Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o sistema nervoso entérico, como o perfil de expressão dos gânglios entéricos no intestino de humanos adultos. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para obter altos rendimentos de RNA de gânglios entéricos humanos, preservando ao máximo a qualidade do RNA. Comece com o tecido intestinal cortado em comprimentos de 20 centímetros.

Primeiro, apare o tecido adiposo e conjuntivo. Evite cortar a serosa, o que pode levar a danos estruturais ao plexo mioentérico. Em seguida, faça uma incisão longitudinal ao longo de todo o comprimento da amostra aparada, de preferência no local de inserção mesentérica.

Em seguida, disseque e descarte as tenias coli do cólon para que o tecido possa se achatar. Agora, espalhe o intestino, com a mucosa voltada para baixo, em uma tábua de corte gelada. Em seguida, corte tiras de 1,25 centímetros de largura ao longo de todo o comprimento do tecido.

À medida que são cortados, transfira cada peça para uma solução de armazenamento de tecido refrigerada para armazenamento temporário. Em seguida, corte cada tira em segmentos de dois a 1,5 centímetros de comprimento. Depois de cortar uma tira em segmentos, seque os segmentos.

É importante que o tecido esteja muito seco para que cristais de gelo não se formem no tecido quando ele estiver congelado. Agora, arrume os pedaços secos de tecido, com a mucosa voltada para cima, em um molde de plástico frio e descartável. Em seguida, alise cada peça usando uma pinça curva para remover as bolhas de ar presas.

Os tecidos se expandirão à medida que forem achatados. Depois de achatar os segmentos de tecido, avalie suas espessuras antes do congelamento. Se necessário, empurre as bordas da amostra para dentro até que a amostra intestinal se aproxime de sua espessura original.

Agora, transfira o molde de base carregado para uma pasta de gelo seco e 2-metilbutano. O tecido deve congelar completamente dentro de 30 a 60 segundos. Em seguida, seque imediatamente o fundo do molde usando lenços frios que foram mantidos em gelo seco.

Agora, verifique a amostra. Anote todas as amostras que não parecem planas. Em seguida, embrulhe o molde em papel alumínio pré-rotulado e resfriado antes do uso.

Em seguida, cubra o papel alumínio com uma camada de filme plástico para minimizar a desidratação. Mantenha as amostras no gelo até que possam ser armazenadas a 80 graus Celsius negativos. Depois de preparar os materiais necessários, despeje um monte de três a cinco milímetros de TFM em um grande suporte de amostra de criostato e transfira imediatamente a amostra intestinal, com o lado da serosa para cima, para o TFM.

Após alguns segundos à temperatura ambiente, transfira o suporte da amostra para gelo seco e cubra-o com gelo seco em pó. Antes de fatiar, certifique-se de que o TFM esteja abaixo do plano do plexo mioentérico. Em seguida, monte o suporte da amostra na cabeça da amostra do criostato e alinhe a amostra com a lâmina do criostato.

Faça o plano do plexo mioentérico paralelo à lâmina de corte. Agora, faça cortes de oito mícrons através da serosa e do músculo longitudinal até atingir o plexo mioentérico. Para localizar o plexo mioentérico, monte uma amostra e core-a com um corante aquoso, como violeta de cristal a 1%.

Para prosseguir, identifique a junção entre as camadas musculares longitudinais e circulares. No início da secção, a serosa será marcada pela presença de tecido conjuntivo. Alguma gordura mesentérica remanescente também pode estar presente ao longo da serosa.

Então, a folha da camada muscular longitudinal externa torna-se visível Uma vez atingida a borda entre as camadas muscular longitudinal e circular, uma porção dos gânglios entéricos será observada. Nas próximas seções, o plexo mioentérico se tornará muito evidente, com grandes faixas de gânglios presentes em uma única seção. Agora, colete seções seriais para a microdissecção de captura a laser.

Resfrie as lâminas PEN no criostato por cinco a 10 segundos e use-as para montar as seções. As melhores seções terão muitos neurônios e glia. Agora, prossiga para manchar e desidratar as seções conforme descrito no protocolo de texto.

Na preparação, insira um cartucho de tampas LCM no LCM microscópio stage. Em seguida, carregue o slide de amostra no palco e adquira uma imagem geral do slide. Identifique o local desejado para o LCM e coloque uma tampa na lâmina.

Em seguida, alinhe o laser infravermelho e ajuste a potência e a duração do laser para um ponto de captura de 20 a 30 mícrons de diâmetro. Em seguida, descreva os gânglios desejados a serem coletados. Certifique-se de ficar dentro do limite da área colecionável na tampa, que é exibida como um círculo verde.

Para cada um dos gânglios delineados por um traço de corte UV, ajuste os pontos IR de modo que haja pelo menos um ponto IR a cada 100 a 500 mícrons para garantir que todos os gânglios sejam coletados quando a tampa for retirada da amostra. Em seguida, pressione o botão IR UV Cut para prosseguir com a coleta de todos os gânglios marcados. Assim que as coletas forem concluídas, mova a tampa para um novo local e repita o processo de coleta.

Isso pode ser repetido por 60 a 80 minutos. Quando a tampa LCM estiver carregada com gânglios suficientes, transfira-a para uma estação de controle de qualidade. Se houver detritos na tampa, limpe-os com um pincel de ponta fina preparado para uso de RNA.

Use uma ponta de pipeta para qualquer detrito difícil de remover. Em seguida, prenda a tampa em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro cheio de 230 microlitros de tampão de lise de RNA. Inverter a tampa, subtrair-a brevemente e incubar a amostra à temperatura ambiente durante 30 minutos.

Mais tarde, centrifugue a amostra por cinco minutos a 5.000 g ou mais rápido e, em seguida, transfira o tubo de microcentrífuga para gelo seco. A amostra agora está pronta para a extração de RNA. Ao puxar duas tampas de gânglios entéricos por amostra, mais de um nanograma de RNA foi obtido, o suficiente para RNA-Seq, e o RNA foi de excelente qualidade.

A integridade do RNA da amostra mostrada é 8,3. Amostras com números de integridade de 7,5 e 6,9 também foram coletadas. No total, mais de 95% de todas as amostras preparadas foram boas o suficiente para RNA-Seq.

A qualidade dos conjuntos de dados de RNA-Seq foi avaliada usando um pipeline de bioinformática. O viés final indica que as amostras foram sequenciadas com sucesso e tiveram apenas um viés modesto de três extremidades primárias. Um gráfico de biótipo genético mostra que os resultados do sequenciamento foram amplamente consistentes.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para coletar réplicas biológicas de RNA de gânglios entéricos de qualidade e quantidade suficientes para RNA-Seq em apenas oito a 12 horas. Ao tentar este procedimento, é importante que as amostras intestinais humanas sejam congeladas o mais planas possível. Isso garantirá que você possa coletar seções transversais muito grandes de gânglios entéricos humanos que são processados de forma rápida e fácil com microdissecção por captura a laser.