Name: Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda microscopia de fluorescência de luz-folha para estudo cardíaco em camundongos usando iluminação dupla e limpeza óptica. Esta técnica permite imagens rápidas de alta resolução do coração murino adulto e pós-natal.

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Os autores gostaria de expressar gratidão ao Thao Nguyen e Atsushi Nakano da UCLA para o fornecimento da amostra de ratos a imagem. Este estudo foi suportado por estrelas de bolsas NIH HL118650 (para Tzung K. Hsiai), HL083015 (para Tzung K. Hsiai), HD069305 (para N. C. Chi e Tzung K. Hsiai.), HL111437 (para Tzung K. Hsiai e N. C. Chi), HL129727 (para Tzung K. Hsiai) e sistema de Universidade do Texas, financiamento (a Quélen Lee).

Todos os procedimentos que envolvem a utilização de animais foram aprovados por comitês de revisão institucional (IACUC) na Universidade da Califórnia, Los Angeles, Califórnia.
1. configuração do sistema imaging
Nota: Veja a Figura 1 e Figura 2.
<ol><li>Recuperar um onda contínua do laser (CW) com 3 comprimentos de onda: 405 nm, 473 nm e 532 nm. Coloque 2 espelhos (M1 e M2), além de 150 mm e alinhá-los com seus aviões de espelho a 45° para o raio. Nota: Esta etapa é executada para redirecionar o laser longe a instalação de iluminação de duas faces. O feixe resultante será na mesma direção do feixe inicial.</li>
	<li>Passar o feixe por meio de um diâmetro de 25 mm diafragma de íris/pinhole (PH), um filtro de densidade neutra (FDN) 50 mm de diâmetro com uma faixa de densidade óptica de 0 - 4.0, um expansor de feixe (BE), uma fenda de 30 mm (S) com a largura de ~ 0 - 6 mm e um espelho (M3) , todos posicionados 150 milímetros um do outro. Coloque o espelho com seu avião de espelho a 45° para o raio.</li>
	<li>Passe o feixe por meio de um divisor de feixe de 50: 50 colocado 150 mm do M3. Coloque um espelho (M6) 150 mm entre o separador de feixe e alinhá-lo para que seu plano de espelho é de 45° para o raio que é emitido na direção direta. Use o feixe reflectido para formar um lado da folha dupla-iluminação luz.</li>
	<li>Coloque um espelho (M4) 150 mm entre o separador de feixe e alinhá-lo para que seu plano de espelho é de 45° para o raio que foi emitido em um ângulo de 90° entre o separador de feixe. Coloque um segundo espelho (M5) 150 mm da M4 e alinhá-lo para que seu plano de espelho é de 45° para o feixe refletido da M6. Use o feixe emitido do M5 para formar o segundo lado da folha dupla-iluminação luz.</li>
	<li>Configure o sistema de iluminação de dupla face de forma simétrica (ver Figura 1). Coloque uma lente cilíndrica (CL1) [diâmetro (d) = 1; distância focal (f) = 50 mm] 150 mm em consonância com o feixe emitido do M5 de um lado e outro idêntica lente cilíndrica (CL2) 150 mm em consonância com o feixe emitido do M6 do outro lado da setu dual-iluminação p. Coloque 2 espelhos (M7 e M8) cada em consonância com as lentes cilíndricas em distâncias de 50 mm para refletir o feixe a 90 °.</li>
	<li>Forma um dubleto acromático de um par de lentes. Coloque a primeira lente, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm da M7 e a segunda lente, L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm de L1. Repita que isto do outro lado da dupla-iluminação com lentes idênticas (L3, L4) colocados à mesma distância do M8.</li>
	<li>Lugar espelhos, M9 e M10, 60 mm de lentes L2 e L4, respectivamente e em consonância com o feixe. Coloque os objectivos de iluminação, OL1 e OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm da M9 M10 e em consonância com o feixe. O feixe emitido a partir dos objectivos forma a folha de luz para as amostras de imagem.</li>
	<li>Use uma impressora 3D para imprimir o porta-amostras de acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS). Incorporar um pedaço de vidro de tampa [índice de refração (RI) = 1.4745] em cada lado da câmara, perpendicular ao feixe de iluminação, para minimizar o índice de refração descasamento. Uniformemente Coloque a câmara entre os feixes emitidos a partir as lentes objetivas.</li>
	<li>Instalar um microscópio estéreo com um 1 X objetivo de ampliação e uma câmera de semicondutor (sCMOS) científica de óxido metálico complementar perpendicular para a iluminação de avião (ver Figura 2).</li>
</ol>2. calibração do sistema de imagem
<ol><li>Recupere fluorescentes esferas de poliestireno que são 0.53 μm de diâmetro.</li>
	<li>Prepare a amostra de grânulo fluorescente diluindo a solução do grânulo em uma solução de correspondente do índice de refração (aros) com baixo ponto de fusão apontador agarose a 1% de 1:150, 000. Corte um pedaço de tubo de vidro borosilicato com diâmetro interno de 12 mm e um diâmetro exterior de 18 mm para um comprimento de 30 mm. Nota: Os tubos de vidro borosilicato é usado para coincidir com o índice de refração (1,47).</li>
	<li>Misturar a amostra diluída do grânulo com agarose a 1% e pipetar a solução do grânulo/agarose para a tubagem de borosilicato. Permitir que a agarose solidificar à temperatura ambiente (23 ° C).</li>
	<li>Encha a câmara ABS (da etapa 1.7) com uma solução de glicerol de 99,5%. Coloque o tubo de vidro de borosilicato contendo as esferas dentro da câmara. Coloque a câmara de ABS no sistema da imagem latente para que fique no centro do feixe gaussiano criado pelo sistema dual iluminação.</li>
	<li>Anexar um palco de translação 3D motorizado para o tubo de vidro de borosilicato para controlar o movimento e a orientação da amostra dentro da câmara ABS (consulte Supplemental Figura 1).</li>
	<li>Adquira imagens usando a câmera de sCMOS a uma taxa de 30 quadros por segundo (fps). Usando o controlador do motor, mover a amostra 1 mm no sentido lateral e adquirir imagens em cada incremento de 1 mm, usando a câmera de sCMOS. Continue até a amostra inteira tem sido fotografada.</li>
	<li>Empilhe as imagens adquiridas usando um software de visualização (ver Tabela de materiais). Medir a função de ponto de espalhar (PSF) do sistema usando essas imagens do grânulo. Use este PSF para deconvolução durante o processamento em etapas posteriores de imagem.</li>
</ol>3. preparação da amostra
<ol><li>Dissecar o coração de um rato selvagem tipo P1 e de um duplo heterozigotos sarcolipin-Cre knockin rato com o gene Rosa26-YFP (SlnCre / +; R26repórter YFP / +) no P7. Nota: A eutanásia foi realizada utilizando pentobarbital e a técnica descrita por Robbins et al . 10. a dissecação foi realizada segundo a técnica descrita pelo nacional do coração, pulmão e sangue Institute (NHLBI)10,11.</li>
	<li>Executar um produto químico de compensação dos corações murino como descrito por Kevin Sung et al 12. Nota: As seguintes etapas devem ser executadas em uma coifa desde que os produtos químicos sendo utilizados são tóxicos.<ol>
<li>Lave os corações no 1x tampão fosfato salino (PBS) 3 x por 10 min. Após enxaguar, coloque os corações em uma solução de paraformaldeído 4% e incubar as amostras a 4 ° C durante a noite.</li>
		<li>Coloca as amostras em uma solução de 4% do acrilamido contendo 0,5% w/v de 2, 2'-Azobis dicloridrato. Permitir que as amostras incubar a 4 ° C durante a noite. Após a incubação durante a noite, remover as amostras e incube-os a 37 ° C, durante 2-3h.</li>
		<li>Lavar as amostras com PBS e coloque-os em uma solução de 8% w/v de sódio Dodecil sulfato e o ácido bórico 1,25% w/v. Incube as amostras a 37 ° C, até que eles são claros. Isto pode levar várias horas dependendo da espessura da amostra. Após a limpeza, remover as amostras e colocá-los em 1x tampão fosfato salino para 1 dia.</li>
		<li>Preparar um índice de refração correspondente solução com 40 g de médio gradiente de densidade não iónico (ver Tabela de materiais) em 30 mL de tampão de fosfato 0,02 M (PB), 0.1% Tween-20 e 0,01% de azida sódica. Trazer a solução para um pH de 7,5 com hidróxido de sódio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloca a amostra apurada em jantes com um índice de refração de agarose 1.46-1.48 e 1%. Inserir a amostra em tubos de vidro borosilicato e permitir que a agarose solidificar à temperatura ambiente (23 ° C).</li>
	<li>Anexar um palco de translação 3D motorizado para o tubo de vidro de borosilicato para controlar o movimento e orientação da amostra dentro de 3-d impresso câmara ABS (consulte Supplemental Figura 1).</li>
</ol>4. imagem de coração adulto
<ol><li>Injete 8,7 x 1012 vírus do vetor de vírus adeno-associado do tipo 9 (AAV9) contendo um promotor específico cardíaco troponina T (miocardite) e proteína verde fluorescente (GFP) em um volume de 100 μL a veia da cauda de um rato de tipo selvagem de 2 meses (C57BL/6). Nota: O AAV9 foi desenvolvido de acordo com a técnica descrita por Yuan et al . 13. isso faz com que as boas práticas agrícolas ligar para o canal de potássio medular externa renal (ROMK) produzindo AAV9-miocardite-ROMK-GFP (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Disse os corações de rato adulto em 7,5 meses de idade, de acordo com a técnica descrita pelo NHLBI11. Prepare as amostras usando etapas 3.1-3.3.</li>
	<li>Conecte o controlador do motor para o motor do atuador. Anexar o atuador para o tubo de vidro de borosilicato para controlar o movimento e orientação da amostra dentro de 3-d impresso câmara ABS.</li>
	<li>Posicione a amostra para que fique no centro do feixe gaussiano criado pelo sistema dual iluminação. Adquira imagens usando a câmera de sCMOS a uma taxa de 100 fps.</li>
	<li>Usando o controlador do motor, mover a amostra 1 mm no sentido axial e adquirir imagens em cada incremento de 1 mm com a câmera de sCMOS. Continue até a amostra inteira tem sido fotografada. Nota: O sistema é controlado por um software de controle de instrumento desenvolvidos.</li>
	<li>Empilhe as imagens adquiridas usando um software de visualização (ver Tabela de materiais). Desenvolva imagens 3D usando essas pilhas de imagem e o software de visualização14. Deconvolve o PSF da etapa 2.6 com a pilha de imagem adquirida. Defina um valor de intensidade de limiar de pixel para observar os contornos do coração e adicionar cor pseudo para as imagens com base na intensidade desta escala de cinza.</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li>
<li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li>
<li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209(2017).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+excision+of+murine+aorta%3B+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).</li>
<li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://community.parentprojectmd.org/profiles/blogs/standard-operating-procedures-for-duchenne-animal-models">Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models</a>. , (2015).</li>
<li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736(2016).</li>
<li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li>
<li>FEI, <a target="_blank" href="https://www.fei.com/software/amira-user-guide/">Amira User's Guide</a>. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O sistema LSFM e a técnica descrita aqui utiliza um feixe de iluminação dupla face combinado com uma clareira óptica a imagem do coração de rato em pós-natal e adultos fases do seu desenvolvimento. Um feixe de iluminação único tradicional sofre de espalhamento do fóton e absorção através de de1,de amostras de tecido mais grosso e maior3. As duas faces de vigas fornecem uma iluminação mais uniforme da amostra, minimizando assim o efeito de distribuição e outros ar...

Microscopia de fluorescência de luz-folha foi uma técnica desenvolvida pela primeira vez em 1903 e é usada hoje como um método para estudar a expressão gênica e, também, para produzir modelos 3-d ou 4-D, de amostras de tecido a1,2,3. Este método de imagem usa uma folha fina de luz para iluminar um único avião de uma amostra para que só aquele avião é capturado pelo detector. A amostra então pode ser movida na direção axial para capturar cada camada, uma seção de cada vez e processar um modelo 3D após o pós-processamento das imagens adquiridas4. No entanto, devido à absorção e espalhamento de fótons, LSFM tem sido limitada a amostras ou alguns microns de espessura ou são opticamente transparente1.
As limitações do LSFM têm levado a estudos extensivos de organismos que têm tecidos que são opticamente transparentes, como o peixe-zebra. Estudos envolvendo a diferenciação e desenvolvimento cardíaco são frequentemente realizados em zebrafish desde que existem genes conservados entre humanos e zebrafish5,6. Embora estes estudos conduziram a avanços na investigação cardíaca relacionada com cardiomiopatias6,7, ainda há uma necessidade de realizar pesquisas semelhantes em organismos de nível mais alto como mamíferos.
Mamíferos tecido cardíaco apresenta um desafio devido à espessura e opacidade do tecido, a absorção devido à hemoglobina nos glóbulos vermelhos e a distribuição que ocorre devido a iluminação em um lado da amostra sob tradicionais métodos LSFM1 , 8. para compensar estas limitações, propusemo-na usar uma versão simplificada da clareza técnica9 combinado com um índice de refração correspondente solução (aros) e iluminação de duas faces. Portanto, este sistema permite a imagem de uma amostra que é maior que 10 x 10 x 10 mm3 enquanto manter uma boa qualidade resolução axial e lateral aviões8.
Este sistema foi primeiro calibrado usando grânulos fluorescentes dispostos em diferentes configurações dentro do tubo de vidro. Em seguida, o sistema foi usado a imagem corações murino pós-natal e adultas. Primeiro, o coração de rato pós-natal foi fotografado em 7 dias (P7) para revelar a cavidade ventricular, a espessura da parede ventricular, as estruturas de válvula e a presença de trabeculação. Em segundo lugar, foi realizado um estudo para identificar as células que se diferenciam em cardiomyocytes usando um coração de rato pós-natal no dia 1 (P1) com Cre-rotulado cardiomyocytes e proteína fluorescente amarela (YFP). Finalmente, foram imagens de ratos adultos em 7,5 meses para observar a presença de potássio medular externa renal canais (ROMK) após a terapia de gene8.

<table><tbody><tr><td>CW Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LMM-GBV1-PF3-00300-05</td><td>Excitação de fluoróforos Filtro de</td></tr><tr><td>densidade neutra</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td><td>Controla a quantidade de luz que entra no sistema Expansor de</td></tr><tr><td>feixe acromático</td><td>Thorlabs</td><td>GBE05-A</td><td>Expande o feixe de luz Fenda</td></tr><tr><td>mecânica</td><td>Thorlabs</td><td>VA100C</td><td>Controla a largura do feixe</td></tr><tr><td>Divisor</td><td>de feixe Thorlabs</td><td>BS013</td><td>Forma feixe de iluminação dupla</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo com lente objetiva 1X</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>Usado para observação de amostra</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT câmera sCMOS</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>Usado para capturar imagens</td></tr><tr><td>Acrilonitrila butadieno estireno (ABS)</td><td>Stratasys</td><td>uPrint</td><td>Material usado para imprimir em 3-D um suporte de amostra</td></tr><tr><td>Grânulos de poliestireno fluorescente</td><td>Spherotech Inc</td><td>PP-05-10</td><td>Usado para calibração do sistema de imagem</td></tr><tr><td>Tubulação de vidro borosilicato</td><td>Corning</td><td>Pyrex 7740</td><td>Tubulação para incorporação de amostras</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td>Preenchimento para câmara de amostra</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td> Solução de enxágue <td>BP39920</td><td>Fisher Scientific</td><td>para corações de camundongos</td></tr><tr>Ciências de <td>microscopia eletrônica</td> <td>de paraformaldeído</td><td>RT-15700</td><td>Primeira solução de incubação</td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Wako Chemicals</td><td>AAL-107</td><td>Misturado com dicloridrato de 2,2'-Azobis para segunda solução de incubação para corações de camundongos</td></tr><tr><td>2,2'-Cloridrato de Azobis</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td>Misturado com Acrilamida para segunda solução de incubação para corações de camundongos</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71725</td><td>Misturado com ácido bórico para solução de terceira incubação para corações de camundongos</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Fischer Scientific</td><td>A74-1</td><td>Misturado com dodecil sulfato de sódio para solução de terceira incubação para corações de camundongos</td></tr><tr><td>Sigma D2158</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158</td><td>Misturado com PB, Tween-20 e azida de sódio como solução de correspondência de índice de refração</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11332465001</td><td>Misturado com Sigma D2158, PB e azida de sódio como uma solução de correspondência de índice de refração</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>Misturado com Sigma D2158, PB e Tween-20 como uma solução de correspondência de índice de refração</td></tr><tr><td>Vetor de vírus adeno-associado 9 com um promotor de troponina T específico para o coração marcado com GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>VB2045</td><td>Expressa GFP quando ligado ao Atuador de</td></tr><tr><td>Servo Motor DC</td> ROMK <td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>Usado para o movimento da amostra na direção axial dentro da folha de luz</td></tr><tr><td>K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Conecta-se ao atuador do motor e controla o movimento do atuador</td></tr><tr><td>Amira</td><td>FEI Software</td><td>N/A</td><td>Software de visualização para produção de imagens 2-D e 3-D</td></tr></tbody></table>

microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Microscopia de fluorescência de luz-folha tem sido amplamente utilizada para aquisição de imagem rápida com uma alta resolução axial de micrômetro milímetro escala. Técnicas tradicionais de luz-folha envolvem o uso de um feixe único de iluminação direcionado ortogonalmente no tecido da amostra. Imagens de grandes amostras que são produzidas usando um feixe de iluminação único contêm listras ou artefatos e sofrem uma resolução reduzida devido à dispersão e absorção da luz pelo tecido. Este estudo utiliza um feixe de iluminação dupla face e uma clareza simplificada óptica técnica para o coração de murino de compensação. Estas técnicas permitem mais profunda de imagem removendo lipídios do coração e produzem um grande campo de imagem, maior que 10 x 10 x 10 mm3. Como resultado, esta estratégia permite-nos quantificar as dimensões ventriculares, a linhagem cardíaca de rastrear e localizar a distribuição espacial de proteínas específicas do cardíaco e canais iônicos do pós-natal para corações de rato adulto com contraste suficiente e resolução.

A técnica descrita aqui usado um feixe de iluminação dupla face combinado com uma compensação óptica de amostras de tecido de coração de rato para atingir uma profundidade de imagem mais profunda e um maior volume de imagens com resolução de imagem suficiente (Figura 1). Para calibrar o sistema, grânulos fluorescentes foram colocados dentro de tubos de vidro e dentro do sistema da imagem latente. Os grânulos foram então fotografados e visualizados em x-y aviã...

Este estudo utiliza uma técnica de microscopia (LSFM) de fluorescência de luz-folha de iluminação dupla face combinada com compensação óptica para estudar o coração murino.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

A principal vantagem desta tecnologia é que ela permite imagens rápidas do coração do rato. E pode ser usado para observar a presença de canais de ar após a terapia genética. Embora este método possa fornecer insights sobre a cardiologia do desenvolvimento, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como neurologia e pneumologia.Geralmente, os indivíduos vão lutar com essa técnica porque montar uma imagem do coração do rato adulto pode ser difícil, e é diferente de outras técnicas tradicionais, como a microscopia confocal e invertida. Coloque um laser de onda contínuo com três comprimentos de onda de 405 nanômetros, 473 nanômetros e 532 nanômetros. Em seguida, afixe o espelho um e alinhe-o com o plano espelho a 45 graus ao feixe.Isso direcionará o laser para o divisor de raios, que forma a configuração de iluminação de dois lados. Em seguida, passe o feixe através de um filtro de densidade neutra de 50 milímetros de diâmetro, um expansão de feixe, e um furo de pino de 25 milímetros de diâmetro, todos posicionados 150 milímetros um do outro. Passe o feixe através de um divisor de vigas de 50-50, colocado a 150 milímetros do orifício.Em seguida, coloque o espelho de dois 150 milímetros do divisor de feixe, a 90 graus até o feixe dianteiro, e alinhe-o de modo que seu plano espelho esteja em um ângulo de 45 graus para o feixe. Em seguida, coloque o espelho três 100 milímetros do espelho dois, e alinhe-o de modo que seu plano espelho esteja em um ângulo de 45 graus para o feixe refletido a partir do espelho dois. Use este feixe refletido para formar um lado da folha de luz de iluminação dupla.No lado distante do divisor de raios, coloque o espelho cinco para que seu plano espelho esteja a 45 graus do feixe que é emitido em uma direção para a frente. Use o feixe emitido a partir do espelho cinco para formar o segundo lado da folha de luz de iluminação dupla. Em seguida, configure o sistema de iluminação de dois lados de forma sistêmica.Coloque a lente cilíndrica a duas 150 milímetros de distância do espelho três, e outra lente cilíndrica idêntica a 150 milímetros de distância do espelho cinco, do outro lado da configuração de iluminação dupla. Em seguida, coloque dois espelhos, cada um em linha com as lentes cilíndricas, a distâncias de 50 milímetros para refletir o feixe a 90 graus. Em ambos os lados da folha de luz, forme um duplo acrático de um par de lentes, com a primeira lente sendo colocada a 100 milímetros do espelho anterior, e tendo um diâmetro de uma polegada e uma distância focal de 100 milímetros.A segunda lente deve ser colocada a 160 milímetros da lente um, com diâmetro de uma polegada, e uma distância focal de 60 milímetros. Em seguida, coloque os objetivos de iluminação um e dois 150 milímetros dos duplos acromáticos anteriores, de modo que estejam alinhados com a viga. O feixe emitido a partir dos objetivos forma a folha de luz para a imagem das amostras.Primeiro, prepare a amostra de contas fluorescentes diluindo uma solução de contas de 0,53 micrômetros, de um a 150.000, em uma solução de correspondência de índice refrativo pré-aquecido, com uma porcentagem de baixa agarose apontando derretimento. Em seguida, use um pedaço de tubo de vidro borossilicato com um diâmetro interno de 12 milímetros, e um diâmetro externo de 18 milímetros, a um comprimento de 30 milímetros. Pipeta a solução de agarose de contas na tubulação de borossilicato e permite que a agarose solidifique à temperatura ambiente.Agora, encha uma câmara ABS impressa em 3D com uma solução de gylcerol de 99,5%. Coloque a tubulação de vidro borossilicato, contendo as contas, dentro da câmara. Conecte um estágio translacional motorizado 3D à tubulação de vidro borossilicato para controlar o movimento e a orientação da amostra dentro da câmara ABS.Em seguida, use software personalizado projetado para adquirir imagens usando a câmera sCMOS, a uma taxa de 30 quadros por segundo. Usando o controlador do motor, mova a amostra um milímetro na direção lateral e adquira imagens em cada incremento de um milímetro, até que toda a amostra tenha sido imageda. Empilhe as imagens adquiridas usando um software de visualização e meça a função de propagação de pontos do sistema usando essas imagens de contas.Use uma solução de correspondência de índice refrativo, com um pH de 7,5, e dissolva uma por cento da solução correspondente. Coloque uma amostra de coração de rato adulto limpa na solução de correspondência de índices de refração, com uma por cento de agarose dissolvida. Em seguida, insira a amostra em tubos de vidro borossilicato, e permita que a agarose solidifique à temperatura ambiente.Conecte um estágio translacional motorizado em 3D à tubulação de vidro borossilicato para controlar o movimento e a orientação da amostra dentro de uma câmara ABS impressa em 3D. Posicione a amostra de modo que ela esteja no centro do feixe gaussiano, criado pelo sistema de iluminação dupla. Em seguida, defina a taxa de aquisição da câmera sCMOS para 30 quadros por segundo.Agora, usando o controlador do motor, mova a amostra um milímetro na direção axial e adquira imagens a cada incremento de um milímetro. Continue até que toda a amostra tenha sido imagen. Empilhe as imagens adquiridas usando um software de visualização.Desenvolva as imagens 3D usando essas pilhas de imagens. Para isso, desconvolve a função de spread de ponto determinada anteriormente e utilize-a para as pilhas de imagens adquiridas. Finalmente, defina um valor de intensidade limiar de pixel para observar os contornos do coração e adicionar pseudo-cor às imagens, com base nesta intensidade em escala cinza.No primeiro dia pós-natal, pode-se visualizar as válvulas, átrio, ventrículo, músculo pectinado e trabeculação, entre outras características. No sétimo dia pós-natal, as características são ainda mais definidas. O átrio, ventrículo, dimensões da cavidade ventricular e a espessura da parede do ventrículo são todos evidentes.Para estudar a diferenciação de cardiomiócitos dentro do coração, os camundongos heterozigos foram rotulados para mostrar cardiomiócitos. As células rotuladas são mostradas aqui, em cada direção de plano. Os três aviões foram fundidos para criar uma renderização 3D do coração.A região red circulada dentro do inset mostra dois corações de rato translúcidos depois de passar pela técnica de clareza e ser inserido na tubulação de vidro borossilicato. Além de estudar camundongos pós-natal, o sistema de imagem também pode ser usado para estudar o coração do rato adulto. Aqui, os canais ROMK marcados por GFP são mostrados em 7,5 meses.Estes foram encontrados principalmente na parede ventricular. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um a dois minutos. Ao tentar este procedimento, é importante remover todas as bolhas ao redor da amostra no tubo.Outros métodos, como a auto-segmentação das pilhas de imagens, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais relacionadas a lesões cardiovasculares e regeneração. Após seu desenvolvimento, essa técnica foi utilizada por pesquisadores para estudar a arquitetura cardíaca em estágios de desenvolvimento pós-natal e adultos em camundongos.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

No coração, os eventos moleculares coordenar a função contráctil e eléctrica do órgão. Um conjunto de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais aqui apresentadas permite a gravação de variáveis ​​de celular em corações intactos. Identificação de mecanismos que definem a função cardíaca é fundamental na compreensão de como o coração trabalha em situações patológicas.

O campo local microscopia de fluorescência: Geração de sinais de celular em corações intactos

Aqui, descrevemos uma abordagem de microscopia de folha clara para visualizar o infiltrado de leucócitos CD45 + cardíacos em um modelo murino de miocardite fulminante asséptica, que é induzida pelo tratamento de toxina diftônica intratraqueal de ratos CD11c.DTR.

Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar desenvolvendo corações no zebrafish em 4 dimensões (4D). Imagem 4-D, através de microscopia de fluorescência de luz-folha (LSFM), tem 3-Dimensional (3D) de imagens ao longo do tempo, para reconstruir corações em desenvolvimento. Nós mostramos qualitativa e quantitativamente que a tensão de cisalhamento ativa endocárdico entalhe sinalização durante o desenvolvimento da câmara, que promove trabeculação cardíaca.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para capturar imagens 4-Dimensional dos efeitos de modulação de tensão de cisalhamento sobre o coração em desenvolvimento de Zebrafish

Descrevemos ferramentas otimizadas para estudar o coração de zebrafish in vivo com microscopia de fluorescência de folha de luz. Especificamente, sugerimos linhas transgênicas cardíacas brilhantes e apresentamos novas técnicas de incorporação e imobilização suaves que evitam defeitos de desenvolvimento e coração. Um possível pipeline de aquisição e análise de dados adaptado à imagem cardíaca também é fornecido.

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Relatamos um método para reconstrução mesoscópica de todo o coração do rato, combinando novos avanços na transformação e coloração de tecidos com o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz digitalizado axialmente.

Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

Este protocolo demonstra isolamento guiado por microscopia e coloração por imunofluorescência de veias pulmonares murinas. Preparamos amostras de tecido contendo o átrio esquerdo, veias pulmonares e pulmões correspondentes e as coramos para troponina cardíaca T e Conexina 43.

Microdissecção e Coloração por Imunofluorescência de Mangas Miocárdicas em Veias Pulmonares Murinas

O protocolo utiliza microscopia avançada de folha de luz junto com métodos adaptados de limpeza de tecidos para investigar estruturas cardíacas intrincadas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.

Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

A reconstrução tridimensional (3D) do dano cardíaco no infarto agudo do miocárdio reperfundido (repIAM) permite a quantificação fiel e a co-localização dos padrões associados que afetam a doença. Aqui, uma abordagem de imagem guiada por folha de luz automatizável é fornecida para medição contemporânea de danos cardíacos, área de risco e resposta de células imunes.

Análise 3D Simultânea de Dano Cardíaco e Resposta Imune em Infarto Agudo do Miocárdio Reperfundido Usando Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

Um biorreator pressão cíclica capaz de submeter o tecido de válvula cardíaca em condições de pressão fisiológicos e patológicos tem sido projetado. Um programa LabVIEW permite aos usuários controlar a pressão magnitude amplitude e frequência. Este dispositivo pode ser usado para estudar a mechanobiology do tecido cardíaco válvula ou células isoladas.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

Uma metodologia para estimar orientações de fibra de ventriculares em imagens in vivo de geometrias coração do paciente para a modelagem de personalizado é descrito. Validação da metodologia realizada utilizando normal e não corações caninos demonstrar que que não há diferenças significativas entre as orientações de fibra estimadas e adquirida a um nível clinicamente observável.

Paciente específico Modelagem do Coração: Estimativa de Orientações de fibra ventriculares

Aprenda microscopia de fluorescência de luz-folha para estudo cardíaco em camundongos usando iluminação dupla e limpeza óptica. Esta técnica permite imagens rápidas de alta resolução do coração murino adulto e pós-natal.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

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