Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose
25 de maio de 2018
Esta molécula fluorescência em situ da hibridação protocolo é otimizado para quantificar o número de moléculas de RNA em leveduras brotamento durante a meiose e crescimento vegetativo.
O objetivo geral desta hibridização in situ de RNA de molécula única otimizada, ou smFISH, é detectar e quantificar moléculas individuais de RNA por célula durante o crescimento vegetativo e a meiose da levedura em brotamento. Este método revela a variabilidade célula a célula na expressão gênica na localização do RNA subcelular e, portanto, é uma técnica poderosa para estudar a regulação gênica. Além das informações exclusivas que podem ser reveladas pelo smFISH, a principal vantagem da técnica é que, uma vez otimizada, ela é robusta e altamente reprodutível.
Uma cultura meiótica será usada para a demonstração deste protocolo. Para fixar a cultura em 3% de formaldeído, adicione 1840 microlitros da cultura a 160 microlitros de 37% de formaldeído em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Inverta cerca de cinco vezes para misturar.
Coloque o tubo em um tambor de rolos em temperatura ambiente por 20 minutos. Após 20 minutos, continue fixando a quatro graus Celsius com rotação durante a noite. No dia seguinte, prepare-se para a digestão descongelando primeiro complexos de ribonucleosídeos vanadilares de 200 milimolares, ou VRC, a 65 graus Celsius por pelo menos 10 minutos.
Para preparar a mistura mestre de digestão, primeiro pipete 2125 microlitros de tampão B em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, faça um vórtice do VRC quente por cinco segundos para ressuspendê-lo totalmente e adicionar 200 microlitros de VRC ao tubo de 15 mililitros. A mistura deve aparecer na cor verde acastanhada clara.
Centrifugar a amostra meiótica a 21 000 x g durante um minuto e meio à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante com cuidado, colocando a ponta de vácuo no lado oposto do pellet para evitar mexer no pellet. Ressuspenda as células em um mililitro e meio de tampão frio B pipetando para cima e para baixo para misturar.
Centrifugar a 21 000 x g durante um minuto e meio. Remova a maior parte do líquido por aspiração a vácuo, deixando para trás cerca de 100 microlitros. Ressuspenda as células em um mililitro e meio de tampão frio B. Centrifugue as amostras, remova o líquido e ressuspenda as células em um mililitro e meio de tampão frio B novamente.
Centrifugar a 21 000 x g durante um minuto e meio. Aspirar o líquido completamente por pipetagem. Ressuspenda as células em 425 microlitros de mistura mestre de digestão e vórtice brevemente.
Adicione cinco microlitros de zimoliase ao tubo e vórtice por dois a três segundos para misturar. Coloque o tubo em um tambor de rolos e digerir a 30 graus Celsius por 15 a 30 minutos. Após 15 minutos, verifique as células por microscopia a cada cinco minutos e interrompa a digestão quando cerca de 80% das células parecerem não transparentes e não refrativas.
Centrifugar o tubo a 376 x g durante três minutos. Remova o sobrenadante completamente. Ressuspenda suavemente as células com um mililitro de tampão B, pipetando para cima e para baixo uma a duas vezes para misturar.
Centrifugue o tubo e remova o tampão. Ressuspenda suavemente as células em um mililitro de etanol a 70% e incube em temperatura ambiente por três horas e meia a quatro horas. Para iniciar o procedimento de hibridização, centrifugue o tubo de células a 376 x g por três minutos.
Remova 500 microlitros do etanol 70% do tubo. Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender as células restantes e transfira as células para um tubo de baixa adesão. A transferência da amostra para um tubo de baixa adesão é fundamental para evitar o excesso de perda de células durante as lavagens subsequentes de formamida.
Centrifugue o tubo de baixa aderência e remova todo o etanol. Adicione um mililitro de tampão de lavagem de 10% de formamida ao tubo e pipete suavemente para cima e para baixo duas a três vezes para ressuspender as células. Deixe as células endurecerem à temperatura ambiente por cerca de 20 minutos enquanto prepara as soluções de hibridização, conforme descrito no protocolo de texto.
Centrifugar a amostra e eliminar o sobrenadante para os resíduos perigosos. Adicione pelo menos 50 microlitros de cada solução de hibridização ao tubo e agite o tubo para misturar. Incube a 30 graus Celsius em um tambor de rolo por pelo menos 16 horas no escuro.
Quando a hibridização estiver completa, coloque o tubo de células em uma caixa coberta com papel alumínio para proteger da luz. Centrifugar a amostra a 376 x g durante três minutos. Remover o sobrenadante para os resíduos perigosos por pipetagem.
Ressuspenda a amostra em um mililitro de tampão de lavagem de formamida a 10% pipetando suavemente para cima e para baixo duas a três vezes. Coloque o tubo de células de volta em uma caixa coberta com papel alumínio para proteger da luz e incube a 30 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, centrifugue a amostra.
Remova o sobrenadante para resíduos perigosos pipetando, deixando cerca de 50 microlitros. Ressuspenda a amostra em um mililitro de solução DAPI pipetando suavemente para cima e para baixo duas a três vezes. Mais uma vez, coloque o tubo de células na caixa coberta com papel alumínio e incube a 30 graus Celsius por 30 minutos.
Centrifugar a amostra e remover completamente o sobrenadante por pipetagem. Para amostras que não serão visualizadas imediatamente, ressuspenda o pellet em 50 microlitros de tampão GLOX sem enzimas. Pipete para cima e para baixo três a quatro vezes para misturar.
Mantenha na caixa coberta com papel alumínio a quatro graus Celsius até que esteja pronto para a imagem. Para amostras que estão sendo fotografadas imediatamente, adicione 15 a 20 microlitros de tampão GLOX com enzimas. Pipete cinco microlitros em uma lamínula e coloque a lamínula em uma lâmina.
Coloque um lenço de laboratório em cima da lâmina onde a lamínula é colocada. Pressione suavemente o lenço para definir o slide. Coloque a lâmina em uma caixa coberta com papel alumínio para transferência para a sala do microscópio.
Este protocolo foi usado para examinar a expressão do gene NDC80, que expressa duas isoformas de mRNA. A isoforma de transcrito longo não decodificado tem uma extensão de 400 pares de bases e cinco primos em comparação com a isoforma curta. Dois conjuntos de sondas foram projetados.
O conjunto CF 590 se liga à região única de cinco primos da isoforma longa, e o conjunto Q 670 se liga à região comum de ambas as isoformas. Sob condições otimizadas, pontos distintos de smFISH foram claramente identificados para ambos os conjuntos de sondas. Os dois conjuntos de sondas foram usados para estudar a expressão de NDC80 durante o crescimento vegetativo e a meiose.
Em células vegetativas, foi detectado um sinal robusto do conjunto de sondas Q 670, mas não do conjunto de sondas CF 590. Em contraste, o sinal robusto de ambos os conjuntos de sondas foi detectado na prófase meiótica, e a maioria dos pontos tinha sinal co-localizado. A análise de Northern blot confirmou que a isoforma longa foi expressa especificamente na meiose.
As células vegetativas apresentaram uma mediana de cinco transcritos de isoformas curtas por célula, enquanto nas células de prófase meiótica, a mediana caiu significativamente para quatro transcritos por célula. Na prófase meiótica, o número médio de transcritos de isoformas longas por célula foi de 21 e 100% das células expressaram o transcrito. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 72 horas se for executada corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante primeiro otimizar a duração da digestão e a concentração de sondas smFISH necessárias para obter a relação sinal-ruído ideal. Além disso, lembre-se de adicionar VRC durante a digestão e hibridização durante a noite para evitar a atividade da nuclease. Com esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem a regulação dinâmica de genes e a localização de RNA subcelular.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar RNA molecular único FISH na meiose de levedura em brotamento.
Visão Geral
Este protocolo otimizado de hibridização fluorescente in situ em molécula única (smFISH) quantifica moléculas de RNA em leveduras brotantes durante o crescimento vegetativo e a meiose. O método destaca a variabilidade entre células na expressão gênica e na localização subcelular do RNA.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Regulação Gênica
Antecedentes
- A hibridização in situ de RNA de molécula única permite a detecção de moléculas individuais de RNA.
- Esta técnica fornece informações sobre a variabilidade da expressão gênica.
- É particularmente útil para o estudo de leveduras brotantes.
- O protocolo é robusto e reproduzível após a otimização.
Objetivo do Estudo
- Detectar e quantificar moléculas de RNA em células de levedura.
- Investigar a expressão gênica durante diferentes fases de crescimento.
- Analisar a expressão de genes específicos, como NDC80.
Métodos Utilizados
- Fixação de culturas de levedura com formaldeído.
- Preparação da mistura mestra de digestão para permeabilização celular.
- Hibridização de sondas de RNA para isoformas específicas de mRNA.
- Microscopia para visualização de moléculas de RNA.
Resultados Principais
- Foram identificados pontos distintos de smFISH para diferentes isoformas de RNA.
- Foi observada variabilidade célula a célula na expressão de NDC80.
- O método quantificou com sucesso o RNA durante o crescimento vegetativo e a meiose.
- Condições otimizadas permitiram a visualização clara da localização do RNA.
Conclusões
- smFISH é uma ferramenta poderosa para o estudo da regulação gênica em leveduras.
- O protocolo pode ser aplicado a diversos genes e condições.
- Os achados contribuem para a compreensão da dinâmica de RNA em processos celulares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A hibridização fluorescente in situ de molécula única (smFISH) permite a quantificação direta de moléculas de RNA com resolução de única célula, fornecendo informações essenciais sobre a heterogeneidade da expressão gênica e o posicionamento subcelular de transcritos. Essa capacidade é fundamental para reduzir riscos em hipóteses iniciais de descoberta e aprimorar a validação de alvos em modelos de levedura relevantes para a regulação gênica eucariótica. Fluxos de trabalho smFISH robustos e reprodutíveis sustentam a confiança preditiva e a continuidade translacional em portfólios de P&D.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação direta da variabilidade da expressão gênica no nível de célula única.
- Apóia a validação funcional de isoformas de transcritos e mecanismos regulatórios.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao resolver a localização de RNA em nível subcelular.
- Fornece dados quantitativos para orientar decisões de seleção e triagem de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prepara sistemas de levedura validados para triagem subsequente de moduladores da regulação gênica.
- Fornece medidas quantitativas padronizadas e reprodutíveis de RNA para o desenvolvimento de ensaios.
- Permite detecção robusta de isoformas de transcritos para fluxos de trabalho de avaliação de compostos.
- Apóia escalabilidade e reutilização da plataforma em estudos de expressão gênica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os achados do modelo de levedura com paradigmas mais amplos da regulação gênica em eucariotos.
- Garante continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de biomarcadores de expressão gênica.
- Reduz o risco biológico ao esclarecer a dinâmica dos transcritos em sistemas relevantes para doenças.
- Permite o avanço ajustado ao risco de alvos da regulação gênica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A análise de smFISH integra-se ao continuum de descoberta, desde a fase inicial de testes de hipóteses até a identificação de compostos líderes e validação pré-clínica, especialmente em estudos de regulação gênica e isoformas de transcritos em modelos de levedura.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao quantificar a abundância e a localização de transcritos.
- Triagem: Fornece quantificação de RNA de célula única pronta para ensaios e reprodutível para plataformas de triagem.
- Análises: Oferece medidas quantitativas e estatisticamente robustas para comparar a expressão gênica entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta as descobertas no modelo de levedura a estratégias de biomarcadores pré-clínicos quando a dinâmica dos transcritos é conservada.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e reutilizável para análise de expressão gênica em nível de célula única em diversos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de regulação gênica.
- Valor Operacional: Fornece quantificação padronizada, reprodutível e escalonável de RNA de célula única.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper e a eficiência do capital ao esclarecer precocemente a biologia em nível de transcritos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco e o avanço de alvos de regulação gênica.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em genética de leveduras, biologia de RNA e microscopia de fluorescência.
- Requer acesso a instrumentação de imagem de alta qualidade e software analítico.
- Necessita padronização entre equipes no design das sondas e nas condições de hibridização.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes cepas de levedura ou condições de crescimento.
- A otimização da digestão e da concentração da sonda é fundamental para a relação sinal-ruído e a qualidade dos dados.
