Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

A principal vantagem desta tecnologia é que ela permite imagens rápidas do coração do rato. E pode ser usado para observar a presença de canais de ar após a terapia genética. Embora este método possa fornecer insights sobre a cardiologia do desenvolvimento, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como neurologia e pneumologia.

Geralmente, os indivíduos vão lutar com essa técnica porque montar uma imagem do coração do rato adulto pode ser difícil, e é diferente de outras técnicas tradicionais, como a microscopia confocal e invertida. Coloque um laser de onda contínuo com três comprimentos de onda de 405 nanômetros, 473 nanômetros e 532 nanômetros. Em seguida, afixe o espelho um e alinhe-o com o plano espelho a 45 graus ao feixe.

Isso direcionará o laser para o divisor de raios, que forma a configuração de iluminação de dois lados. Em seguida, passe o feixe através de um filtro de densidade neutra de 50 milímetros de diâmetro, um expansão de feixe, e um furo de pino de 25 milímetros de diâmetro, todos posicionados 150 milímetros um do outro. Passe o feixe através de um divisor de vigas de 50-50, colocado a 150 milímetros do orifício.

Em seguida, coloque o espelho de dois 150 milímetros do divisor de feixe, a 90 graus até o feixe dianteiro, e alinhe-o de modo que seu plano espelho esteja em um ângulo de 45 graus para o feixe. Em seguida, coloque o espelho três 100 milímetros do espelho dois, e alinhe-o de modo que seu plano espelho esteja em um ângulo de 45 graus para o feixe refletido a partir do espelho dois. Use este feixe refletido para formar um lado da folha de luz de iluminação dupla.

No lado distante do divisor de raios, coloque o espelho cinco para que seu plano espelho esteja a 45 graus do feixe que é emitido em uma direção para a frente. Use o feixe emitido a partir do espelho cinco para formar o segundo lado da folha de luz de iluminação dupla. Em seguida, configure o sistema de iluminação de dois lados de forma sistêmica.

Coloque a lente cilíndrica a duas 150 milímetros de distância do espelho três, e outra lente cilíndrica idêntica a 150 milímetros de distância do espelho cinco, do outro lado da configuração de iluminação dupla. Em seguida, coloque dois espelhos, cada um em linha com as lentes cilíndricas, a distâncias de 50 milímetros para refletir o feixe a 90 graus. Em ambos os lados da folha de luz, forme um duplo acrático de um par de lentes, com a primeira lente sendo colocada a 100 milímetros do espelho anterior, e tendo um diâmetro de uma polegada e uma distância focal de 100 milímetros.

A segunda lente deve ser colocada a 160 milímetros da lente um, com diâmetro de uma polegada, e uma distância focal de 60 milímetros. Em seguida, coloque os objetivos de iluminação um e dois 150 milímetros dos duplos acromáticos anteriores, de modo que estejam alinhados com a viga. O feixe emitido a partir dos objetivos forma a folha de luz para a imagem das amostras.

Primeiro, prepare a amostra de contas fluorescentes diluindo uma solução de contas de 0,53 micrômetros, de um a 150.000, em uma solução de correspondência de índice refrativo pré-aquecido, com uma porcentagem de baixa agarose apontando derretimento. Em seguida, use um pedaço de tubo de vidro borossilicato com um diâmetro interno de 12 milímetros, e um diâmetro externo de 18 milímetros, a um comprimento de 30 milímetros. Pipeta a solução de agarose de contas na tubulação de borossilicato e permite que a agarose solidifique à temperatura ambiente.

Agora, encha uma câmara ABS impressa em 3D com uma solução de gylcerol de 99,5%. Coloque a tubulação de vidro borossilicato, contendo as contas, dentro da câmara. Conecte um estágio translacional motorizado 3D à tubulação de vidro borossilicato para controlar o movimento e a orientação da amostra dentro da câmara ABS.

Em seguida, use software personalizado projetado para adquirir imagens usando a câmera sCMOS, a uma taxa de 30 quadros por segundo. Usando o controlador do motor, mova a amostra um milímetro na direção lateral e adquira imagens em cada incremento de um milímetro, até que toda a amostra tenha sido imageda. Empilhe as imagens adquiridas usando um software de visualização e meça a função de propagação de pontos do sistema usando essas imagens de contas.

Use uma solução de correspondência de índice refrativo, com um pH de 7,5, e dissolva uma por cento da solução correspondente. Coloque uma amostra de coração de rato adulto limpa na solução de correspondência de índices de refração, com uma por cento de agarose dissolvida. Em seguida, insira a amostra em tubos de vidro borossilicato, e permita que a agarose solidifique à temperatura ambiente.

Conecte um estágio translacional motorizado em 3D à tubulação de vidro borossilicato para controlar o movimento e a orientação da amostra dentro de uma câmara ABS impressa em 3D. Posicione a amostra de modo que ela esteja no centro do feixe gaussiano, criado pelo sistema de iluminação dupla. Em seguida, defina a taxa de aquisição da câmera sCMOS para 30 quadros por segundo.

Agora, usando o controlador do motor, mova a amostra um milímetro na direção axial e adquira imagens a cada incremento de um milímetro. Continue até que toda a amostra tenha sido imagen. Empilhe as imagens adquiridas usando um software de visualização.

Desenvolva as imagens 3D usando essas pilhas de imagens. Para isso, desconvolve a função de spread de ponto determinada anteriormente e utilize-a para as pilhas de imagens adquiridas. Finalmente, defina um valor de intensidade limiar de pixel para observar os contornos do coração e adicionar pseudo-cor às imagens, com base nesta intensidade em escala cinza.

No primeiro dia pós-natal, pode-se visualizar as válvulas, átrio, ventrículo, músculo pectinado e trabeculação, entre outras características. No sétimo dia pós-natal, as características são ainda mais definidas. O átrio, ventrículo, dimensões da cavidade ventricular e a espessura da parede do ventrículo são todos evidentes.

Para estudar a diferenciação de cardiomiócitos dentro do coração, os camundongos heterozigos foram rotulados para mostrar cardiomiócitos. As células rotuladas são mostradas aqui, em cada direção de plano. Os três aviões foram fundidos para criar uma renderização 3D do coração.

A região red circulada dentro do inset mostra dois corações de rato translúcidos depois de passar pela técnica de clareza e ser inserido na tubulação de vidro borossilicato. Além de estudar camundongos pós-natal, o sistema de imagem também pode ser usado para estudar o coração do rato adulto. Aqui, os canais ROMK marcados por GFP são mostrados em 7,5 meses.

Estes foram encontrados principalmente na parede ventricular. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um a dois minutos. Ao tentar este procedimento, é importante remover todas as bolhas ao redor da amostra no tubo.

Outros métodos, como a auto-segmentação das pilhas de imagens, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais relacionadas a lesões cardiovasculares e regeneração. Após seu desenvolvimento, essa técnica foi utilizada por pesquisadores para estudar a arquitetura cardíaca em estágios de desenvolvimento pós-natal e adultos em camundongos.