Identificação de marcadores de virulência de Mycobacterium abscessus para replicação intracelular em fagócitos

A triagem de bibliotecas mutantes e estudos transcriômicos de patógenos intracelulares podem ajudar a responder a perguntas-chave sobre adaptações genômicas e regulatórias de patógenos de interesse que são usados para sobreviver dentro do hospedeiro. As principais vantagens dessas técnicas são que são técnicas de investigação em larga escala, e que fornecem uma visão objetiva da adaptação à vida intracelular. As implicações dessas técnicas se estendem para a terapia do abscesso mycobacterium que se associa a esta doença, dando uma visão sobre potenciais alvos para a terapia vacinal.

Comece por cultivar ameba Acanthamoeba castellani, ou Ac, em 30 mililitros de levedura peptone meio de glicose em 75 centímetros quadrados cultura tecidual frascos à temperatura ambiente. Após uma hora use uma pipeta de 25 mililitros para remover o supernascedor, e lave as células três vezes com 10 mililitros de tampão Ac sem carbono ou nitrogênio por lavagem. Após a última lavagem, retire a ameba do fundo do frasco com um único aperto vigoroso, e ajuste as células em um tubo Falcão, para cinco vezes 10 a cinco amebas por mil de concentração em tampão Ac fresco.

Semente cinco vezes 10 para as quatro amebas por poço em uma placa de 96 poços. Coloque a placa a 32 graus celsius por uma hora sem tremer, para permitir que as amebas flutuantes tropho-zoites aderam aos poços. Enquanto isso, aqueça as bactérias no gelo, e adicione cinco microliters das bactérias descongeladas a cada poço no final da incubação.

Depois de 1,5 horas a 32 graus celsius, descarte o supernante invertendo a placa em uma pilha de gaze estéril em uma bandeja de metal esterilizada sob um capô de fumaça. Lave cada poço três vezes com 200 microliters de médio Ac fresco por poço. Após a última lavagem, incubar a co-cultura com 20 microliters de meio fresco suplementado com amikacina por poço, para eliminar qualquer micobactéria extracelular restante por duas horas.

Seguido por três lavagens em médio ac fresco, como apenas demonstrado. Em seguida, adicione 200 microliters de médio, complementados com amikacina fresca a cada poço, seguido pela adição de cinco vezes 10 às sete bactérias Escherichia coli inativadas. Após 48 horas, lise as células com 10 microlitres de 10% de sulfato de dodecyl de sódio por poço, por 30 minutos a 32 graus celsius, e espalhe cinco microlitadores do lysate em placas de Columbia Agar contendo 5% de sangue de ovelha.

Diluir ainda mais os lises adicionando 25 microliters de água estéril em cada gota. Quando todos os lises tiverem sido banhados, sele as placas com filme plástico de parafina, e incuba as culturas por três a quatro dias a 37 graus celsius. Quando as colônias aparecem nas placas, fotografam as culturas e identificam os mutantes prejudicados pelo crescimento intracelular pelos depósitos com o menor número de colônias bacterianas.

Para extração de RNA de micobactérias intracelulares, primeiro cresça M.abscesso em 7H9 médio suplementado com glicerol e glicose até a fase exponencial média em tubos de 50 mililitros a 120 RPM. No final da cultura, lave as bactérias duas vezes com 10 mililitros de tampão ac por lavagem, e meça o O.D.600 para estimar a concentração de bactérias. Em seguida, adicione 8,5 vezes 10 às oito micobabas a 8,5 vezes 10 às seis amebas em 10 mililitros de médio ac fresco para uma incubação de uma hora a 30 graus celsius e 80 RPM.

No final da incubação, colhe as células por centrifugação, e lava a pelota três vezes em 10 mililitros de tampão Ac fresco por lavagem sob as mesmas condições de centrífuga. Em seguida, suspenda novamente as células em 10 mililitros de tampão ac fresco suplementado com amikacina para eliminar qualquer bactéria extracelular, e incubar as células por quatro horas a 30 graus celsius e 80 RPM, seguido por duas lavagens em tampão Ac fresco. Após a última lavagem, suspenda a ameba infectada em quatro mililitros de solução fria três, complementadas com 280 microliters de beta mercaptoetanol para interromper a ameba no gelo por 10 minutos.

No final da incubação, centrifugar o lisecelular para pelotar as bactérias intracelulares liberadas, e suspender a pelota bacteriana em um mililitro de solução fria três. É importante remover todo o supernatante para evitar contaminação com ameba RNA ou proteases que possam ter feito as amostras. Colher as bactérias liberadas com uma segunda centrifugação, e suspender a pelota em um mililitro de tampão de extração.

Em seguida, incubar por 24 horas a 80 graus celsius negativos. Transfira a solução micobacteriana em dois tubos de parafuso mililitro contendo contas de zircônio até a marca de gradação de 500 microliter, e armazene os tubos por mais 24 horas a 80 graus celsius negativos para facilitar a ativação do RNA syn e a dissolução celular. No dia da análise, descongele as amostras no gelo elise as células com duas rodadas de homogeneização a 6000 RPM por 25 segundos, seguida de uma homogeneização redonda a 6000 RPM por 20 segundos.

Entre cada rodada de homogeneização, esfrie as amostras no gelo por um minuto para evitar a degradação do RNA. Após a terceira rodada de homogeneização, esfrie as amostras no gelo por 20 minutos e adicione 200 microliters de clorofórmio diluídos em álcool isoamílico a cada tubo. Vórtice por um minuto, depois centrifugar as amostras, e adicionar 0,8 mililitros de isopropanol frio à fase aquosa para uma incubação de duas a três horas a 20 graus celsius negativos.

Ao final da incubação, centrifugar as amostras novamente, e lavar as pelotas em 500 microliters de frio 70% de etanol sem misturar. Em seguida, remova imediatamente o etanol por centrifugação. Aspire o supernatante para secar as pelotas em um concentrador centrífugo, e suspenda as pelotas em 100 microliters de água livre de DNA/RNA.

A extração de MRNA micobacteriana, como demonstrado, permite a avaliação de famílias genéticas induzidas e reprimidas, agrupando os genes de acordo com seus papéis na resposta a um ambiente limitado em sua fonte de nutrientes e minerais, ou a um ambiente hipóxico ou ácido. Na resistência ao estresse oxidativo e nitrosativo, ou na expressão de fatores de virulência em resposta à ameba ambiental. Ao tentar esses procedimentos, é importante lembrar de realizar a cultura e o isolamento do RNA das amostras controladas e infectadas ao mesmo tempo para evitar efeitos em lote.

Após este procedimento, outros métodos como sequenciamento duplo de RNA podem ser pré-formados para responder a perguntas adicionais sobre interações de patógenos host. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da microbiologia em direção à virulência da micoba no modelo hospedeiro da ameba. Não se esqueça que trabalhar com ameba pode ser extremamente perigoso, pois a ameba pode se transformar em cistos se você não seguir os passos descritos no procedimento.