Avaliação da função renal em modelos do rato da doença Glomerular

Este protocolo descreve um rim completo check-up que deve ser realizado em modelos do rato da doença glomerular. Os métodos permitem análise detalhada funcional, estrutural e mecanicista da função glomerular, que pode ser aplicada a todos os modelos do rato da doença glomerular.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da doença glomerular em relação ao fenótipo funcional e estrutural do glomérulo e permite a análise mecanicista da patologia renal. A principal vantagem dessa técnica é que ela é adaptável a todos os modelos classificados de doença glomerular. Para avaliação da relação albumina-creatinina urinária, coloque um camundongo macho de seis a oito semanas em uma gaiola metabólica contendo água e alimentos dietéticos enriquecidos em uma sala silenciosa.

Após seis horas, retorne o camundongo ao seu alojamento normal e colete um mínimo de 50 microlitros da amostra de urina basal de cada gaiola, repetindo a coleta de urina de uma vez por semana a uma vez por mês. No ponto final experimental, colha os rins do abdômen de cada animal e lave os órgãos em PBS gelado. Para examinar os glomérulos corticais, remova e corte um pólo do córtex renal em pedaços de um milímetro cúbico.

Para examinar os glomérulos justamedulares profundos, remova e corte uma pequena seção da medula em pedaços de um milímetro cúbico. Em seguida, coloque os fragmentos de cada seção de tecido em frascos individuais de microscopia eletrônica contendo cinco mililitros de solução de glutaraldeído a 2,5% e armazene as amostras a quatro graus Celsius. Para histologia dos glomérulos corticais e justamedulares, remova e fixe o terço superior do rim em cinco mililitros de paraformaldeído a 4% a quatro graus Celsius por 24 horas.

Em seguida, transfira o tecido fixado para cinco mililitros de etanol a 70% por 24 horas antes de incorporar em parafina. Para análise imunoquímica dos glomérulos corticais e medulares, coloque um terço do rim em um molde de tecido e mergulhe o tecido em um composto de temperatura de corte ideal. Em seguida, coloque o molde em gelo seco até que o composto esteja congelado e armazene as amostras a 80 graus Celsius até que sejam seccionadas.

Para análise de proteínas, coloque pedaços de três por dois milímetros cúbicos de córtex renal em tubos de plástico de 0,5 mililitro e congele as amostras em nitrogênio líquido para armazenamento a 80 graus Celsius. Para armazenamento de tecido de longo prazo para análise de RNA, após o congelamento instantâneo de três por dois pedaços de rim de milímetros cúbicos, como acabamos de demonstrar, adicione cinco volumes de solução de estabilização de RNase para armazenamento de 80 graus Celsius. Para isolamento de glomérulos, corte o tecido renal restante e coloque os pedaços de tecido em cinco mililitros de solução de ringer de mamíferos suplementada com albumina de soro bovino a 1%, ou BSA, no gelo para peneiramento imediato.

Para isolar os glomérulos, empilhe peneiras com tamanhos de poros de mícrons ascendentes em um béquer de vidro e coloque as fatias de rim na peneira superior de 425 mícrons. Em seguida, use um êmbolo de seringa e uma solução fresca de anéis de mamíferos gelada suplementada com 1% de BSA para esmagar o tecido renal na primeira peneira. À medida que os pedaços de rim são empurrados, remova a peneira superior e continue a empurrar os fragmentos de rim por cada peneira.

Quando restarem apenas as peneiras de 100 e 70 mícrons, transferir a colheita glomerular retida pelas duas últimas peneiras para um tubo cônico de 50 mililitros com 10 mililitros de solução de ringer de mamíferos frescos suplementada com 1% de BSA no gelo. Divida três mililitros da suspensão de glomérulos entre dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e pelete os glomérulos por centrifugação. Depois de remover o sobrenadante, congele os glomérulos em nitrogênio líquido para armazenamento de 80 graus Celsius para posterior extração de proteínas e RNA.

Em seguida, coloque a solução de glomérulos restante em um banho-maria a 37 graus Celsius para injeção em um equipamento de permeabilidade à água glomerular em um microscópio de luz stage. Após a captura de um glomérulo individual intacto, libere uma cápsula de Bowman e fragmentos tubulares por micropipeta, comece a registrar e perfunda o glomérulo com solução de Ringer fresca suplementada com 1% de BSA. Após 30 segundos, mude o perfusato para uma solução de ringer concentrada de 8% BSA.

Após 10 segundos de perfusão, mude o perfusato de volta para a solução de ringer a 1% BSA e pare a gravação. Para visualização detalhada das células glomerulares e da matriz residual, seque as amostras fixas do córtex renal embebidas em parafina a 37 graus Celsius por uma hora, seguida de desparafinização com xileno consecutivo e imersões descendentes de etanol. Reidrate as amostras em água destilada por cinco minutos e incube as lâminas em solução ácida periódica em uma câmara de exaustão.

Após cinco minutos, enxágue as lâminas com três lavagens de cinco minutos em 100 mililitros de água destilada, seguidas de uma incubação de 15 minutos no reagente de Schiff. No final da incubação, lave as lâminas em água corrente da torneira por cinco minutos e contra-core com hematoxilina por três segundos antes de enxaguar abundantemente em água corrente por mais 15 minutos. Em seguida, desidrate as lâminas com imersões ascendentes de etanol e duas imersões consecutivas de xileno de três minutos.

Após a secagem ao ar, as lâminas podem ser montadas com meio de montagem à base de xileno para avaliação de sua estrutura glomerular em um microscópio óptico com uma ampliação de 400x. Os camundongos knockout para o fator de crescimento endotelial vascular, ou VEGF-A, desenvolvem albuminúria progressiva em 10 semanas, em comparação com os controles de ninhada do tipo selvagem, enquanto os animais knockout com superexpressão de VEGF165b são protegidos dessa condição. Os camundongos knockout para VEGF-A têm uma permeabilidade glomerular à água significativamente aumentada em comparação com os controles do tipo selvagem, que é parcialmente resgatada pela superexpressão de VEGF-A165b.

A coloração com ácido periódico de Schiff de seções do córtex renal em camundongos knockout para VEGF-A não revela nenhuma anormalidade estrutural glomerular por análise de microscopia de luz. Após a análise por microscopia eletrônica, no entanto, os camundongos knockout demonstraram um aumento da largura da membrana basal glomerular, uma diminuição do número de fenestras endoteliais, uma diminuição da cobertura do espaço de subpodócitos e um aumento da largura média da fenda do podócito, enquanto o número médio de fendas permaneceu inalterado. A superexpressão de VEGF165b nos animais knockout para VEGF-A resgata as alterações na membrana basal glomerular e na largura da fenda.

No entanto, a superexpressão de VEGF165b não afeta o número alterado de fenestras ou a cobertura do espaço de subpodócitos. O RNA extraído dos glomérulos peneirados confirma a expressão de mRNA de VEGF165b humano em camundongos knockout com superexpressão de VEGF165b, correlacionando-se com uma expressão diminuída de VEGFR2 nos camundongos knockout para VEGF-A que é resgatada pela superexpressão de VEGF165b na batida em animais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como concluir uma investigação renal completa para a avaliação de um modelo murino de doença glomerular, incluindo uma avaliação da permeabilidade glomerular à albumina e à água.