Quantificar a colonização de Vibrio cholerae e diarreia no adulto modelo de Zebrafish

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do vibrio cholerae, como a forma como o vibrio cholerae coloniza na Costa Tranquila e compete com a microbiota intestinal para estabelecer um nicho. A principal vantagem desta técnica é que os peixes são um hospedeiro natural do vibrio cholerae, portanto, podemos estudar o ciclo de vida completo do vibrio cholerae. Demonstrando o procedimento estarão Dhrubajyoti Nag, um pós-doutorado do meu laboratório e Paul Breen, um estudante de doutorado do meu laboratório.

Depois de preparar as culturas de V. cholerae, inocular o peixe-zebra por imersão. Primeiro, coloque quatro ou cinco peixes-zebra em um copo de 400 mililitros contendo 200 mililitros de água estéril para infecção. Em seguida, adicione um mililitro de cultura de V.cholerae para a concentração de infecção desejada.

Em seguida, cubra o copo com uma tampa perfurada. Depois de preparar todos os copos, transfira-os para uma incubadora frontal de vidro ajustada a 28 graus Celsius Para uma exposição transitória, após cerca de seis horas, despeje a água do béquer através de uma rede de pesca para coletar os peixes. A água infectada deve ser descartada em água sanitária para matar as bactérias.

Em seguida, coloque o peixe em 200 mililitros de água estéril para infecção por cinco minutos. Após cinco minutos, passe essa água por uma rede de pesca, descartando a água em água sanitária. Agora, o peixe pode entrar em um novo béquer limpo com 200 mililitros de água estéril para infecção.

Quando o experimento atingir o ponto final desejado, pegue uma amostra de 15 mililitros da água de infecção para fins de diagnóstico. Em seguida, colete os peixes e descarte a água infectada adequadamente. Oriente o lado ventral para cima e prenda o corpo com um alfinete na mandíbula inferior e outro alfinete logo posterior ao ânus.

Incline os dois pinos para longe do corpo. Em seguida, limpe a superfície ventral do peixe com etanol a 70%. Em seguida, esterilize um bisturi e uma tesoura Vannas usando etanol 70% e uma chama.

Agora, usando o bisturi, faça uma pequena incisão longitudinal na barriga que penetre nas escamas, mas corte apenas a profundidade da pele. Em seguida, com a tesoura, estenda a incisão cuidadosamente ao longo do comprimento do corpo, cortando não mais profundamente do que o nível da pele. Evite cortar o ânus.

Em seguida, faça dois cortes laterais em direção à cabeça para expandir a abertura. Em seguida, prenda a pele de cada lado das incisões laterais na superfície de dissecação, inclinando os pinos para fora, para longe do corpo. O trato intestinal agora deve ser visível como um tubo muito fino e pálido.

Agora, use dois pares de pinças esterilizadas por chama para remover cuidadosamente todo o trato intestinal, que pode ser bastante frágil. Transfira o tecido para um tubo de hominização contendo contas de vidro e um mililitro de tampão frio. Em seguida, homogeneizar os tecidos conforme descrito no protocolo de texto e quantificar os níveis de colonização intestinal.

Em seguida, faça diluições em série do homogeneizado intestinal e tampão. Para cada peixe, prepare cinco ou seis diluições de dez vezes em volumes de um mililitro. Vortex os tubos para misturar.

Em seguida, coloque 100 a 200 microlitros de cada diluição em placas de ágar LB contendo estreptomicina e X-gal. Incube as placas a 30 graus Celsius por 16 a 18 horas. Após a incubação durante a noite, conte as colônias de V. cholerae nas placas.

Essas bactérias normalmente produzem colônias azuis pálidas em meio LB com X-gal. Se várias morfologias de colônias forem observadas, coloque algumas colônias de cada morfologia diferente em uma placa TCBS diferente. Em TCBS, V. cholerae produz colônias amarelas grandes e ligeiramente achatadas com centros opacos e periferias translúcidas.

Para determinar os níveis de mucina na diarreia de peixes, faça um ensaio em uma placa de 96 poços. Em triplicata, carregue 100 microlitros de água de infecção para cada condição de teste, incluindo um espaço em branco, nos poços. Em seguida, misture 50 microlitros de solução fresca de ácido periódico a 0,1% em cada poço de teste.

Use pipetagem para misturar. Em seguida, embrulhe a placa firmemente em plástico e incube a placa a 37 graus Celsius por uma a uma hora e meia. Após a incubação, resfrie a placa até a temperatura ambiente.

Em cada poço, adicione 100 microlitros de solução de fucsina e misture com pipetagem. Agora, embrulhe novamente o prato e coloque-o em uma cadeira de balanço em temperatura ambiente. Em cerca de 20 minutos, leia a placa a 560 nanômetros usando um leitor de placas.

Quantificar a reação causada pela mucina em solução. Para medir os níveis de proteína na diarreia de peixes, use o ensaio de Bradford. Misture 66 microlitros de um dos padrões BSA ou 66 microlitros de água de infecção com 1.000 microlitros de reagente de ensaio Bradford em uma cubeta descartável.

Agora, incube as amostras em temperatura ambiente por dois minutos. E então leia a absorbância a 660 nanômetros em um espectrofotômetro. Uma métrica simples para a quantidade de diarreia é a turbidez na água medida em 600 nanômetros.

Misture bem a água, adicione um mililitro a uma cubeta descartável e faça uma medição. Para uma medição em branco da linha de base, use uma água limpa para infecção. A bactéria V.cholerae excretada também pode ser medida.

Isso pode ser feito com peixes que foram movidos para água limpa após serem inoculados. Fazer diluições em série de um aliquat de água do tanque conforme descrito anteriormente. Em seguida, coloque as diluições em meios seletivos e incube as placas a 30 graus Celsius por 24 horas.

Posteriormente, conte as colônias conforme descrito anteriormente e, em seguida, determine a UFC. Grupos de peixes-zebra alojados em 200 mililitros de água foram inoculados com cinco milhões de UFC de uma cólera pandêmica. Após seis horas na água infestada de bactérias, os peixes passam para água limpa por 18 horas.

Os intestinos aéreos foram então colhidos. Cada peixe abrigava cerca de 100.000 a 1.000.000 células de V. cholerae. A água de infecção foi utilizada para outros ensaios.

Os níveis de mucina foram maiores quando as doses infecciosas foram maiores. O OD600 da água foi significativamente maior quando os peixes foram infectados com V. cholerae. Finalmente, o nível de proteína total na água dos peixes infectados foi quase o dobro do observado na água dos peixes não infectados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como infectar o peixe-zebra adulto com vibrio cholerae e quantificar a diarreia induzida pela infecção. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de transmissão, podem ser realizados para avaliar a infecção de peixes virgens por peixes previamente infectados.