Microscopia de fluorescência de luz-folha para capturar imagens 4-Dimensional dos efeitos de modulação de tensão de cisalhamento sobre o coração em desenvolvimento de Zebrafish
10 de agosto de 2018
Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar desenvolvendo corações no zebrafish em 4 dimensões (4D). Imagem 4-D, através de microscopia de fluorescência de luz-folha (LSFM), tem 3-Dimensional (3D) de imagens ao longo do tempo, para reconstruir corações em desenvolvimento. Nós mostramos qualitativa e quantitativamente que a tensão de cisalhamento ativa endocárdico entalhe sinalização durante o desenvolvimento da câmara, que promove trabeculação cardíaca.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da mecanobiologia cardíaca do desenvolvimento, como a modulação da tensão de cisalhamento na trabeculação cardíaca por meio de sinalização de entalhe usando um microscópio de folha de luz 4D. A principal vantagem dessa técnica é que ela ilumina uma seção fina da amostra com um plano de cinco mícrons, levando a menos branqueamento e danos à foto. Além disso, nosso algoritmo computacional nos permite reconstruir um coração de peixe-zebra batendo em 4D.
As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de doenças cardíacas congênitas, pois permite a visualização sequencial in vivo da trabeculação cardíaca em um estágio inicial de desenvolvimento até o fenótipo posterior. Geralmente, as pessoas que são novas nessa técnica descobrirão que pensar em três dimensões ao longo do tempo é difícil de imaginar. Além disso, leva tempo para criar o sistema e alinhá-lo com precisão.
Para começar, separe o peixe-zebra macho e fêmea nos tanques de reprodução usando uma divisória. Em seguida, levante a divisória e permita que o peixe-zebra macho e fêmea se reproduzam. Colete os embriões de peixe-zebra e injete oligo morfolino no embrião para inibir a trabeculação.
Em seguida, prepare um gel de agarose a um por cento adicionando um grama de agarose a 100 mililitros de água destilada e aqueça-o até que toda a agarose esteja dissolvida. Deixe a agarose esfriar e, em seguida, use uma pipeta de 20 microlitros para carregar um pequeno tubo de plástico com um dos embriões preparados e agarose. Prenda o tubo no microscópio stage e use a objetiva dez x.
Ajuste a objetiva usando o botão para que a parte superior do embrião fique em foco. Tire imagens de todo o embrião de peixe em vários ciclos de batimentos cardíacos usando uma espessura de folha leve de cinco mícrons. Colete 500 quadros xy com um tempo de exposição de dez milissegundos.
Em seguida, mova o estágio um mícron no acesso z para uma nova camada e repita o procedimento de imagem. Continue imaginando 500 quadros por plano z até que todo o coração seja totalmente fotografado. Em seguida, abra o software de processamento de imagem e comece a empilhar as imagens em 3D.
Para fazer isso, primeiro clique em dados abertos. Aqui, selecione todas as imagens que devem ser empilhadas em 3D e, em seguida, selecione carregar. Em seguida, adicione o tamanho do voxel de 0,65 por 0,65 por um mícron e clique em ok.
Inserir o tamanho correto do voxel é fundamental para uma análise precisa das imagens 3D. Agora, clique na caixa de visualização do multiplanador e visualize a imagem 3D. Clique com o botão direito do mouse na caixa tiff azul de um ponto, selecione exibir e clique em volran.
No menu de edição, selecione opções e, em seguida, edite o mapa de cores. Ajuste a cor usando as caixas e clique em OK. Ainda no software de processamento de imagem, clique em arquivo e abra os dados da série temporal.
Selecione as tiffs 3D que acabaram de ser feitas clicando em carregar e insira o mesmo tamanho de voxel de antes. Clique com o botão direito do mouse na caixa tiff azul fatiar um ponto e selecione exibir seguido de volran. Agora, clique em editar.
Selecione as opções. Em seguida, selecione editar mapa de cores. Ajuste a cor usando as caixas e clique em OK.
Em seguida, clique com o botão direito do mouse no controle da série temporal, clique no criador de filmes e pressione o botão play para assistir ao filme. Para finalizar, adicione um nome de arquivo, tamanho do quadro, taxa de quadros, qualidade igual a um e digite monoscópico. Em seguida, clique em aplicar.
Por fim, exporte o vídeo. Forças biomecânicas, como estresse de cisalhamento hemodinâmico, estão intimamente envolvidas na morfogênese cardíaca. Aqui, a microscopia de fluorescência de folha de luz foi usada para visualizar as cristas trabeculares projetando-se para o lúmen ventricular 75 horas após a fertilização.
Às 100 horas após a fertilização, uma rede trabecular pode ser vista claramente. Em um embrião tratado com a microinjeção gata1aMO, a hematopoiese e a viscosidade são reduzidas em 90%. Essa diminuição da viscosidade atenuou o estresse de cisalhamento hemodinâmico, resultando em um início tardio e uma rede trabecular menos densa.
Este atraso e densidade da rede trabecular foi capaz de ser recuperado pela regulação da expressão gênica relacionada ao entalhe, resgatando a formação trabecular em 75 horas após a fertilização e em 100 horas após a fertilização. Assim, os oligonucleotídeos morfolinos gata1a reduziram as forças hemodinâmicas, levando à regulação negativa da sinalização de entalhe, enquanto o resgate de Nrg1-mRNA regulou os genes relacionados ao entalhe e reiniciou a trabeculação. Uma vez dominada, essa técnica de imagem pode ser concluída em aproximadamente duas horas, se realizada corretamente.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de desenvolvimento cardíaco estudarem os fatores do gene notch, responsáveis pela formação adequada da trabeculação no peixe-zebra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como adquirir imagens usando microscopia de iluminação plana seletiva e criar arquivos de imagem 4D. Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser extremamente perigoso.
E precauções, como usar óculos adequados, devem sempre ser tomadas durante este procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para visualizar corações em desenvolvimento em peixe-zebra usando microscopia de fluorescência de folha de luz 4-D (LSFM). O método permite a reconstrução do desenvolvimento cardíaco ao longo do tempo, revelando o papel do estresse de cisalhamento na ativação da sinalização Notch endocardial durante o desenvolvimento das câmaras.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do desenvolvimento
- Mecanobiologia cardíaca
- Técnicas de imagem
Fundo
- Entender o desenvolvimento cardíaco é crucial para diagnosticar doenças cardíacas congênitas.
- O estresse de cisalhamento influencia a trabeculação cardíaca através da sinalização Notch.
- A imagem 4-D fornece insights sobre processos biológicos dinâmicos.
- A microscopia de folha de luz minimiza o branqueamento foto e o dano.
Objetivo do Estudo
- Visualizar o desenvolvimento cardíaco em peixe-zebra em tempo real.
- Investigar os efeitos do estresse de cisalhamento na trabeculação cardíaca.
- Desenvolver um algoritmo computacional para reconstrução cardíaca 4-D.
Métodos Usados
- Microscopia de fluorescência de folha de luz 4-D (LSFM).
- Reconstrução de corações de peixe-zebra batendo usando algoritmos computacionais.
- Visualização sequencial dos estágios de desenvolvimento cardíaco.
- Análise dos efeitos do estresse de cisalhamento na sinalização Notch.
Principais Resultados
- O estresse de cisalhamento ativa a sinalização Notch endocardial durante o desenvolvimento das câmaras cardíacas.
- A técnica de imagem 4-D permite a observação detalhada da trabeculação cardíaca.
- O branqueamento foto reduzido e o dano melhoram a qualidade da imagem.
- O método auxilia na compreensão dos mecanismos das doenças cardíacas congênitas.
Conclusões
- A técnica 4-D LSFM é uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento cardíaco.
- Os insights obtidos podem levar a melhores métodos de diagnóstico para doenças cardíacas congênitas.
- Aplicações futuras podem se estender a outras áreas da biologia do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding hemodynamic forces in cardiac development provides mechanistic insights into congenital heart disease pathways, supporting target validation in preclinical models. Light-sheet fluorescence microscopy enables quantitative, dynamic visualization of shear stress effects on Notch signaling, a pathway implicated in ventricular non-compaction. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking biomechanical inputs to molecular outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the causal relationship between hemodynamic shear stress and Notch signaling in trabeculation formation.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of genetic and pharmacological modulators of cardiac morphogenesis.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing how reduced shear stress down-regulates Notch target genes and attenuates trabeculation.
- Operational Value: Facilitates rescue experiments, such as Nrg1 mRNA co-injection, to confirm target pathway specificity and reversibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative 4-D readouts of trabecular density and initiation timing for dose-response analysis.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols across experimental conditions using synchronized light-sheet acquisition and voxel-based reconstruction.
- Scientific Value: Enables shear stress modulation via gata1a-MO to create controlled hypodynamic conditions for assay validation.
- Operational Value: Produces scalable, reproducible 3D+time datasets suitable for high-content analysis pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects endothelial Notch gene expression under pulsatile flow to in vivo trabeculation phenotypes, strengthening translational continuity.
- Operational Value: Provides a preclinical zebrafish model for studying Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy mechanisms.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular rescue (e.g., Nrg1) with phenotypic recovery of trabeculation.
- Operational Value: Supports cross-functional collaboration through shared 4-D visualization platforms for cardiology, genetics, and bioengineering teams.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of mechanotransduction pathways in cardiac development, bridging phenotypic screening to target validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how shear stress modulates Notch signaling during ventricular chamber formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on trabecular network dynamics for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates synchronized 4-D image stacks with voxel-scale precision, enabling statistical comparison of hemodynamic conditions.
- Translational Research: Links in vivo trabeculation phenotypes to in vitro endothelial flow responses, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying hemodynamic influences across developmental and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological pathway interpretation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through synchronized 4-D acquisition and computational reconstruction.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early phenotypic assessment of cardiac morphogenesis modifiers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in shear stress-Notch-trabeculation axes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection techniques, and light-sheet microscopy alignment.
- Dependent on specialized instrumentation including selective plane illumination microscopy and high-speed sCMOS cameras.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition parameters, voxel sizing, and time-series synchronization.
- Involves adaptation considerations when translating protocols across different genetic backgrounds or disease models.
- Limited by the physical accessibility of the embryonic heart and the need for precise temporal sampling across cardiac cycles.
