 1 e Figura 6 foram tiradas por um microscópio estéreo zoom; no entanto, todos os experimentos detalhados podem ser executados usando um 5 X estéreo microscópio de dissecção.
Outro desafio além de cultivo e imaging Stentor é o rastreamento de regeneração, especificamente a quantidade de tempo necessário para identificar estágios. Se a regeneração celular está perfeitamente orientado com a região do primórdio oral claramente visível, a identificação do estágio leva alguns segundos. Às vezes, no entanto, a célula de Stentor é em uma orientação impedindo a clara atribuição de fase de regeneração, tendo assim mais tempo para identificar. A quantidade significativa de tempo necessário para a fase de regeneração de células individuais podem atrasar a quantificação de todas as células em regeneração, diminuindo assim a precisão temporal do estadiamento e exigir que o observador para esperar e refazer a imagem da célula depois mudou-se para uma nova orientação. Consequentemente, esta experiência é tanto tempo e trabalho intensivo. Por estas razões, seria altamente desejável para desenvolver métodos automatizados para detectar células Stentor e atribuição de estágios de regeneração em dados de vídeo microscopia. Estas também permitiria mais experimentos reprodutíveis, aumenta o tamanho da amostra e a remoção de viés humano.
O surgimento de métodos altamente sensíveis, genômicos e proteômica, começou-se a colocar estudos de células únicas em alcance. Para tais análises de célula única, o tamanho gigante de uma célula de Stentor torna desejável cobaia para experimentos de prova de conceito. Para tais experiências ser possível, cultivo Stentor é fundamental, e então os métodos descritos aqui devem desempenhar um papel no desenvolvimento de técnicas mais avançadas de célula única.

As células não são simples sacos de enzimas, mas prefiro altamente complexas máquinas cujos componentes são cuidadosamente dimensionados para o tamanho correto e dispostos em posições bem definidas. A morfogênese das células individuais representa um processo chave em biologia celular e do desenvolvimento, mas seu mecanismo molecular é desconhecido1,2. Enquanto algumas células cultivadas assemelham-se a bolhas, organismos unicelulares podem ter extremamente complicado arquiteturas, exemplificadas pelos complexos padrões corticais vistos em ciliados3,4.
Talvez o exemplo mais extremo de uma célula altamente estruturado é Stentor coeruleus, um heterotrichous gigante ciliados parente Tetrahymena e Paramecium. Stentor é de 1 mm de comprimento e é coberto com mais de 100 listras longitudinais de pigmento azul, alternando com fileiras de cílios organizados pelo paralelas pilhas de fitas de microtúbulos que correm o comprimento da célula inteira. A célula é trombeta-dadas forma (Figura 1), com uma banda de membranellar e um aparelho oral (OA) em sua extremidade anterior e um holdfast que atribui a célula ao substrato em sua extremidade posterior. Além da polaridade claro ântero-posterior, a célula também mostra uma distintiva padronização quiral, tal que o espaçamento entre linhas ciliares gradualmente aumenta no sentido horário. Isso resulta em uma descontinuidade onde se encontra com a linha mais estreita a linha mais ampla e esta região da superfície celular, conhecida como o locus de contraste de listra, pode induzir a formação do segundo conjunto de estruturas da extremidade anterior quando enxertado em outra cela5, tornando-se formalmente equivalente ao organizador de Spemann. Assim, todos os processos-chave da biologia do desenvolvimento tem seus análogos em Stentor: axiation, formação de padrão e indução. Em um embrião, estes processos são movidos por diferenças de destino entre células diferentes, mas no Stentor, eles devem ser conduzidos por destino as diferenças entre regiões diferentes dentro de uma única célula. O que define as diferenças entre as regiões dentro Stentor é um mistério.
Se qualquer parte de Stentor é cortado, a peça que faltava da célula pode regenerar para produzir uma célula normal em questão de horas. Se uma célula é cortado na metade, ou mesmo em pedaços muito pequenos, cada peça reorganiza em uma célula de aparência normal, mas menor e restaura adequada proporcionalidade entre célula peças6,7. Mesmo pequenos fragmentos, 1/64th o tamanho da célula original, são capazes de regenerar-se em uma célula pequena, mas normalmente proporcionada e então crescer para o tamanho6. Stentor , portanto, apresenta uma oportunidade única para estudar os mecanismos da organela tamanho dimensionamento e célula crescimento Regulamento usando métodos cirúrgicos que geralmente são aplicados a nível de tecidos ou organismos todo.
Uma das propriedades de Stentor que lhe permite regenerar-se de uma ampla gama de operações cirúrgicas é que ele contém um único noduladas Macronúcleo (Figura 1), com cerca de 50.000 cópias do genoma inteiro8. Enquanto um fragmento de célula contém pelo menos um nó macronuclear, tem a capacidade de se regenerar totalmente. Outra propriedade subjacente a capacidade de regeneração do Stentoré sua prodigiosa capacidade de cicatrização de feridas. Embora muitos tipos de células são capazes de curar suas feridas9, Stentor é capaz de recuperar-se de uma extraordinária gama de perturbações físicas. Um exemplo de recuperação de Stentor de uma perturbação drástica, juntamente com os métodos para a visualização fluxo citoplasmático em Stentor10 anteriormente foram relatadas. Estes métodos permitem o estudo do efeito de regeneração como ferindo e subsequentes o estado físico do citoplasma.
Stentordo enorme tamanho, capacidade de regeneração extraordinária e o fato de que ela se manifesta de muitos dos fenômenos do desenvolvimento vistos em embriões multicelulares (como organizadores, axiation e padronização) atraíram muitos biólogos do desenvolvimento durante a virada do século passado, incluindo Thomas Hunt Morgan7. Durante os anos 50 e 60, abordagens microcirúrgicos demonstraram uma variedade surpreendente de processos regenerativos e morfogenéticas neste organismo unicelular11. No entanto, Stentor foi desenvolvido como um sistema modelo de biologia molecular apenas recentemente. Durante os últimos anos, o genoma de Stentor foi sequenciado e montados8, e o método para perturbar a expressão gênica usando RNAi alimentando foi desenvolvido12.
Uma das razões que Stentor foi desenvolvido num organismo modelo para a moderna biologia molecular só recentemente foi a dificuldade de cultivar grandes culturas devido ao seu longo ciclo de célula (3 a 5 dias). No entanto, os métodos modernos de genômica e proteômica exigem menos material do que costumavam, e o volume de uma única célula de Stentor é suficiente para estes métodos, mesmo sem recorrer a métodos ultra-sensível que foram desenvolvidos para a análise do single células que são mais pequenas que Stentor. Secção 1 do protocolo detalha o procedimento para o estabelecimento de uma grande cultura de uma única célula de Stentor . A mesma abordagem pode ser usada para estabelecer uma grande cultura de um fragmento de célula obtida pelo corte de uma célula. Secção 1 também fornece as diretrizes para a manutenção saudável Stentor culturas durante longos períodos de tempo. Secção 2 do protocolo prevê que a metodologia de indução de regeneração celular cortando as células manualmente com uma agulha de vidro. Secção 3 do protocolo é dedicado a dois métodos de induzir a regeneração de estruturas celulares específicos (aparelhos de membranellar banda e oral): tratar as células com sacarose ou ureia conduz ao derramamento destas estruturas, seguido por seus regeneração. Secção 4 do protocolo detalha um método para o tratamento de imagens de regeneração de células individuais durante longos períodos de tempo. Secção 4 termina com a descrição dos estágios de regeneração e dicas sobre a análise da dinâmica de regeneração.

<table><tbody><tr><td>Stentor coeruleus cultura viva</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii em ágar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Água de nascente pasteurizada, garrafa de 1 litro</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulose, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Placa de vidro Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro de boca larga com tampa de rosca, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de vidro de 2 xícaras com tampa de vidro</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell material de folha de silicone</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL tubo de microcentrífuga</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Vidro</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Growth Media, otimizado para cultura Chlamydomonas</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Espaçador de silicone, folha de silicone CultureWell, 0.25mm de espessura/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Petrolato, vaselina,</td><td></td> tubos capilares de vidro borossilicato <td>White Spectrum P1037</td><td></td></tr>.<tr><td> OD: 1,2 mm, ID: 0,9 mm, comprimento: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de agulhas P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 microscópio estéreo</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, microscópio estéreo com zoom</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para o estudo da regeneração em stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

As células precisam ser capazes de regenerar as partes para se recuperar de perturbações externas. Os ciliados unicelulares Stentor coeruleus é um organismo modelo excelente para estudar a cicatrização e regeneração celular subsequente. O genoma de Stentor tornou-se disponível recentemente, juntamente com métodos de biologia molecular moderna, tais como RNAi. Estas ferramentas possibilitam estudar regeneração de célula única a nível molecular. A primeira seção do protocolo abrange estabelecendo Stentor culturas de células de células únicas ou fragmentos de células, juntamente com as orientações gerais para a manutenção de culturas de Stentor . Cultivo de Stentor em grandes quantidades permite a utilização de ferramentas valiosas como bioquímica, sequenciamento e espectrometria de massa. As seções subsequentes do protocolo cobrem diferentes abordagens para a indução de regeneração em Stentor. Manualmente, cortando as células com uma agulha de vidro permite estudar a regeneração de partes de células grandes, enquanto o tratamento de células com sacarose ou ureia permite estudar a regeneração de estruturas específicas, localizadas na extremidade anterior da célula. Um método de imagem células individuais de regeneração é fornecido, juntamente com uma rubrica para encenar e analisar a dinâmica da regeneração. Todo o processo de regeneração é dividido em três fases. Visualizando a dinâmica da progressão de uma população de células através dos estágios, é demonstrada a heterogeneidade no calendário de regeneração.

Stentor culturas foram confiantemente estabelecidas e mantidas de células individuais ou fragmentos de células usando a secção 1 do protocolo. Um exemplo representativo de uma cultura saudável grande é mostrado no vídeo 1.
O curso de tempo de regeneração foi medido em Stentor , usando o método de tratamento de sacarose para iniciar a regeneração descrita no passo 3.1, combinado com a imagem e o método de análise, discutido na seção 4 (Figura 7). Este enredo indica que há uma propagação de uma hora de duração no tempo levado pela população de células para alcançar qualquer estágio particular. Este tipo de análise permite o estudo da heterogeneidade temporal no processo de regeneração em uma população de regenerar as células.
A seguir está um resumo de tempo de regeneração que tem sido observado até agora depois de dezenas de tratamentos de sacarose (Figura 4 e Figura 6). Fase 1 é quando as células Stentor parecem lágrimas sem qualquer banda de membranellar (nesta fase começa imediatamente após o fracasso de sacarose). Este estágio dura de 3-6 h 2 fase é quando uma banda membranellar aparece e cresce (3-6 h após o tratamento de sacarose). Este estágio dura de 3-4 h.. fase 3 é quando um Primórdio oral aparece na extremidade posterior da banda membranellar (6-8 h após o tratamento de sacarose), e ambas as estruturas são movidas em direção a extremidade anterior da célula. Esta fase tem a duração de 1-2h. Quando tanto a banda membranellar e o aparelho oral alcançou a extremidade anterior da célula, isto indica a conclusão da regeneração. A célula adoptou a forma de trombeta-como característica Stentor . As células foram completamente regenerada 8-9h após tratamento de sacarose.
<img alt="Diagrama de paramécio com banda membranellar, aparelho oral, vacúolo alimentar, macronúcleo marcado." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1. Instantâneo de Stentor. A banda membranellar e os aparelhos orais são mostrados na extremidade anterior da célula. O holdfast está na extremidade posterior da célula. Stentor Macronúcleo é noduladas. Um bem alimentados Stentor tem verdes comida vacúolos contendo principalmente Chlamydomonas. Barra de escala é 0,5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Configuração do microscópio de dissecação; lâmina de vidro com espécime de Stentor para observação em pesquisa de biologia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2. Instalação de corte Stentor . Corte de célula é executada manualmente manipulando uma agulha de vidro enquanto olha para a célula, usando um microscópio estéreo dissecação comercialmente disponível. O propósito o lenço de papel é fornecer o fundo branco para ver melhor as células. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Sequência de microscopia de células em divisão, marcadas como AF, mostrando estágios no processo mitótico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3. Instantâneos de vídeo 3 ilustrando como cortar um Stentor com uma agulha de vidro. (A) A Stentor imediatamente antes da agulha toca nela. (B) A Stentor suavemente espremido entre uma lâmina de vidro e agulha. (C) A contratada Stentor , reagindo à força da agulha. (D) A Stentor corte pressionando suavemente na célula com o lado da agulha. (E) A Stentor agora cortado em dois, mas não separados. Dois fragmentos de Stentor (F). Barra de escala é 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama do processo de regeneração do stentor com etapas de choque de sacarose/ureia, tubos de centrífuga, estágios celulares." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4. Visualização esquemática da seção 3 e seção 4 do protocolo. Este é um protocolo ilustrado para a realização de sacarose ou tratamento de ureia e observação de regeneração celular. O tempo indicado no painel de fundo é medido desde o início da lavagem 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Configuração de microscópio de dissecação, placa pontual de 9 poços, análise de reação de microgotículas, estudo óptico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5. A configuração para a observação de imagens e/ou direta de regeneração com um microscópio ereto. Em cada gota de µ l 4 pendurados em lamela, há uma célula em fase de regeneração. Água dos poços da placa de vidro local limita a evaporação das gotas. Esta configuração permite que após a regeneração de várias células em paralelo. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise da estrutura celular vegetal; imagens de microscópio A-E; enfatizar as variações da morfologia celular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6. Instantâneos de Stentor em cada estágio da banda membranellar e a regeneração de aparelho oral. (A) estágio 1 é caracterizado por uma forma de lágrima, como celulares e a ausência da banda membranellar. (B) fase 2 caracteriza-se pelo aparecimento da banda membranellar, uma estrutura baseada em cílios que bate continuamente. Membranellar bandas são marcadas com linhas tracejadas brancas em painéis B - D. (C e D) estágio 3 é caracterizado pelo aparecimento do primórdio oral (marcado com uma seta). Primórdio oral parece uma invaginação na extremidade posterior da banda membranellar. O Primórdio oral então vai subir para a parte anterior da célula tornar-se o aparelho oral. (E) regeneração é concluída quando a célula tem adotado a característica forma de trombeta, como Stentor , e o aparelho bucal (marcado com uma seta) alargou-se na extremidade anterior da célula. Barra de escala é 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico de barras de distribuição de estágio celular, tempo pós-choque de sacarose, exibindo quatro estágios ao longo de 9 horas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figura 7. Empilhado apresentando enredo de caixa como proporções de células em todas as fases da regeneração após tratamento de sacarose muda ao longo do tempo. A trama mostra a heterogeneidade no calendário dos estágios de regeneração dentro de uma população de células de regeneração. "Fim de reg." indica a conclusão da regeneração. O número de células: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Copo com cultura de algas verdes para estudo da fotossíntese em experimento de laboratório." src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 1"> Vídeo de 1. Exemplo de uma cultura saudável de Stentor . Geralmente, se uma cultura é concentrado, dividindo a cultura é recomendado. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
<img alt="Gota sob o microscópio; estudo de tensão superficial líquida; método de microscopia; análise educacional." src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 2"> Vídeo 2. A abrandar Stentor com metilcelulose. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
<img alt="Imagem microscópica de uma configuração microfluídica, destacando o posicionamento da gota em um fio fino." src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 3"> Vídeo de 3. Corte Stentor. Células individuais podem ser cortadas manualmente em várias peças sob um estéreo microscópio de dissecção pressionando uma agulha de vidro através da célula. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema com cultura</td>
			<td>Possível solução</td>
			<td>Prevenção de possível</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura é oprimida por rotíferos ou outros organismos grandes.</td>
			<td>Remova tantos Stentor quanto possível, para uma nova placa de cultura. Em seguida lave as células três vezes.</td>
			<td>Lave Stentor quando recebê-los, mesmo quando compra-los de um fornecedor comercial.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura é oprimida por fungos ou outros organismos pequenos.</td>
			<td>Identificar um canto onde há o mínimo Stentor. Nessa área, remover a mídia tanto quanto possível, sem remover muitos Stentor e adicione novo PSW. Misture delicadamente mas completamente para distrubute os organismos invasores. Saltar a próxima refeição e o Stentor comerem.</td>
			<td>Observar a cultura regularmente e remover contaminantes pequenos através da troca de mídia para fresco PSW.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor está deitado em cima um do outro.</td>
			<td>Dividi a cultura para que a concentração seja inferior a 20 células/mL.</td>
			<td>Dividir as culturas mais vezes.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Células de Stentor estão acasalando.</td>
			<td>Alimente a cada 4 dias em vez da cada 5 dias.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>A cultura tem um monte de material escuro de resíduos.</td>
			<td>Retire o máximo do material escuro, resíduos de Stentor , quanto possível, sem retirar as células. Se Stentor são anexados ao material escuro, pipete acima e para baixo para liberar as células Stentor de seus resíduos e em seguida, remova a mídia com o lixo sem remover as células. Ou, remover aqueles Stentor e alimentar adequadamente menos.</td>
			<td>Alimentação Stentor 1ml menos comida por 100 mL de cultura.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Insalubre para o futuro (vacuolated/inchado ou arredondados) Stentor.
</td>
			<td>Remover mídia tanto quanto possível, sem remover muitas células Stentor e adicionar novo PSW.</td>
			<td>Troca a mídia regularmente.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Guia de solução de problemas para cultivo Stentor.

A gigante Ciliophora, Stentor coeruleus, é um excelente sistema para estudar regeneração e cicatrização de feridas. Apresentamos os procedimentos para o estabelecimento de culturas de células de Stentor de células únicas ou fragmentos de células, induzindo a regeneração de células de corte, quimicamente, induzindo a regeneração da banda membranellar e aparelhos orais, imagem e análise de célula regeneração.

Métodos para o estudo da regeneração em Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

O objetivo geral deste protocolo é cultivar Stentor para seu uso como organismo modelo para estudar a regeneração em nível de célula única. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, como como as células constroem estruturas a partir de partes discretas. As principais vantagens do Stentor são que são células únicas que podem se regenerar e que são grandes o suficiente para realizar cirurgias.Geralmente, a parte desafiadora desse protocolo é que as pessoas estão acostumadas a trabalhar com células como culturas, e não como indivíduos. Comece procurando por uma placa de Petri contendo amostra de Stentor sob um microscópio estéreo usando luz oblíqua com uma ampliação de 5X. Observe que as células do Stentor exibem uma forma semelhante a uma trombeta quando estão presas a um substrato.Embora não anexadas, as células de Stentor nadadoras têm uma aparência menos extensa. Usando uma pipeta de um mililitro, transfira células individuais de Stentor para o poço de uma placa de vidro contendo pelo menos 100 microlitros de água de nascente pasteurizada disponível comercialmente. Em seguida, remova cerca de 90% da água do poço sem remover as células do Stentor e adicione 500 microlitros de água de nascente pasteurizada fresca ao poço três vezes para lavar as células.Para alimentar as células, primeiro transfira uma alíquota de um mililitro de uma cultura de Chlamydomonas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para centrifugação a 2.095 g por três minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet em um mililitro de água de nascente pasteurizada para uma segunda centrifugação, seguida de ressuspensão em 500 microlitros de água de nascente pasteurizada. Se for necessária uma cultura clonal de Sttentor, transfira 500 microlitros de meio condicionado por cultura para poços individuais de uma placa de vidro e transfira uma célula de Stentor para cada poço de meio.Alimente cada cultura Stentor com cinco microlitros das Chlamydomonas preparadas a cada 48 horas e mantenha as culturas em uma área sombreada. Conte o número de novas células Stentor antes de cada alimentação e ajuste o volume de Chlamydomonas entregues de acordo. A cada 96 horas, pipetar suavemente o meio de cultura algumas vezes para separar o Stentor do menisco de cada alvéolo e use uma pipeta de um mililitro para aspirar cuidadosamente o meio dos alvéolos sem remover nenhuma célula.Em seguida, adicione 500 microlitros de meio fresco condicionado a cada poço. Quando o número de células em pelo menos um poço exceder 20, adicione 20 mililitros de água de nascente pasteurizada a um frasco de vidro esterilizado autoclavado de boca larga e retire cuidadosamente as células Stentor do fundo de cada poço, conforme demonstrado. Colete todas as células do Stentor com uma pipeta de um mililitro e transfira suavemente as células para o frasco de vidro.Adicione água de nascente pasteurizada fresca ao frasco a cada 48 horas para manter a densidade do Stentor em cerca de 20 células por mililitro e alimente as células do Stentor com 200 a 1.000 microlitros de Chlamydomonas preparadas. Quando o volume da cultura atingir cerca de 90% da capacidade do frasco, transfira todo o conteúdo do frasco para um recipiente de vidro de duas xícaras, alimentando as culturas Stentor de alto volume com dois mililitros de Chlamydomonas preparadas por 100 mililitros de cultura e adicionando água de nascente pasteurizada à cultura a cada quatro a cinco dias para manter a densidade do Stentor em cerca de 20 células por mililitro. Uma vez por semana, inspecione as culturas sob um microscópio de dissecação 5X para rotíferos, fungos e outros crescimentos usando uma pipeta de um mililitro para remover quaisquer microrganismos contaminantes junto com quaisquer células Stentor de formato anormal e incolores.Divida a cultura quando o recipiente de vidro estiver cerca de 90% cheio, adicionando 25 mililitros de água de nascente pasteurizada à cultura e usando uma pipeta de 50 mililitros para separar o Stentor do vidro, conforme demonstrado. Em seguida, mova cerca de 50% da cultura para um novo recipiente de vidro de duas xícaras. Para induzir a regeneração por fragmentação celular, primeiro use um extrator de agulhas para fazer várias agulhas a partir de tubos capilares.Em seguida, colete um Stentor saudável com uma forma de trompete definida, cor azul-esverdeada vibrante e sem grandes vacúolos em uma gota de dois microlitros. Coloque a gota em uma lâmina e diminua o movimento do Stentor com dois microlitros de 4% de metilcelulose. Coloque a gota sob um microscópio de dissecação e segure a agulha de vidro o mais paralela possível à superfície de corte para evitar a quebra da agulha.Pressione suavemente o Stentor contraído com o lado da agulha para separar a extremidade anterior da célula da extremidade posterior da célula. Confirme se ambos os fragmentos têm pelo menos um nó macronuclear e mova os fragmentos para poços individuais de uma placa de vidro. Para induzir a regeneração da banda membranellar e do aparelho oral, transfira 30 a 60 células Stentor em um mililitro de meio de cultura para um tubo de microcentrífuga e use uma pipeta de 200 microlitros para coletar todas as células do tubo em um único volume de 125 microlitros.Dispense as células em um tubo contendo 500 microlitros de sacarose a 25% recém-preparada e inicie um cronômetro. Depois de girar as células no tubo no rack por um minuto, colete todas as células em um único sorteio de 200 microlitros e segure as células na ponta da pipeta até que o cronômetro exiba dois minutos de tratamento com sacarose. Em seguida, ejete o Stentor em um tubo de microcentrífuga contendo um mililitro de água de nascente pasteurizada para três lavagens rápidas.Para obter imagens da regeneração, adicione 100 microlitros de água de nascente pasteurizada em um poço de uma placa de vidro e use uma ponta de pipeta de 20 microlitros para coletar uma célula Stentor em quatro microlitros de meio de cultura. Deposite a gota no meio de uma lamínula de 22 por 22 milímetros quadrados e coloque mais quatro gotas ao redor da gota anterior. Inverta a lamínula e coloque-a delicadamente sobre o poço com água de nascente pasteurizada.Em seguida, imagine as células em regeneração sob um microscópio de luz com a resolução de tempo apropriada. Durante o estágio um da regeneração, que ocorre imediatamente após a lavagem da sacarose, as células do Stentor parecem lágrimas sem qualquer banda de membrana. Após três a seis horas, uma banda de membrana aparece.Este estágio, estágio dois, dura mais três a quatro horas. O estágio três ocorre quando um primórdio oral aparece na extremidade posterior da banda membranellar e ambas as estruturas começam a se mover em direção à extremidade anterior da célula. Esta etapa dura de uma a duas horas.Quando a banda membranellar e o aparelho oral atingem a extremidade anterior da célula, a regeneração está completa e a célula terá adotado a forma característica de trombeta Stentor. Plote a porcentagem de células em cada estágio de regeneração em cada ponto de tempo em um gráfico de caixa empilhado. A medição do tempo de regeneração após o corte celular e o tratamento com sacarose revela uma propagação de uma hora no tempo que a população de células leva para atingir qualquer estágio específico, demonstrando a heterogeneidade temporal do processo de regeneração dentro de uma determinada população de células em regeneração.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar Stentor e iniciar sua regeneração e quantificá-la. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser paciente. O Stentor leva de três a cinco dias para se dividir em cultura e identificar os estágios de regeneração do Stentor requer prática.Essa técnica abrirá caminho para os pesquisadores de biologia celular explorarem a regeneração em Stentor.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um modelo atraente para estudar a diferenciação das células-tronco dentro de um animal vivo é o platelminto planária. Regeneração é estudado por experimentos amputação simples que são facilmente realizados em um laboratório básico e são passíveis de (farmacológicos e...

Farmacológica e funcional Ensaios genética para manipular Regeneração da planária Dugesia japonica</em

Um método eficaz para enxerto de tecido de tamanho definido e consistente entre planaria é descrito. Também incluído é uma descrição de como a técnica de imobilização utilizado para transplante pode ser adaptado, em conjugação com escudos de chumbo, para a irradiação parcial de animais vivos.

Imobilização planária, irradiação parcial e Transplante de Tecidos

Um modelo de implante de stent na artéria carótida do rato é descrito. Comparado com outros métodos similares, este procedimento é muito rápido, simples e acessível, oferecendo a possibilidade de estudar em uma forma conveniente a reação da parede vascular para diferentes stents farmacológicos e os mecanismos moleculares de reestenose.

Um modelo murino de implante de stent na artéria carótida para o Estudo da reestenose

O ciliado gigante Stentor coeruleus é um sistema clássico para estudar a regeneração e a cicatrização de feridas em células únicas. Ao obter imagens das células do Stentor simultaneamente em baixa e alta ampliação, é possível medir os fluxos citoplasmáticos antes, durante e após a ferida.

Visualizando o fluxo citoplasmático durante a cicatrização de feridas unicelulares em Stentor coeruleus

Porque muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas são estudadas no peixe adulto, em vez de o embrião / larvas, foi desenvolvido um ensaio quantitativo regenerativa linha lateral, que pode ser aplicada aos modelos de doenças de peixes-zebra adultos. O ensaio envolveu a resolução neuromasto 1) e 2) os níveis de células de cabelo individuais.

Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

Aqui apresenta-se um protocolo que é baseado em fatias de medula espinhal cultivadas em matrizes multi-eléctrodos para estudar a regeneração funcional de ligações propriospinal in vitro.

Investigando regeneração funcional em organotï¿½icas Medula Espinhal Co-culturas cultivadas em Arrays Multi-eletrodo

Um protocolo de vídeo passo a passo de ressecção apical é demonstrado neste estudo. A ressecção apical é uma abordagem cirúrgica recentemente destacada na pesquisa de regeneração cardíaca de mamíferos. Este estudo pode promover a aplicação da ressecção apical como metodologia padrão na pesquisa sobre o mecanismo subjacente à regeneração cardíaca.

A ressecção apical mouse modelo para estudar precoce Regeneração Mammalian Coração

Aqui demonstramos como induzir e monitorar a regeneração na anêmona-do-mar Nematostella vectensis, um modelo de antozoário cnidário.  Demonstramos como amputar e categorizar a regeneração usando um sistema de estadiamento morfológico e usamos esse sistema para revelar um requisito de autofagia na regeneração de estruturas de pólipos.

Induzindo completa Polyp Regeneração do aboral Physa da Anémona Starlet Vectensis Nematostella

Apresentamos um protocolo para a caracterização da motilidade e comportamento de uma população de cem células de tamanho mícnico a milímetro usando microscopia de campo brilhante e rastreamento celular. Este ensaio revela que Stentor coeruleus transita por quatro fases comportamentalmente distintas ao regenerar um aparelho oral perdido.

Análise dos padrões de motilidade do Stentor durante e após a regeneração do aparelho oral usando rastreamento celular

Aqui descrevemos o fluxo de trabalho para usar o sistema TetON para alcançar a expressão gênica específica do tecido na barbatana caudal do peixe-zebra em regeneração adulta.

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

Aprenda métodos para cultivar e induzir regeneração em Stentor coeruleus, um modelo de organismo unicelular. Este protocolo detalha técnicas de fragmentação celular e tratamento com sacarose para estudar biologia celular.

Métodos para o estudo da regeneração em Stentor

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