Name: Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Aprenda a quantificar com precisão a metilação do DNA mitocondrial usando sequenciamento por bisulfito e análise bioinformática. Este método computacional permite investigar alterações epigenéticas em doenças humanas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A Novo Nordisk Fundação Centro de pesquisa metabólica básica é um centro de pesquisa independente da Universidade de Copenhagen, parcialmente financiados por uma doação irrestrita da Novo Nordisk Foundation.

1. tratamento enzima de restrição
<ol><li>Linearizar mtDNA tratando o DNA humano total com a enzima de restrição BamHI, que corta na posição 14258 no DNA mitocondrial humano. Nota: Para mouse DNA, use a enzima de restrição BglII sob condições idênticas como abaixo.</li>
	<li>Para cada amostra onde a metilação do DNA mitocondrial é para ser avaliado, preparar um tubo de reacção de 0,2 mL e adicionar o seguinte mistura: 3 μg DNA genômico (quantificado pelo fluorometry), 15 μL tampão 3, 3 μL BamHI e água acima de 150 μL</li>
	<li>Coloque os tubos em um termociclador por 4 h a 37 ° C.</li>
</ol>2. bissulfito conversão
<ol><li>Converta o DNA BamHI-Tratado usando bissulfito de sódio, conforme descrito em outro lugar,29.</li>
	<li>Use 200-500 ng DNA BamHI-Tratado para cada reação de conversão em um volume total de 20 μL. A recuperação do DNA é 50-70%.</li>
	<li>Eluir o DNA de bissulfito-convertido em tampão de eluição 10 μL.</li>
	<li>Quantificar o ADN single-stranded por fluorometry.</li>
	<li>Opcional: Armazenar DNA bissulfito-convertido a-20 ° C antes de prosseguir para o restante do protocolo. Para armazenamento a longo prazo, armazenar DNA bissulfito-convertido a-80 ° C</li>
</ol>3. projeto de sequenciamento de Primers de bissulfito
<ol><li>Desenho de primers para sequenciamento de bissulfito, usando as ferramentas on-line Methprimer30 e31,de BiSearch32. Nota: Methprimer e BiSearch permitem para procurar sequências de vinculação da primeira demão sobre sequências genomic onde citosinas são convertidas em timinas, similarmente ao pós-bissulfito tratamento.</li>
	<li>Para a amplificação da ideal e imparcial, evite dinucleotídeos CpG em primers e projetar o tamanho do amplicon entre bp 100-300.</li>
	<li>Que sejam projetados primers específicos para o DNA mitocondrial, usando a função do BiSearch Busca de Primer. Inserir as primeiras demão já projetado bissulfito convertido, marque a caixa de bissulfito e incluem um genoma de referência e parâmetros PCR. Nota: Será exibida uma lista de possíveis produtos PCR.</li>
	<li>Copie o top sequências de 1 a 5 da primeira demão e colá-los em um formulário de pedidos para a síntese do oligonucleotide. Nota: Uma lista de humanos e sequências de cartilha de DNA mitocondrial de rato validado no laboratório é exibido na tabela 1.</li>
	<li>Iniciadores de teste usando bissulfito convertido PCR após eletroforese em gel de agarose, conforme descrito na etapa 4. Testar e otimizar todos os pares da primeira demão separadamente e verifique o tamanho correto do amplicon aparece sobre o gel de agarose. Nota: Se multiplexação primários são necessários, adicionar múltiplos primers para uma única reação de PCR e visualizar os produtos PCR na electroforese do gel do agarose ou, um método mais resolutiva como eletroforese em gel de poliacrilamida, para distinguir produtos de semelhante tamanho.</li>
</ol>4. bissulfito convertido do PCR e extração do Gel
<ol><li>Para amplificar as regiões de interesse, realize PCR usando uma começo quente Taq polimerase. Brevemente, mistura 100 ng convertido DNA, 500 cartilhas de sentido e anti-sentido µM, 1 µ l do dNTP mix (10 µ m de cada dNTP) e polimerase em 7,5 U/reação em um volume total de 50 µ l. executar o PCR com as seguintes condições: 5 min a 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 ciclos; 10 min 72 ° C. Também usar primers separadamente ou multiplexado.</li>
	<li>Opcional: Quando as primeiras demão de multiplexação, uso 200 ng convertido DNA e as seguintes condições de ciclismo: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 ciclos; 10 min 72 ° C. Nota: A temperatura pode variar dependendo da temperatura de fusão de primers.</li>
	<li>Produtos PCR sujeitos ao gel eletroforese em agarose 2% em 100 volts.</li>
	<li>Suave luz UV, extrair produtos PCR com um bisturi e adicionar para microtubos. Não exponha os produtos de PCR de luz UV em excesso para evitar danos ao DNA. Evitar o tempo de exposição acima de 30 s.</li>
	<li>Purifica os produtos PCR usando gel de purificação conforme descrito anteriormente3.</li>
	<li>Quantificar o DNA purificado da etapa 4.5 usando fluorometry. Prossiga para o passo 5 ou amostras de armazenamento-20 ° c.</li>
</ol>5. bissulfito sequenciamento biblioteca preparação
<ol><li>Execute a preparação da biblioteca de produtos PCR bissulfito-convertido. Opcional: multiplex produtos do PCR nesta fase.</li>
	<li>Executar reparação final usando até 100 ng do produto do PCR. Adicione 3 µ l final prep enzima e amortecedor da reação reparação final 6,5 µ l (10 x) para 55,5 µ l de produto PCR em um tubo de 0,2 mL. Coloque e incubar o tubo em um termociclador por 30 min a 20 ° C, seguido de 30 minutos a 65 ° C.</li>
	<li>Ligate adaptadores de sequenciamento, misturando o DNA final-reparado com 15 mix µ l Blunt/TA ligase, 2,5 µ l adaptador e potenciador de ligadura 1 µ l. Se usar &lt; 100 produto PCR do ng como entrada, diluir adaptador 10 vezes.</li>
	<li>Coloque a mistura (etapa 5.3) em um termociclador e incubar 15 min a 20 ° C. Pausar o termociclador e adicione 3 µ l usuário enzima ao tubo. Misture e coloque o tubo de volta no termociclador e incubar 15 min a 37 ° C.</li>
	<li>Tamanho selecione o adaptador-ligado DNA usando contas de fase sólida reversível imobilização (SPRI) com razões diferentes das esferas para DNA, dependendo do tamanho do produto do PCR.</li>
	<li>Adicione 13,5 µ l H2O para adaptador-ligado DNA de passo 5.4 e 55 µ l resuspended SPRI missanga. Incube a temperatura ambiente por 5 min e coloque o tubo num suporte magnético. Quando a solução é clara, transferir o sobrenadante para um tubo novo e descartar o tubo contendo os grânulos. Nota: O sobrenadante contém o DNA de adaptador-ligados e grandes fragmentos indesejados são vinculados aos talões descartados.</li>
	<li>Adicione 25 µ l resuspended SPRI grânulos para o sobrenadante da etapa 5.6, misturar e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Colocar o tubo no stand magnético e descartar o sobrenadante, quando a solução é clara. Nota: O sobrenadante Descartado contém DNA indesejado, Considerando que o DNA de adaptador-ligado está vinculado a grânulos.</li>
	<li>Enquanto o tubo é o suporte magnético, adicione 200 µ l 80% de etanol (preparado) para lavar os grânulos. Incubar 30 s e remover e descartar o sobrenadante. Repita esta etapa para um total de 2 lavagens.</li>
	<li>Ar secos grânulos por 5 min, enquanto o tubo é em suporte magnético com uma tampa aberta.</li>
	<li>Retire o tubo do ímã, Eluir o DNA em tampão de eluição 23 µ l e misture. Incube a temperatura ambiente por 2 min.</li>
	<li>Coloque o tubo num suporte magnético e quando a solução é clara, 2 µ l de transferência para um prato PCR de 96 poços para a amplificação do pre-PCR (etapa 5.14).</li>
	<li>Transferi o restante de aproximadamente 21 µ l para um novo tubo de 0,2 mL para amplificação por PCR (etapa 5.17). Nota: Certifique-se de não transferir qualquer grânulos como grânulos podem inibir reações enzimáticas dos próximos passos.</li>
	<li>Prossiga para a etapa 5.14 ou amostras de armazenamento-20 ° c.</li>
	<li>Execute a amplificação do pre-PCR por RT-qPCR para estimar o número de ciclos necessários para amplificar o DNA do adaptador-ligados. Por reação, adicionar o seguinte no PCR de 96 poços da placa contendo 2 µ l DNA (etapa 5.11): cartilha de índice 0,4 µ l, 0,4 µ l universal do PCR da primeira demão, 7,2 µ l H2O, 10 µ l RT-qPCR mestre mix.</li>
	<li>Coloque a placa em uma máquina PCR em tempo real e sujeito a placa para as seguintes condições: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 ciclos; 5 min 65 ° C.</li>
	<li>Estime o número de ciclos de amplificação necessária para cada amostra subtraindo um valor de Ct para o Ct-valor do pré-amplificação RT-qPCR correspondente ao fim da fase linear da reação de PCR.</li>
	<li>Amplificar o DNA adaptador-ligados da etapa 5.12 misturando: 21 µ l DNA, 25 µ l PCR master mix, 1 µ l índice da primeira demão, 1 µ l do PCR Universal da primeira demão e 2 µ l H2O. Em um termociclador, sujeito cada amostra para as seguintes condições: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [Ct calculado da etapa 5.16] ciclos; 5 min 65 ° C. Nota: Lembre-se de utilizar somente uma primeira demão de índice por amostra para permitir a multiplexação. O índice é inserido durante a PCR.</li>
	<li>Purificar os grânulos SPRI DNA amplificados e eluir em tampão de eluição 22 µ l.</li>
	<li>Controlar a qualidade da biblioteca pelo método de gel de eletroforese ou alternativa. Procure por tamanhos de pico de biblioteca correta (tamanho do produto (s) PCR mais adaptador).</li>
	<li>Estimar o tamanho médio de pares de base do produto de biblioteca pela análise do esfregaço: em avançada configurações globais, clique duas vezes em "tabela" sob análise do esfregaço. Definir a região de 100-1000 bp e clicar Okey. Sob a Mesa da região, a região definida aparece e biblioteca de tamanho médio (bp) é calculada.</li>
	<li>Quantificar as bibliotecas por fluorometry. Prossiga para o passo 6 ou bibliotecas de armazenamento-20 ° c.</li>
</ol>6. na próxima geração de sequenciamento
<ol><li>Calcule a concentração de nM de bibliotecas, usando a fórmula: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>Diluir as bibliotecas para o mesmo nM nM de concentração por exemplo 2 (escolher 4 nM, 2 nM, 1 nM, ou 0,5 nM, dependendo da concentração de biblioteca). Todas as bibliotecas para alcançar uma piscina de 2 bibliotecas nM da piscina.</li>
	<li>Desnaturar e diluir bibliotecas seguindo o guia de instrumento de sequenciamento. Em suma: desnaturar o pool nM 2 adicionando 0,2 N NaOH e incubar a temperatura ambiente por 5 min. diluir a piscina desnaturada para uma diluição final de 22:00. Desnaturar e diluir uma biblioteca de controle comercialmente disponível para uma diluição final de 12:05. Para um novo tubo, misture o pool de 22:00 com a biblioteca de controle 12:05 20%. Nota: Conversão de bissulfito introduz complexidade muito baixa. 20% de controle de biblioteca spike resultará em melhor qualidade de sequenciamento.</li>
	<li>Execute um 150 bp emparelhado-final em sequência usando um instrumento de sequenciamento profunda.</li>
</ol>7. computacional análise - níveis de metilação de estimativa
<ol><li>Gerar arquivos de .fastq (aqui chamados de sample1_R1.fastq.gz e sample1_R2.fastq.gz), gerar um índice de bismark do genoma inteiro de interesse (aqui em uma pasta chamada bismarkIndex) e certifique-se de que a sequência genômica de chrM está disponível em fasta formato (aqui em uma pasta chamada chrM).</li>
	<li>Pré-processar leituras para remover adaptadores e viés introduzido por primers: Use a ferramenta Trim_galore33. Remova os dois nucleotídeos da extremidade 5' do lê ambos frente e verso. trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o. / --trim1 - emparelhado sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>Alinhar o pre-processed leituras para o genoma inteiro usando Bismark34 Bismark - andorinha..--bam -o. /. / bismarkIndex / o-1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz Nota: Se outro alinhador é usado, certifique-se de que lê o que não pode ser alinhado com exclusividade é descartadas.</li>
	<li>Extrato lê o mapeamento para o cromossomo M, aqui usando Samtools35 samtools classificar -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam samtools índice sample1_sorted.bam samtools Ver os chrM de sample1_sorted.bam -u | samtools classificar - n - O BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>Extrair as informações de metilação bismark_methylation_extractor -p - CX..--cytosine_report..--abrangente..--genome_folder. /./sample1_chrM.bam chrM</li>
	<li>Use o .bedGraph, os COV ou os arquivos de CX_report.txt para uma análise mais aprofundada. Use o arquivo sample1_chrM.CX_report.txt para visualização e teste.</li>
	<li>Execute o recorte ainda mais na etapa de pré-processamento, se várias regiões são interrogadas e um viés de primeira demão pode ser visível nas tramas M-viés geradas durante o mapeamento. Consulte a documentação do Bismark para obter mais informações.</li>
</ol>8. computacional análise - teste de diferenças
<ol><li>Certifique-se de que o arquivo CX_report.txt contém 7 colunas, cromossomo (chrM aqui), posição, vertente, número de leituras metilados, número de leituras unmethylated, C contexto e sequência circundante, para todos os C no cromossomo M.</li>
	<li>Como o CX_report cobre chrM em sua totalidade, verifique o subconjunto para a região (ões) que é amplificado.</li>
	<li>Use testes não-paramétricos para as diferenças entre as amostras, tais como o teste exato de um pescadores do C individual ou um teste de sinal-para toda uma região. Nota: Quantificação será frequentemente perto de 0% de metilação, que é a razão por que supondo que a normalidade não é apropriado.</li>
	<li>Da mesma forma, para visualização, ou Visualizar quantiles ou calcular intervalos de confiança de proporção binomial.</li>
</ol>

<ol><li>Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+and+transcription+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA replication and transcription in mammalian mitochondria.</a> Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).</li>
<li>Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+intact+mitochondrial+DNA+agarose+electrophoresis+reveals+the+structural+complexity+of+the+mammalian+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e58(2013).</li>
<li>Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+Suggesting+Absence+of+Mitochondrial+DNA+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation.</a> Front Genet. 8, 166(2017).</li>
<li>Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+and+distribution+of+5-methylcytosine+in+human+DNA+from+different+types+of+tissues+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.</a> Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li>
<li>Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+non-CpG+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence for non-CpG methylation in mammals.</a> Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).</li>
<li>Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evidence+for+functional+non-CpG+methylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells.</a> Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).</li>
<li>Nass, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+methylation+of+mitochondrial+and+nuclear+DNA+in+cultured+mouse%2C+hamser+and+virus+trasnforemd+hamser+cells+in+vivo+and+in+vitro+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation.</a> J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).</li>
<li>Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferase+1%2C+cytosine+methylation%2C+and+cytosine+hydroxymethylation+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria.</a> PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).</li>
<li>Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+Region+of+Mitochondrial+DNA+Shows+an+Unusual+CpG+and+Non-CpG+Methylation+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern.</a> DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).</li>
<li>Jia, Y., Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Low-Protein+Diet+Affects+Epigenetic+Regulation+of+Hepatic+Mitochondrial+DNA+Transcription+in+a+Sex-Specific+Manner+in+Newborn+Piglets+Associated+with+GR+Binding+to+Its+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63855(2013).</li>
<li>Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Betaine+Supplementation+during+Gestation+Enhances+Expression+of+mtDNA-Encoded+Genes+through+D-Loop+DNA+Hypomethylation+in+the+Skeletal+Muscle+of+Newborn+Piglets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets.</a> J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).</li>
<li>Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+methyl+cycle+affects+mitochondrial+methyl+availability+and+glutathione+level+in+Down%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome.</a> Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+valproic+acid+on+mitochondrial+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics.</a> Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).</li>
<li>Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+5-hydroxymethylcytosine+in+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).</li>
<li>Menga, A., Palmieri, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC25A26+overexpression+impairs+cell+function+via+mtDNA+hypermethylation+and+rewiring+of+methyl+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism.</a> FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).</li>
<li>Byun, H. -M., Panni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+airborne+pollutants+on+mitochondrial+DNA+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation.</a> Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1(2013).</li>
<li>Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+mitochondrial+methylation+and+exposure+to+airborne+particulate+matter+in+the+early+life+environment%3A+An+ENVIRONAGE+birth+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study.</a> Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).</li>
<li>Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+is+associated+with+epigenetic+and+genetic+regulation+of+mitochondrial+DNA+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans.</a> Clin Epigenetics. 7 (1), 1739(2015).</li>
<li>Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Air+Pollution+and+Blood+Mitochondrial+DNA+Methylation+on+Markers+of+Heart+Rate+Variability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability.</a> J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).</li>
<li>Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).</li>
<li>Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+mitochondria-targeted+DNA+methylation+identifies+GpC+methylation%2C+not+CpG+methylation%2C+as+potential+regulator+of+mitochondrial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression.</a> Sci Rep. 7 (1), 177(2017).</li>
<li>Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Front+cellr+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279(2013).</li>
<li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-methylcytidylic+acid%3A+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li>
<li>Gama-Sosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.worldcat.org/title/levels-and-distribution-of-5-methylcytosine-in-chordate-dna/oclc/15059352">Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA</a>. , 1-201 (1985).</li>
<li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li>
<li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li>
<li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li>
<li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MethPrimer%3A+designing+primers+for+methylation+PCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li>
<li>Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiSearch%3A+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9(2005).</li>
<li>Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BiSearch+web+server%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431(2006).</li>
<li>Krueger, F. Trim Galore!. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</a> (2018).</li>
<li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bismark%3A+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin%3A+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li>
<li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li>
</ol>

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes para declarar.

Aqui, nós fornecemos um protocolo de bissulfito-sequenciamento que é projetado especificamente para interrogar a metilação do DNA mitocondrial. As diferenças com bissulfito-sequenciamento protocolos usados para DNA genômico situa-se na utilização de uma enzima de restrição prévia etapa de digestão e uma análise de bioinformatic acórdão fora falsos positivos decorrentes NUMT sequências.
Nós fornecemos um protocolo para evitar artefatos de bissulfito-sequenciamento ao investigar a metilação do D...

O genoma mitocondrial é uma estrutura circular, double-stranded de aproximadamente 16,5 kg base (kb), constitui um pesado e um fio de luz. O genoma mitocondrial está presente em várias cópias dentro de cada célula, herdado maternalmente e codifica componentes essenciais da cadeia respiratória complexos1. Semelhantes aos genomas bacterianas e ao contrário do genoma nuclear, o genoma mitocondrial é organizado em numerosas estruturas secundárias e terciárias, como em estruturas enrolado e supercoiled2, que pode tornar o acesso difícil durante o sequenciamento experiências3.
No núcleo, metilação do DNA é uma marca epigenética extensivamente estudada que desempenha um papel em vários processos, nomeadamente na regulação da expressão gênica. Em genomas de mamíferos, a metilação do DNA ocorre principalmente na posição 5 do anel pirimidina de deoxycytidines, principalmente de dinucleotídeos CG (ou CpG). Metilação de citosina é encontrada em 70% de todos os CpG no genoma de células somáticas e contas para ~ 1% do totalque 4bases de DNA. Methylations de DNA também tem sido descrita em contextos não-CpG, como CpA, CpT e CpC e existem em várias quantidades no DNA nuclear, com valores até 25% de todas as Citosinas metiladas em células-tronco embrionárias5,6,7.
Enquanto o methylation do cytosine do genoma nuclear é amplamente aceito, a existência de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial é ainda controversa. O primeiro estudo investigar methylation DNA mitocondrial foi realizado em pilhas cultivadas onde a metilação do DNA mitocondrial foi prontamente detectada, embora em níveis mais baixos em comparação com nuclear DNA8. Em células humanas e murino, metilação de DNA mitocondrial também foi detectada em níveis baixos (2-5%). Utilizando ensaios contando com 5 metilcitosina captura, tais como imunoprecipitação de DNA metilada (MeDIP) seguida por PCR quantitativo, metilação de DNA mitocondrial também foi detectada em vários rato e humanos e células linhas9,10, 11,12. Usando anticorpos contra 5-metilcitosina em um ensaio de ELISA ou espectrometria de massa, níveis substanciais de metilação do DNA foram detectados purificada fracções mitocondrial13,14,15, 16. no entanto, a maioria dos ensaios nos estudos acima mencionados utilizado técnicas que não foram projetadas para fornecer a quantificação absoluta de metilação do DNA na única base-resolução.
Análise de metilação de DNA quantitativo e resolutiva pode ser alcançado por uma técnica chamada "bissulfito de sequenciamento", que aproveita a propriedade de bissulfito de sódio para converter unmethylated citosina em uracil em single-stranded DNA contexto17 . Usando o sequenciamento de bissulfito, uma constelação de estudos detectou a presença de metilação de citosina em vários níveis. DNA mitocondrial de metilação na região D-loop, a 12S ou região 16S prontamente foi detectado em humano18,19,20,21,22,mouse de23 e24 tecidos e células, no entanto, com uma variabilidade de intrigante, de 1-20% do totais citosinas através de estudos.
Em comparação com estes numerosos estudos, poucos estudos, incluindo do nosso grupo, têm disputado a presença de DNA mitocondrial metilação3,25,26,27 ou questionado a relevância biológica de níveis muito baixos de mtDNA níveis (abaixo de 2%)28. Recentemente, nós relatamos a observação de um artefato de bissulfito-sequenciamento potencial em toda mitocondrial bissulfito sequenciamento3. Nós fornecemos evidências de que a estrutura secundária do DNA mitocondrial pode levar a resultados falsos positivos sequenciamento de bissulfito, desse modo, superestimando os níveis de metilação. Nós fornecemos aqui um protocolo para evitar um artefato de bissulfito-conversão de DNA mitocondrial. Este protocolo utiliza uma simples digestão enzimática do DNA para interromper estruturas secundárias do DNA mitocondrial e permitir o acesso total ao bissulfito, seguindo um protocolo de sequenciamento de bissulfito. Além disso, nós fornecemos um pipeline de bioinformatic acompanhamento para a análise do sequenciamento de bissulfito.

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td># R0136</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA methylation-lightning kit</td><td>Zymo Research</td><td># D5030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio Qubit ssDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q32856</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq mais kit de DNA polimerase</td><td>Qiagen</td><td># 203603&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Extração de Gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td># 28704</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Kit para Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligoes para Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7335S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td># A63881</td><td></td></tr><tr><td>Chip de DNA de Alta Sensibilidade</td><td>Agilent</td><td># 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de dsDNA de alta sensibilidade</td><td>Qubit Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reagentes MiSeq v2 300 ciclos</td><td>Illumina</td><td># MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Controle PhiX v3</td><td>Illumina</td><td># FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td># S5881</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador C1000</td><td>Biorad</td><td># 1851148</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Sistema de detecção de PCR em tempo real</td><td>Biorad&nbsp;</td><td>#1855195</td><td></td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td># G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento MiSeq</td><td>Illumina</td><td># SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

metodologia para detecção precisa de metilação do dna mitocondrial

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantificação de metilação do DNA pode ser conseguida usando sequenciamento de bissulfito, que aproveita a propriedade de bissulfito de sódio para converter unmethylated citosina em uracil, num contexto single-stranded DNA. Sequenciamento de bissulfito pode ser direcionado (usando PCR) ou executadas no genoma inteiro e fornece quantificação absoluta de metilação de citosina na única base-resolução. Dada a natureza distinta de DNA nuclear e mitocondrial, nomeadamente a estrutura secundária, devem ser feitas adaptações de métodos de sequenciamento de bissulfito para investigar a metilação de citosina no DNA mitocondrial. Estrutura secundária e terciária de DNA mitocondrial de fato pode levar a bissulfito artefatos levando a falso-positivos devido a acesso de pobres incompleta desnaturação de bissulfito de ADN single-stranded de sequenciamento. Aqui, descrevemos um protocolo usando uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com pipeline de análise de bioinformatic para permitir a quantificação exata da citosina níveis de metilação no DNA mitocondrial. Além disso, podemos fornecer diretrizes para projetar os primers de sequenciamento de bissulfito específicos para DNA mitocondrial, para evitar a segmentação segmentos NUclear mitocondrial indesejáveis (NUMTs) inserido no genoma nuclear.

Duas etapas neste protocolo são cruciais ao investigar a metilação do DNA mitocondrial. 1) a abertura da estrutura secundária e 2) o projeto de primers de específicas de DNA mitocondriais.
Digerindo o DNA genômico humano com a enzima de restrição BamHI (Figura 1), a estrutura de DNA mitocondrial será cortada no nucleotídeo posição 14.258 e estrutura secundária será aberta.
<p class="jove_content...

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir que a quantificação exata de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com um pipeline de análise de bioinformatic que pode ser usado para evitar a superestimação dos níveis de metilação do DNA mitocondrial causada pela estrutura secundária do DNA mitocondrial.

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

O objetivo geral deste protocolo de sequenciamento de bissulfito e pipeline de bioinformática é obter uma quantificação precisa da metilação do DNA mitocondrial. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo mitoepigenético, como a metilação do DNA mitocondrial está mudando a doença humana? A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a quantificação precisa da metilação do DNA mitocondrial.Etapa crucial ao investigar a metilação do DNA mitocondrial é linearizar o DNA mitocondrial por digestão de BamH1 antes do tratamento com bissulfito de sódio. O sítio da enzima de restrição BamH1 é exibido neste mapa do genoma mitocondrial humano. Também são mostradas as cinco regiões do genoma mitocondrial que serão investigadas por sequenciamento de bissulfitos.Alça de deslocamento, tRNA fenilalanina e ribossomo 12S, ribossomo 16S, NADH desidrogenase 5, gene codificador de mRNA do citocromo B. Depois de projetar os primers para sequenciamento de bissulfito, usando ferramentas on-line conforme descrito no protocolo de texto, a especificidade do primer em relação ao genoma mitocondrial é verificada usando o BiSearch. As sequências de primers são adicionadas à função BiSearch primer search.A caixa de bissulfito é marcada e um genoma de referência é selecionado. Os resultados da pesquisa mostrarão potenciais produtos de PCR gerados em cadeias sense e antisense. Para amplificar as regiões de interesse do genoma mitocondrial convertido em bissulfito, realize PCR usando uma Taq polimerase de início a quente.Se estiver usando primers separadamente, misture 100 nanogramas de DNA convertido, 500 micromolares de primers sense e antisense, uma mistura de dNTP de um microlitro e polimerase a 7,5 unidades por reação em um volume total de 50 microlitros. Execute o PCR com as seguintes condições: cinco minutos a 95 graus Celsius, um minuto a 94 graus Celsius, um minuto a 55 graus Celsius, um minuto a 72 graus Celsius por 35 ciclos, seguido de 10 minutos a 72 graus Celsius. Para primers de multiplexação, use 200 nanogramas de DNA convertido nas seguintes condições de ciclagem: cinco minutos a 95 graus Celsius, um minuto a 94 graus Celsius, 1,5 minutos a 55 graus Celsius e 1,5 minutos a 72 graus Celsius por 35 ciclos, seguidos por 10 minutos a 72 graus Celsius.Quando a PCR estiver concluída, realize eletroforese em gel nos produtos da PCR, usando uma agarose a 2% a 100 volts. A extração dos produtos de PCR do gel de agarose deve ser feita de forma a minimizar a exposição aos raios UV e o risco de danos ao DNA. Tire uma foto do gel sob luz ultravioleta.Em seguida, muito rapidamente, marque ao redor do produto de PCR com um bisturi e desligue a luz ultravioleta. Em seguida, corte o produto de PCR lentamente sem exposição à luz ultravioleta. Coloque as fatias de gel em tubos de microcentrífuga e purifique os produtos de PCR usando purificação de gel, conforme descrito no protocolo de texto.Quantificar o ADN purificado utilizando fluorometria. Armazene as amostras a 20 graus Celsius, se não proceder imediatamente à preparação da biblioteca de sequenciamento de bissulfito. Comece a preparação da biblioteca de produtos de PCR convertidos em bissulfito realizando o reparo final usando até 100 nanogramas de produto de PCR.Para cada tubo de 0,2 mililitro, adicione 55,5 microlitros de produto PCR, três microlitros de enzima de preparação final e 6,5 microlitros de tampão de reação de reparo final 10X. Incube os tubos em um termociclador a 20 graus Celsius por 30 minutos, seguido de 65 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, ligue os adaptadores de sequenciamento misturando o DNA reparado final com 15 microlitros de mistura Blunt / TA ligase, 2,5 microlitros de adaptador e um microlitro de intensificador de ligação.Coloque a mistura em um termociclador e incube a 20 graus Celsius por 15 minutos. Pause o termociclador e adicione 3 microlitros de enzima USER a cada tubo. Misture e coloque os tubos de volta no termociclador e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos.Tamanho: selecione o DNA ligado ao adaptador usando imobilização reversível em fase sólida ou SPRI. Adicione ao DNA ligado ao adaptador 13,5 microlitros de água e 55 microlitros de esferas de SPRI ressuspensas. Incube em temperatura ambiente por cinco minutos.Coloque os tubos em um suporte magnético. Quando a solução estiver límpida, transferir o sobrenadante, contendo o ADN ligado ao adaptador, para um novo tubo e rejeitar o tubo que contém as contas. Adicione 25 microlitros de esferas de SPRI ressuspensas ao sobrenadante; Misture e incube em temperatura ambiente por cinco minutos.Coloque os tubos no suporte magnético e, quando a solução estiver límpida, descarte o sobrenadante. O DNA ligado ao adaptador agora está ligado às contas. Enquanto os tubos estão no suporte magnético, adicione 200 microlitros de etanol a 80% recém-preparado a cada tubo e incube por 30 segundos para lavar as contas.Remova e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa de lavagem com etanol para um total de duas lavagens. Retire o etanol da segunda lavagem e seque ao ar as contas, deixando os tubos no suporte magnético, com a tampa aberta, por cinco minutos.Após cinco minutos, remova os tubos do suporte magnético, adicione 23 microlitros de tampão de eluição de DNA às esferas e misture. Incube em temperatura ambiente por dois minutos. Coloque os tubos no suporte magnético até que a solução esteja límpida.Em seguida, transfira dois microlitros da solução para uma placa de PCR de 96 poços para a amplificação pré-PCR. Evitando cuidadosamente os grânulos, transfira o restante da solução para um novo tubo de 0,2 mililitro para amplificação por PCR. Realize a amplificação pré-PCR por RT-qPCR para estimar o número de ciclos necessários para amplificar o DNA ligado ao adaptador.Faça uma mistura principal do seguinte por reação usada. 0,4 microlitros de primer índice, 0,4 microlitros de primer PCR universal, 7,2 microlitros de água e 10 microlitros de mistura master RT-qPCR. Em seguida, misture a mistura principal e adicione 18 microlitros de mistura principal aos dois microlitros de DNA na placa de PCR de 96 poços.Coloque a placa em uma máquina de PCR em tempo real e realize a amplificação nas seguintes condições: 30 segundos a 98 graus Celsius, 10 segundos a 98 graus Celsius e 75 segundos a 65 graus Celsius por 20 ciclos, seguidos de cinco minutos a 65 graus Celsius. Depois de estimar o número de ciclos de amplificação necessários para cada amostra, conforme descrito no protocolo de texto, amplificar o DNA ligado ao adaptador. Para cada amostra, misture 21 microlitros de DNA, 25 microlitros de mistura principal de PCR, um microlitro de primer índice, um microlitro de primer PCR universal e dois microlitros de água.No termociclador, submeta cada amostra às seguintes condições: 30 segundos a 98 graus Celsius, 10 segundos a 98 graus Celsius e 75 segundos a 65 graus Celsius para o número calculado de ciclos, seguidos de cinco minutos a 65 graus Celsius. Purifique o DNA amplificado usando esferas de SPRI, conforme demonstrado anteriormente, e elua em 22 microlitros de tampão de eluição. Controle a qualidade da biblioteca usando um Bioanalyzer.Procure os tamanhos de pico corretos da biblioteca. Estime o tamanho médio do par de bases dos produtos da biblioteca por meio de análise de esfregaço. Em Configurações globais avançadas, em Análise de esfregaço, clique duas vezes em Tabela.Encontre a região de 100 a 1000 pares de bases e clique em OK. Em Tabela de Regiões, a região definida aparecerá e o tamanho médio da biblioteca será calculado. Quantifique a biblioteca por fluorometria. Armazene a biblioteca a 20 graus Celsius até que esteja pronta para o sequenciamento de próxima geração e análises computacionais.Por sequenciamento de bissulfito, a metilação do DNA mitocondrial foi investigada em DNA total não digerido e digerido de células musculares esqueléticas humanas em cinco regiões diferentes do genoma mitocondrial. Um quadrado completo representa os locais de dinucleotídeos de citosina guanina. O quadrado aberto representa os locais de dinucleotídeos não citosina guanina.Para o DNA mitocondrial não digerido, os níveis de metilação variaram de 0 a 15,1% em todas as regiões investigadas. No entanto, quando o DNA foi digerido antes da conversão do bissulfito, a taxa de não coversão caiu para um máximo de 1% em todas as regiões. Isso ilustra a importância da digestão de BamH1 antes da conversão do bissulfito para evitar a superestimação dos níveis de metilação do DNA mitocondrial.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como realizar o sequenciamento de bissulfito mitocondrial e, seguindo nosso pipeline de bioinformática, você pode obter uma quantificação precisa da metilação do DNA mitocondrial.

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este vídeo demonstra o protocolo para imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP). MEDIP é um procedimento dois dias que, seletivamente, extratos de fragmentos de DNA metilado partir de uma amostra do DNA genômico utilizando anticorpos com especificidade para 5-metilcitosina (anti-5 mC).

Imunoprecipitação DNA metilado

O padrão ouro para a análise de metilação do DNA é sequenciamento genômico de DNA convertidos bissulfito. Este método tira vantagem do aumento da sensibilidade em comparação com 5 citosina-metilcitosina (5-MEC) para bissulfito de desaminação em condições ácidas. Citosinas não metiladas pode ser distinguida de citosinas metiladas após a amplificação do DNA genômico alvo.

A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito

Um fluxo de trabalho simplificado para estudar a metilação do DNA e alterações de expressão gênica em início de vida estresse é mostrado. A partir de separação materno de ratos recém-nascidos e isolamento de tecidos cerebrais discretas, que representam um protocolo para simultaneamente isolar DNA e RNA de punções de tecido cerebral para a sequenciação bissulfito subsequente e RT-PCR.

Análise otimizado de metilação do DNA e expressão gênica de pequenas áreas anatomicamente definidos do Cérebro

Este vídeo descreve a técnica de dot-blot para determinar o nível de metilação do DNA em condrócitos humanos in vitro por meio do blotting de amostras de DNA em uma membrana de náilon e a visualização subsequente usando anticorpos monoclonais. Isso ajuda a determinar o fenótipo dos condrócitos em vários estágios da cultura.

Dot Blot de 5-metilcitosina para determinar a extensão da metilação do DNA

O sequenciamento de bissulfito de representação reduzida aprimorada é um método para a preparação de bibliotecas de sequenciamento para análise de metilação de DNA com base na digestão de enzimas de restrição combinada com conversão de bissulfito de citosina. Este protocolo requer 50 ng de material de partida e produz dados de resolução de pares de bases em regiões genômicas ricas em GC.

Aprimorada Redução Representação Bisulfite Sequencing para a Avaliação de metilação de DNA na resolução de pares de bases

O sequenciamento de amplicon de bissulfito (BSAS) é um método para quantificar a metilação da citosina em regiões genômicas alvo de interesse. Este método usa conversão de bissulfito emparelhada com amplificação de PCR de regiões-alvo antes do sequenciamento de próxima geração para produzir quantificação absoluta da metilação do DNA em um nível específico de base.

Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

Aqui apresentamos um protocolo para medir o número absoluto de cópias mitocondriais (mt)DNA e os níveis de heteroplasmia de deleção do mtDNA em células únicas.

Medindo o Número de Cópias de DNA Mitocondrial de Célula Única e a Heteroplasmia Usando a Reação em Cadeia da Polimerase de Gotículas Digitais

Os ensaios de pirosequenciamento permitem a genotipagem robusta e rápida de polimorfismos de nucleotídeo único do DNA mitocondrial em células ou tecidos heteroplasmáticos.

Genotipagem de Polimorfismos de Nucleotídeo Único no Genoma Mitocondrial por Pirosequenciamento

Um procedimento para estudar a dinâmica do metabolismo do DNA mitocondrial (mtDNA) em células usando um formato de placa multi-poço e imagens automatizadas de imunofluorescência para detectar e quantificar a síntese e distribuição do mtDNA é descrito. Isso pode ser usado para investigar os efeitos de vários inibidores, estresses celulares e silenciamento gênico no metabolismo do mtDNA.

Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

Aprenda a quantificar com precisão a metilação do DNA mitocondrial usando sequenciamento por bisulfito e análise bioinformática. Este método computacional permite investigar alterações epigenéticas em doenças humanas.

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

Explorar mais vídeos