Protocolos para testar a toxicidade de romance químicas inseticidas para mosquitos
February 13th, 2019
Os protocolos são descritos para avaliar a toxicidade de produtos químicos para mosquitos imaturos e adultos para o desenvolvimento como novas classes de larvicidas, adulticides e Endectocidas. Os protocolos permitem o elevado-throughput teste de químicas múltiplas na dose de ponto único e posterior avaliação através do ensaio de resposta de dose para determinar a toxicidade em contato ou ingestão.
Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos de descoberta de inseticidas e controle de vetores. Como, quão tóxica é uma química não formulada para uma população de larvas de mosquitos ou adultos? A química tem potencial para o desenvolvimento como larvicida ou adultídio?
E qual pode ser a rota de entrega mais eficaz? As principais vantagens desta técnica são que ela pode ser usada para avaliar a toxicidade de químicas não formuladas A toxicidade de uma química contra múltiplas espécies de mosquitos vetoriais, podendo ser dimensionada para evitar centenas de compostos em alta capacidade de rendimento. Demonstrando o procedimento estará Jasleen Kaur, um técnico científico do meu laboratório.
Para começar, rotule os poços de uma placa de cultura de tecido de 24 poços. Use um equilíbrio analítico para pesar o composto de teste. Em seguida, dessole o composto em água dupla destilada estéril em um tubo de 1,5mL, resultando em uma solução de estoque de 80mM.
Em seguida, diluir em série a solução de estoque usando água dupla destilada para preparar soluções de estoque de trabalho das concentrações desejadas. Note que devem ser tomados cuidados as larvas são adicionadas aos poços, durante a remoção do excesso de água, e quando a química do teste é adicionada para evitar danos físicos às larvas. A lesão pode aumentar a mortalidade e, assim, produzir resultados falsos positivos ou invalidar o ensaio.
Use uma pipeta de transferência de plástico larga para transferir cinco terços das larvas instar para cada poço da placa. Em seguida, use uma pipeta de um mL para remover suavemente a água e substitua-a pelo volume desejado de água dupla destilada. Tome cuidado para não tocar nas larvas ao remover a água trabalhar rapidamente para garantir que as larvas não desscasquem, e adicione suavemente a química do teste, pipetando contra o lado oposto do poço plástico.
Adicione um volume apropriado de solução de teste a cada poço e gire suavemente a placa para garantir a mistura uniforme. Coloque a placa em uma câmara de crescimento mantendo o ciclo claro/escuro de 12 horas a 25 graus celsius com 75 a 85% de umidade relativa. Para verificar o movimento larval, bata suavemente na placa.
Se não for observado nenhum movimento, toque suavemente na larva com um palito estéril. Marque a larva como morta se nenhuma resposta for notada, e use uma folha de pontuação para registrar o número total de larvas mortas em cada poço, nos pontos de tempo descritos no protocolo de texto. Cultura de três a cinco dias de mosquitos adultos em uma gaiola de plástico de 20 litros.
Rotule nove copos de papel de nove onças com o nome e concentração do composto de teste. Em seguida, prepare uma solução de estoque de 10mg/mL do composto de teste em acetona em um frasco de vidro de 20mL. Em seguida, diluir em série a solução de estoque para obter as concentrações de trabalho desejadas.
Limpe a seringa de vidro de um mL com acetona. Em seguida, preencha-o com a solução de teste na concentração apropriada. Fixar a seringa em um microaplicador ajustado para entregar um volume de 0,25uL.
Em seguida, use um aspirador para remover mosquitos adultos de 10, 3 a 5 dias de idade da gaiola. Anestesia-os por cinco minutos a quatro graus celsius. Em seguida, transfira os mosquitos para uma placa de petri.
Coloque o prato no gelo por 10 minutos. Para evitar danificar o mosquito adulto, o que poderia contribuir para a mortalidade, garantir que eles não sejam anestesiados na geladeira por mais de cinco minutos, ou imobilizados no gelo por mais de 10, e minimizar o manuseio dos mosquitos. Se você tiver acesso a uma placa fria, e um micromanipulador com um estágio móvel, isso pode minimizar ainda mais o manuseio dos mosquitos.
Use pinças finas para remover cada mosquito do prato. Com o micro-aplicador da seringa aplicar 0,25uL de solução de teste para o tórax dorsal, sob um microscópio de dissecação Em seguida, transfira os mosquitos para um copo de papel rotulado no gelo. Sele o copo com um quadrado de malha de 10 por 10cm e um elástico, transfira-o para a câmara de crescimento, e registe o número de mosquitos mortos como descrito anteriormente.
Colete aproximadamente 150 mosquitos adultos de quatro a cinco dias com um aspirador e transfira-os para uma gaiola separada. Remova a fonte de açúcar de um a 24 horas antes do ensaio de alimentação. Prepare uma solução de estoque de 80mM do composto de teste na água.
Em seguida, dilui-o em série com água, para obter soluções de estoque de trabalho das concentrações desejadas. Para obter as concentrações de teste desejadas, adicione 40uL de cada diluição a 960uL de sangue de coelho desfibriado em um tubo de 1,5mL, e misture por pipetação. Coloque um filtro de membro em uma unidade de alimentação e sele-o com um anel de borracha.
Em seguida, use uma pipeta para transferir um mL do sangue com solução de teste através da porta de entrega, localizada no lado inverso da unidade de alimentação. Conecte a unidade de alimentação a uma unidade de aquecimento. Em seguida, cotonete a superfície da membrana suavemente com solução de ácido láctico recém-preparada.
Coloque a unidade de alimentação na gaiola. Cubra a gaiola com um pano escuro, e deixe os mosquitos se alimentarem por uma hora. Após a alimentação dos mosquitos, coloque a gaiola em uma geladeira a quatro graus celsius por cinco minutos para anestesiar os mosquitos.
Então, conte e regise o número total de mosquitos na gaiola. Examinando o abdômen, conte e regise o número total de mosquitos fêmeas totalmente e parcialmente alimentados. Um mínimo de 50 mosquitos alimentados com sangue deve ser obtido por dose.
Remova os mosquitos que não se alimentaram. Em seguida, transfira a gaiola para uma câmara de crescimento, e use uma folha de pontuação para registrar o número de mosquitos mortos nos pontos de tempo apropriados. No terceiro dia de alimentação pós-sangue, coloque uma xícara de ovo na gaiola por 72 horas.
Use um microscópio de dissecação para contar o número total de ovos produzidos por tratamento. Foi realizado um ensaio de contato larval para avaliar o efeito da amitriptilina, antagonista do receptor de dopamina, sobre a mortalidade larval ao longo do tempo. Os dados revelaram que o valor da LC 50 diminui ao longo do tempo do experimento.
O efeito da amitriptilina na mortalidade de mosquitos fêmeas adultas foi comparado com a bifenthrina, e dois controles negativos. Em comparação com os controles negativos tratados com acetona e não tratados, tanto amitriptilina quanto a bifenthrina induziram mortalidade significativa em cada ponto de tempo experimental. Foi realizado um ensaio quantitativo de alimentação para avaliar o efeito de três doses diferentes de amitriptilina na fecundidade e porcentagem de mortalidade de mosquitos fêmeas adultas.
Os dados não revelaram diferença estatisticamente significativa na fecundidade dos mosquitos alimentados com amitriptilina em dose mais alta em comparação com apenas controles alimentados com sangue. Uma vez dominado, qualquer um dos ensaios que descrevemos aqui, pode ser concluído em aproximadamente duas horas por um único indivíduo, se devidamente realizado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear suavemente o organismo, e deve haver consistência durante aplicações tópicas e durante a pontuação de larvas ou ensaio adulto.
Após esse procedimento, outros métodos como bioensídeos para avaliar a toxicidade via absorção, através do mosquito tarsi, do ensaio de garrafas CDC e do ensaio do tubo da OMS podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais sobre a eficácia da química não formulada, ou um produto formulado, e potencial de desenvolvimento como inseticida de contato ou spray espacial.
Visão Geral
Este artigo apresenta protocolos para avaliar a toxicidade de várias substâncias químicas em mosquitos imaturos e adultos, visando o desenvolvimento de novos larvicidas e adulticidas. Os métodos permitem testes de alto rendimento e avaliações de dose-resposta para determinar a toxicidade por contato ou ingestão.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Descoberta de inseticidas
- Controle de vetores
- Toxicologia
Fundamentação
- Compreender a toxicidade de substâncias químicas não formuladas é crucial para o controle de mosquitos.
- Testes de alto rendimento podem avaliar múltiplos compostos de forma eficiente.
- Os protocolos são projetados para minimizar danos físicos aos sujeitos de teste.
- Diferentes rotas de administração para testar as substâncias químicas são exploradas.
Propósito do Estudo
- Avaliar a toxicidade de várias substâncias químicas em populações de mosquitos.
- Identificar potenciais larvicidas e adulticidas.
- Determinar os métodos de administração mais eficazes para essas substâncias químicas.
Métodos Utilizados
- Preparação de soluções-mãe e diluições seriais dos compostos de teste.
- Uso de placas de cultura de tecido em 24 poços para ensaios com larvas.
- Aplicação de soluções de teste em mosquitos adultos usando microaplicadores.
- Ensaios de alimentação com sangue de coelho defibrilado misturado com as soluções de teste.
Principais Resultados
- Os protocolos demonstraram avaliação eficaz da mortalidade de larvas e mosquitos adultos.
- Os dados indicaram níveis de toxicidade variáveis dos compostos testados ao longo do tempo.
- A comparação entre a amitriptilina e a bifentrina mostrou diferenças significativas nas taxas de mortalidade.
- A capacidade de alto rendimento permitiu a avaliação de numerosos compostos.
Conclusões
- Os protocolos desenvolvidos são valiosos para a pesquisa de descoberta de inseticidas e controle de vetores.
- Os resultados podem orientar o desenvolvimento de novas estratégias de controle de mosquitos.
- Estudos adicionais são necessários para explorar os efeitos a longo prazo dessas substâncias químicas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables early-stage evaluation of novel insecticidal chemistries against key mosquito vectors, supporting target validation and lead identification in vector control programs. By providing standardized, high-throughput assays for larval and adult toxicity via contact and ingestion routes, it facilitates mechanistic de-risking and predictive confidence in compound prioritization. The approach aids in triaging compounds for further development as larvicides or adulticides, reducing late-stage attrition in pesticide discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of toxicological hypotheses and pathway clarification for novel chemistries against mosquito vectors.
- Operational Value: Supports functional target validation through dose-response mortality assays in Aedes aegypti, Anopheles gambiae, and Culex quinquefasciatus.
- Strategic Value: Provides predictive confidence for portfolio triage by identifying compounds with larvicidal or adulticidal potential early in discovery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible toxicity endpoints.
- Operational Value: Enables assay standardization and scalability, allowing evaluation of hundreds of compounds in high-throughput format.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse for iterative compound testing across delivery routes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system testing using primary vector species of Zika, dengue, yellow fever, and malaria.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via consistent mortality and fecundity readouts.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying toxicity and sublethal effects such as fecundity reduction.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early hit evaluation to lead optimization, particularly for vector control programs seeking novel modes of action.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by quantifying toxicity across species and exposure routes.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs (LC50, mortality rates) for reliable compound evaluation in 24-well and feeding assay formats.
- Analytics: Generates dose-response data and time-course mortality profiles that enable cross-compound comparison and structure-activity relationship initiation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through standardized adult feeding assays and fecundity assessments in disease-relevant mosquito models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for iterative testing of unformulated chemistries across multiple projects and vector species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in toxicity profiling.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across larval contact, adult topical, and blood-feeding assays.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in insecticide development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on species-specific toxicity and delivery route efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito rearing, handling, and assay techniques to avoid artifacts from physical damage.
- Needs analytical balances, micro-applicators, growth chambers with controlled temperature/humidity, and dosing equipment for precise compound delivery.
- Demands cross-team standardization in larval staging, adult age synchronization, and scoring criteria to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending protocols to alternative mosquito species or environmental conditions.
- Includes practical limitations such as solvent compatibility (e.g., acetone for topical applications) and the need to minimize organism stress during handling.
