Name: Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprenda a técnica smFISH para detectar e quantificar moléculas de RNA em leveduras durante crescimento vegetativo e meiose. Este método revela variabilidade na expressão gênica e localização subcelular do RNA.

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Agradecemos a Anne Dodson e Stephanie Heinrich para aconselhamento sobre como otimizar o protocolo smFISH, Xavier Darzacq para ajudar com a plataforma de análise, Haiyan Huang para sugestões sobre a análise estatística. Este trabalho foi financiado por fundos da March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) e Glenn Foundation para EÜ e um NSF pós-graduação Research Fellowship Grant no. DGE-1106400 de JC.

Nota: Todos os buffers e os suportes utilizados neste protocolo são listados na tabela 1. As informações do fornecedor para os reagentes são listadas na Tabela de materiais.
Dia 1/dia 1-2:
Nota: Para a cultura vegetativa, desenvolvem-se células para uma OD600 de 0,4 a 0,6 em meio preferencial. Para cultura meiótica, induzi células submeter-se a meiose, usando um método preferido (normalmente cultivo em uma OD600 de 1,85).
1. fixação e digestão da amostra
<ol><li>Conserte um total de ~3.5 OD600 de células em formol 3%.<ol>
<li>Para cultura vegetativa, adicione 5,52 mL da cultura a 480 µ l de formol de 37% em tubos cônicos de 15 mL.</li>
		<li>Para cultura meiótica, adicione 1840 µ l de cultura a 160 µ l de formol de 37% em 2 mL microcentrifuge tubos. Inverter ~ 5 vezes para misturar. Atenção: O formol é tóxico. Manuseie e elimine de acordo com regulamentos institucionais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque os tubos em um tambor de cilindro em temperatura ambiente por 20 min. Para amostras meióticas, após a fixação em temperatura ambiente por 20 min, continuam durante a noite de fixação no 4 ˚ c, rotação. Nota: A fixação durante a noite aumenta a reprodutibilidade e a qualidade dos dados smFISH obtidos para as amostras meióticas. Tempo de fixação deve ser otimizado.</li>
	<li>Enquanto as amostras estiver corrigindo, descongele 200mm vanadil Ribonucleoside complexos (VRC) em 65 ˚ c durante pelo menos 10 minutos.</li>
	<li>Preparar a mistura de mestre digestão em um tubo de 15 mL: para 1 amostra, misturar 425 µ l de tampão B com 40 µ l de 200mm VRC (aquecido a 65 ˚ c); para 5 amostras, misture 2125 µ l de tampão B com 200 µ l de 200mm VRC (aquecido a 65 ˚ c). Vórtice ~ 5 s para totalmente resuspenda o VRC antes de adicionar à mistura de mestre, que irá aparecer a luz verde acastanhado após adição da VRC. Nota: Adição de VRC durante a digestão melhora a consistência dos resultados smFISH, potencialmente, inibindo o contaminante de nuclease introduzido pela mistura de zymolyase, que é purificada do extrato bruto. A quantidade de VRC necessário a esta etapa deve ser otimizada.</li>
	<li>Para amostras vegetativas, centrifuga os tubos no ~ 1057 x g durante 3 minutos. Para amostras meióticas (após a fixação da noite), centrifugar a 21.000 x g, durante 1,5 min. decantar ou aspirar o sobrenadante para resíduos de formaldeído. Nota: Todas as etapas de centrifugação são realizadas à temperatura ambiente.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1,5 mL de frio Buffer B pipetando para cima e para baixo ou invertendo os tubos e passando rapidamente para misturar. Transferi amostras vegetativas para tubos de 2 mL após ressuspensão.</li>
	<li>Centrifugue a 21.000 x g 1,5 min. remover a maior parte do líquido por aspiração vácuo ou pipetando, deixando para trás ~ 100 µ l.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1,5 mL de frio B. Buffer</li>
	<li>Centrifugue a 21.000 x g 1,5 min. remover a maior parte do líquido por aspiração vácuo ou pipetando, deixando para trás ~ 100 µ l.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1,5 mL de frio Buffer B. Centrifugue a 21.000 x g 1,5 min. aspirado o líquido completamente por vácuo ou pipetando.</li>
	<li>Ressuspender as células em 425 µ l de mistura de mestre de digestão e brevemente vórtice para ressuspender. Adicione 5 µ l de zymolyase de 10 mg/mL de 100T a cada tubo. Nota: Vórtice a zymolyase toda vez antes de adicionar aos tubos. Zymolyase adicione a cada tubo individualmente, em vez de adicionar à mistura de mestre. Ambas as etapas ajudam a manter a consistência de digestão entre os tubos, porque zymolyase precipita-se rapidamente.</li>
	<li>Vórtice de 2-3 s para misturar. Coloque os tubos em um tambor de cilindro e digerir a 30 ˚ c durante 15-30 min. Para as células vegetativas e primeiros estágios meióticos, normalmente demora ~ 15 min, e para prófase meiótica e divisões meióticas, normalmente demora ~ 30 min. Nota: Verifique no microscópio cada 5 min depois de 15 min e parar a digestão quando aparecem de ~ 80% das células não-transparente e não-refrativa. De agora em diante, as células são muito frágeis. Lidar com células suavemente e evitar o uso de vácuo aspiração ou num Vortex.
</li>
	<li>Centrifuga os tubos no ~ 376 x g durante 3 min. Retire o líquido completamente pipetando.</li>
	<li>Resuspenda suavemente células com 1 mL de tampão B pipetando acima e para baixo 1 - 2 vezes para misturar.</li>
	<li>Centrifuga os tubos a ~ 376 x g durante 3 min. líquido de remover o tampão B pipetando. Delicadamente Ressuspender as células em 1 mL de etanol a 70% (diluído com água livre de RNase).</li>
	<li>Incube a temperatura ambiente para 3,5-4 horas.</li>
</ol>2. hibridação
<ol><li>Levar o formamide à temperatura (para alíquota de 50 mL, leva ~ 30 min em banho-maria). Nota: Não abra a garrafa de formamida até a garrafa atinja a temperatura ambiente para evitar a oxidação de formamida. Cuidado: Formamida é tóxica. Manuseie e elimine de acordo com regulamentos institucionais.</li>
	<li>Prepare o tampão de lavagem de formamida 10% em um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuga os tubos no ~ 376 x g durante 3 min. remover 500 µ l de etanol 70% por pipetagem. Suavemente a pipeta acima e para baixo para Ressuspender as células restantes e então transferir as células para tubos de baixa aderência. Nota: Utilizando tubos de baixa aderência grandemente reduz a perda de células durante lavagens subsequentes.</li>
	<li>Centrifuga os tubos novamente a ~ 376 x g durante 3 min. remover todo o etanol pipetando.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de tampão de lavagem de formamida 10% e suavemente pipeta acima e para baixo, 2 - 3 vezes para Ressuspender as células.</li>
	<li>Permitir que as células para sentar-se à temperatura ambiente por ~ 20 min enquanto se prepara a solução de hibridação. Para 1 amostra, misture 50 µ l de tampão de hibridização (sala temp.), 5 µ l de 200mm VRC (aquecido a 65 ˚ c) e 1 µ l de cada sonda (final de 200 nM). Para 5 amostras, misture 250 µ l de tampão de hibridização (sala temp.), 25 µ l de 200mm VRC (aquecido a 65 ˚ c) e 5 µ l de cada sonda (final de 200 nM).<ol>
<li>Descongele o tampão de hibridização (congelado a-20 ˚ c) à temperatura ambiente antes de abrir o tubo para evitar a oxidação de formamida.</li>
		<li>Depois de adicionar a 200mm VRC, vórtice para 5-10 s antes de adicionar as sondas, que são projetados adquiridos comercialmente e reconstituído de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Se duas sondas são incubadas co, adicione 1 µ l da 01:10 diluição do estoque a sonda #1, bem como 1 µ l da 01:10 diluição da unidade populacional de sonda #2, tornar-se uma diluição final de ~ 1: 500 para cada sonda. A concentração necessária para o melhor sinal-para-ruído precisa ser otimizado (ver discussão para detalhes).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar as amostras no ~ 376 x g durante 3 min. Retire o sobrenadante em resíduos perigosos pipetando.</li>
	<li>Adicione pelo menos 50 µ l de solução de hibridização de cada tubo. Agite os tubos para misturar.</li>
	<li>Incube a 30 ˚ c em um tambor de cilindro pelo menos 16 horas no escuro.</li>
</ol>Dia 2/dia 3
3. lavar e imagem
<ol><li>Levar o formamide à temperatura.</li>
	<li>Prepare-se 10% formamida o tampão de lavagem (FWB) em um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Retirar os tubos do tambor de rolo e coloque-os em uma caixa de folha-cobertas para proteger da luz.</li>
	<li>Centrifugar as amostras no ~ 376 x g durante 3 min. Retire o sobrenadante em resíduos perigosos pipetando.</li>
	<li>Resuspenda em 1 mL de 10% FWB suavemente pipetando acima e para baixo 2 - 3 vezes.</li>
	<li>Incube a 30 ˚ c por 30 min (não rotativos) na caixa de folha-cobertas.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a ~ 376 x g por 3 min. Retire o sobrenadante para resíduos perigosos por pipetagem e deixar ~ 50 µ l.</li>
	<li>Enquanto isso, preparar DAPI/FWB em um tubo cônico de 15 mL: para 1 amostra, misturar 1000 µ l de tampão de lavagem de formamida 10% com 1 µ l de 5mg/mL DAPI. Para 10 amostras, misture 10 mL de tampão de lavagem formamide 10% com 10 µ l de 5mg/mL DAPI. Resuspenda em 1 mL de DAPI/FWB suavemente pipetando acima e para baixo 2 - 3 vezes.</li>
	<li>Incube a 30 ˚ c por 30 min (não rotativos) na caixa de folha-cobertas.</li>
	<li>Descongele os reagentes antilixívia no gelo.</li>
	<li>Centrifugar as amostras no ~ 376 x g durante 3 min. Retire o sobrenadante completamente pipetando. Se necessário, centrifugue novamente para remover todo o sobrenadante.</li>
	<li>Para as amostras que não são imagem imediatamente, resuspenda o pellet em 50 µ l de Buffer GLOX sem enzimas. Pipeta acima e para baixo 3 - 4 vezes para misturar.<ol>
<li>Mantenha todas as amostras unimaged na caixa folha-cobertas no 4 ˚ c até que esteja pronto a imagem. Quando estiver pronto para a imagem, Centrifugar as amostras a ~ 376 x g por 2 min e retire o sobrenadante completamente por pipetagem. Resuspenda em GLOX com enzimas como abaixo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para amostras sendo fotografada imediatamente, adicionar 15 a 20 µ l de tampão GLOX com enzimas. Suavemente a pipeta para cima e para baixo se misturam. Nota: O volume adicionado pode variar dependendo do tamanho do centrifugado. Recomendamos que resuspending a pelota em 15 µ l de tampão GLOX com enzimas e verificar a densidade de células em microscópio. Se são demasiado densas (células aglutinação uns sobre os outros), adiciona extra reserva GLOX com enzimas. Se as células são muito escassas, centrifugar a amostra e remover ~ 5 µ l de tampão.</li>
	<li>Pipetar 5 µ l para uma lamela (18 x 18, n. º 1) e colocar a lamela em um slide.</li>
	<li>Coloca uma limpeza de laboratório em cima do slide onde a lamela é colocada. Pressione suavemente sobre a limpeza de laboratório para definir o slide (deve ver líquido saindo de todas as quatro bordas da lamela).</li>
	<li>Transferi o slide para o quarto de microscópio em uma caixa coberta por papel alumínio.</li>
	<li>Imagem usando um microscópio de fluorescência de campo amplo com alta ampliação (60-100x) e alta abertura numérica. Observação: Para coletar o número máximo de fótons emitidos por sondas smFISH, microscópios confocal não são recomendados, como eles limitam significativamente a quantidade de luz a serem coletados. Aqui, os dados foram coletados em um microscópio equipado com 100 X, objectivo de at 1.4, usando filtros CY5 (EX632/22, EM679/34) fotografada em 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; e DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, T. 32-50% Uma imagem brilhante-campo referência também deve ser adquirida. Adquirir 15-25 fatias com um tamanho de passo de 0,1-0,2 µm, de inteiramente abaixo o foco do campo de visão inteiramente acima, a fim de garantir que todos os pontos do RNA são contabilizados.</li>
</ol>4. análise de imagens
<ol><li>Analise os dados de smFISH com ferramentas de análise de smFISH publicado como peixe-quant17 e plateia2ou com programas feitos sob medidos, conforme as suas necessidades exatas do experimento. Nota: Um pipeline de boa análise deve permitir que os usuários determinar um limite para separar os verdadeiros pontos de RNA do fundo e estatísticas, tais como as coordenadas X, Y e Z (opcionais) e a intensidade de cada ponto, o número de pontos em cada célula de saída e possivelmente montagem parâmetros como uma maneira de filtrar as detecções falsas.</li>
</ol>

<ol><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li>
<li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+in+numbers%3A+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li>
<li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li>
<li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506(2011).</li>
<li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309(2006).</li>
<li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li>
<li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li>
<li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li>
<li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li>
<li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li>
<li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORSEN%2C+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements%3A+mRNA-mitochondria+distance%2C+from+single-cell+to+population+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417(2017).</li>
<li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH-quant%3A+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li>
<li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li>
<li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li>
<li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li>
<li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007(2015).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li>
<li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

O protocolo aqui apresentado é derivado de outros publicados smFISH protocolos2,3,21,22,23e é especificamente otimizado para o fundo de cepa de levedura SK1. Os parâmetros otimizados incluíam o número do celular, duração de fixação, velocidade de centrifugação e duração, duração da digestão, tampão de digestão, concentração de sonda e tampão de hibridização. Outros parâmetros como temperatura de hibridização e duração não foram otimizados. Nesta seção, nós compartilhamos algumas notas que ajudam a se adaptar a este protocolo para qualquer fundo de cepa de levedura e as condições de crescimento de interesse.
Parede celular de leveduras brotamento é um grande desafio contra a obtenção de imagens de alta qualidade smFISH em brotamento fermento porque a parede celular impede a penetração da sonda. Digestão incompleta da parede celular por zymolyase leva a ineficiente hibridização de sondas e alta variabilidade de célula para célula no sinal. No entanto, digestão excesso pode tornar as células muito frágil, levando a significativa perda de células durante as etapas de lavagem e estourando durante a preparação de slides para a imagem latente da pilha. Assim, otimizando a duração da digestão é crucial. Recomendamos a realização de um experimento piloto smFISH digerindo a mesma amostra para diferentes quantidades de tempo. No nosso caso, obtivemos os dados smFISH melhores se nós paramos a digestão quando tornou-se ~ 80% das células não-refrativa. Normalmente, para a mesma condição de crescimento diferentes cepas mutantes genéticas podem ser digeridas com sincronismo semelhante. No entanto, a duração da digestão diferente quando comparada entre as condições de crescimento diferentes e diferentes estágios da meiose em leveduras brotamento. Uma vez que o calendário é determinado, a qualidade do smFISH é reproduzível. Nota que para cepas mutantes de síntese da parede de celular com defeito e/ou composição, a digestão pode ser concluída em menos de 15 min. utilização de diferentes lotes de zymolyase também ligeiramente pode mudar o tempo de digestão.
Concentração de sonda ideal é necessária para alcançar uma alta relação sinal-ruído. Projetamos e comprou nossas sondas smFISH comercialmente. Boas sondas (geralmente 20-mers) devem ter uma porcentagem de GC variando de 35% a 45%, um espaçamento mínimo de 2 pares de base entre as sondas e baixa reatividade cruzada. Usamos um designer sonda baseado na web do fabricante para gerar uma lista de pontas de prova, e se houvesse suficiente sondas para escolher, nós usaríamos o algoritmo de explosão no banco de dados do genoma de Saccharomyces para eliminar as sondas com mais de 17 pares de base sobrepostos com outras regiões genômicas. Escolhemos a mais fotoestável tintura fluorescente (CAL Fluor 590) para o conjunto de sonda anneals para a região única de NDC80luti (CF. 590), porque neste conjunto, o número de testes que satisfeitos todos os critérios acima (20 testes) foi menor do que o número mínimo recomendado pelo fabricante (~ 25 sondas). Após reconstituir a solução de sonda, seguindo as instruções do fabricante, nós fizemos um 01:10 diluição da solução estoque e armazenados a solução diluída em alíquotas de 5 µ l em-20 ˚ c. Cada alíquota foi usada apenas uma vez. Para a otimização, um deve fazer serial diluições das 01:10 diluído solução e teste a concentração que produz a melhor relação sinal-ruído. Recomendamos fazer uma série de diluição de 1: 250, 1: 500, 1: 1000 e 1: 2000 do estoque original. No nosso caso, um fator de diluição 1: 500 resultou na melhor relação sinal-ruído, para ambos os 590 CF e 670 Q conjuntos de sonda.
Tempo de fixação ideal também é fundamental para o sucesso smFISH em leveduras brotamento. Temos encontrado que a fixação da noite no 4 ˚ c, ao invés de fixação à temperatura ambiente por 20 min, melhorou significativamente a consistência e a qualidade dos resultados smFISH para amostras meióticas. Embora nós não testamos como durante a noite fixação pode impactar amostras vegetativas, fixação à temperatura funcionou bem para esta condição de crescimento. Assim, para otimizar o protocolo smFISH para novas cepas ou condições de crescimento, recomendamos começar com tempo curto fixação à temperatura ambiente e aumentar o tempo de fixação se alta variabilidade do sinal é encontrada.
Em comparação com outros protocolos publicados3,22,23, nosso protocolo usa o inibidor de RNase VRC durante a digestão e uma maior concentração de VRC durante a hibridação. Adição de VRC nessas duas etapas melhorou a consistência dos resultados smFISH, possivelmente por melhor preservar as moléculas do RNA contra a atividade de nuclease, que podem ser introduzidos pela mistura de zymolyase (a enzima é purificada a partir de extratos brutos e pode conter RNase contaminantes). Assim, nós recomendamos usar a quantidade de VRC, conforme listado no nosso protocolo ou mesmo umas concentrações mais elevadas de VRC para otimização.
Uma parcela significativa das células pode ser perdida durante as etapas de lavagem em tampão B e o tampão de lavagem de formamida. Para reduzir a perda de células, pode-se aumentar a velocidade de centrifugação. No nosso caso, usando uma velocidade alta (21.000 x g) para nossas amostras de pelotas durante o Buffer B lava perda celular significativamente reduzida. No entanto, células tornam-se muito frágil após a digestão de zymolyase, portanto não é recomendado alterar a velocidade de centrifugação. Em vez disso, nós sugerimos o uso dos tubos de baixa aderência na Scientific EUA, que ajudam muito as células de pelotas durante as lavagens no tampão de lavagem de formamida. No geral, nosso protocolo pode gerar consistentemente uma monocamada de células densas o bastante para a imagem latente eficiente. Normalmente, 7 campos de vista deve render > 130 células apropriadas para quantificação.
Por último, é importante determinar os parâmetros ideais para e as saídas necessárias de análise de imagem. Para detectar manchas de smFISH, programas de análise publicada comumente filtram as imagens raw usando o kernel gaussiano para remover o sinal de fundo e perguntar aos usuários para determinar a relação sinal-ruído para usar para cada conjunto de imagens de2,17. Infelizmente, não há atualmente um único padrão pelo qual são determinados os parâmetros adequados, e então alguns testes empíricos dessas diferentes configurações é necessário. Para definir os parâmetros necessários para cada um destes passos, um precisa iterativamente diferentes conjuntos de parâmetros de entrada e verificar o quanto os resultados obtidos de cada conjunto corresponde da contagem manual em algumas células representativas. Uma vez que encontra-se um conjunto de parâmetros, pode ser usada para a maioria das imagens obtidas apesar das condições de crescimento diferente e origens genéticas.
Além disso, um pode testar se a projeção de intensidade máxima das imagens smFISH pode ser realizada antes da quantificação22. Este passo simplifica o algoritmo de detecção local e reduz significativamente o tempo de geração de imagens, embora à custa de algumas informações potencialmente úteis sobre pontos individuais, tais como sua localização subcellular. No nosso caso, o número de moléculas de mRNA produzido pelo gene NDC80 foi baixo o suficiente para que as manchas eram bem separadas após esse processamento (não é incomum para as transcrições em brotamento fermento3,7). Em casos onde o colocalization análise é crítico, o pipeline de análise precisa determinar a localização de cada ponto de smFISH em cada canal para avaliar colocalization. Dependendo as perguntas específicas sendo perguntado, outras informações como a intensidade de cada ponto também podem precisar de ser extraído o pipeline para posterior análise. Otimizando a chave entra o protocolo e o pipeline de análise de imagem é crucial na obtenção de alta qualidade de dados smFISH para estudar a questão de interesse.

Dinâmica regulação da expressão genética impulsiona o desenvolvimento de um organismo, bem como a sua resposta ao estresse ambiental, infecção e alterações no metabolismo. Estudos que se concentram no Regulamento transcriptional dependem de tecnologias que medem a abundância de RNA. Um tal método, denominado única molécula fluorescência em situ da hibridação (smFISH), é utilizado para detecção de moléculas individuais de RNA em células únicas1,2. Esse método permite que a medição da variabilidade na expressão gênica celular para celular e determinação da localização intracelular de RNA.
A técnica mais comumente usados smFISH, a detecção de uma molécula de RNA individual exige vários curtas sondas de DNA (frequentemente ~ 48 20-mer sondas) que são complementares ao RNA alvo e são conjugadas para a mesma tintura fluorescente. Ligação de uma única sonda fluorescente resulta num sinal fraco, mas o sinal do conjunto de todas as sondas é robusto. Esse recurso melhora a relação sinal-ruído porque mesmo que um único teste pode apresentar vinculação fora do alvo, tal sinal deverá ser muito fraco em relação ao que o destino de molécula de RNA3. No erro de deteção, o número de moléculas de RNA pode ser contado e comparado através de várias condições de crescimento e entre diferentes mutantes.
Desde seu primeiro desenvolvimento, foi adaptada para estudar vários aspectos da expressão gene4, tais como a transcrição alongamento1,2, emenda5,6, transcriptional estourando7 smFISH , 8 , 9, expressão alélica intracelular de11,10,12e RNA localização13,14,15. Recentemente, nós usamos este método para estudar a expressão de duas isoformas de transcrição do gene da mesma, em que a isoforma de transcrição curta (NDC80ORF) tem sua sequência toda compartilhada com o isoform longo (NDC80luti )16. Para identificar com exclusividade as duas isoformas de mRNA, usamos dois conjuntos de sonda: um conjunto é específico para a sequência única de NDC80luti, e o outro conjunto, conjugado com outra tintura fluorescente, vincula-se à região comum das duas isoformas. O NDC80luti RNA é identificado como um ponto colocalized com ambos os sinais fluorescentes, Considerando que o NDC80ORF RNA é aquele que contém apenas o sinal do conjunto de sonda comum. Desde o número da NDC80ORF transcrições é calculado por um método de "subtração", alta eficiência de hibridização da sonda e uma alta relação sinal-ruído são necessários com confiança identificar pontos smFISH e reduzir o erro propagação.
Este artigo descreve um protocolo otimizado para executar smFISH no brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. No presente protocolo, o número do celular, tempo de fixação, tempo de digestão, tampão de digestão, sonda concentração e hibridação buffer usado para os experimentos de smFISH foram otimizados para o SK1 estirpe fundo de S. cerevisiae em fase vegetativo crescimento ou meiose. No entanto, constatamos também neste manuscrito: (1) o método para verificar a qualidade dos dados de smFISH após a aquisição da imagem e (2) os passos no protocolo que podem exigir a otimização adicional para a tensão de diferentes origens e condições de crescimento.

<table><tbody><tr><td>BSA, livre de RNase (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Armazenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>Loja em 4 &deg; C para curto prazo. Vórtice antes de usar.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>Loja em -20 &deg; C após reconstituição em água. Proteja da luz.</td></tr><tr><td>50% Dextran Sulfato</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>Armazene em temperatura ambiente. Líquido muito viscoso. Manuseie com paciência.</td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Armazenar a -20 &graus; C em alíquotas após reconstituição em água.</td></tr><tr><td>Etanol (100%, 200 provas)</td> <td>vários</td><td></td><td>inflamáveis.</td></tr><tr><td>37% de formaldeído</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Armazene em temperatura ambiente. Tóxico. Use e descarte com cuidado.</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Armazene a 4 ° C. Abra depois que a temperatura se equilibrar à temperatura ambiente para evitar a oxidação. Tóxico. Use e descarte com cuidado.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>vários</td><td></td><td>Armazenar em 4 &deg; C após dissolução em água livre de nuclease.</td></tr><tr><td>Glicose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Armazene a -20 &deg; C em alíquotas após reconstituição em NaOAc 50 mM, pH 5.</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Armazenar em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio (monobásico e dibásico)</td><td>vários</td><td></td><td>Conservar à temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Biblioteca de sondas, diluída em TE, pH 8,0&nbsp;</td>Loja de tecnologias <td></td><td>de pesquisa biológica</td><td>a -20 &deg; C em alíquotas (5 &micro; L) após reconstituição em TE pH 8,0, seguindo as instruções do fabricante. Proteger da luz.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>vários</td><td></td><td>Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>TE, pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Armazenar em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>Store em -20 &deg; C em alíquotas.</td></tr><tr><td>200 mM Complexo de ribonucleosídeo vanadil (VRC)</td> <td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Armazenar a -20 &graus; C em alíquotas após reconstituição, seguindo as instruções do fabricante.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>Store a -20 &deg; C em alíquotas após reconstituição em água.</td></tr><tr><td>Tubos de baixa adesão</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Armazene em temperatura ambiente.</td></tr></tbody></table>

Única molécula fluorescência in situ hybridization (smfish) análise em budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Única molécula fluorescência situ hibridação in (smFISH) é uma técnica poderosa para estudar a expressão gênica em células únicas devido à sua capacidade de detectar e contar as moléculas de RNA individuais. Complementares aos métodos baseados em sequenciamento profundos, smFISH fornece informações sobre a variação de célula para célula em abundância de transcrição e a Localização subcellular de um determinado RNA. Recentemente, temos usado smFISH para estudar a expressão do gene NDC80 durante a meiose em leveduras brotamento, na qual dois transcrição isoformas existem e a isoforma de transcrição curta tem sua sequência toda compartilhada com o isoform longo. Para identificar com confiança cada isoforma de transcrição, nós otimizadas conhecidos smFISH protocolos e obteve alta consistência e qualidade dos dados de smFISH para as amostras adquiridas durante a brotação fermento meiose. Aqui, descrevemos este protocolo otimizado, os critérios que usamos para determinar se é obtida a alta qualidade dos dados de smFISH e algumas dicas para a aplicação do presente protocolo em outras cepas de leveduras e condições de crescimento.

Esta molécula fluorescência em situ da hibridação protocolo é otimizado para quantificar o número de moléculas de RNA em leveduras brotamento durante a meiose e crescimento vegetativo.

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

O objetivo geral desta hibridização in situ de RNA de molécula única otimizada, ou smFISH, é detectar e quantificar moléculas individuais de RNA por célula durante o crescimento vegetativo e a meiose da levedura em brotamento. Este método revela a variabilidade célula a célula na expressão gênica na localização do RNA subcelular e, portanto, é uma técnica poderosa para estudar a regulação gênica. Além das informações exclusivas que podem ser reveladas pelo smFISH, a principal vantagem da técnica é que, uma vez otimizada, ela é robusta e altamente reprodutível.Uma cultura meiótica será usada para a demonstração deste protocolo. Para fixar a cultura em 3% de formaldeído, adicione 1840 microlitros da cultura a 160 microlitros de 37% de formaldeído em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Inverta cerca de cinco vezes para misturar.Coloque o tubo em um tambor de rolos em temperatura ambiente por 20 minutos. Após 20 minutos, continue fixando a quatro graus Celsius com rotação durante a noite. No dia seguinte, prepare-se para a digestão descongelando primeiro complexos de ribonucleosídeos vanadilares de 200 milimolares, ou VRC, a 65 graus Celsius por pelo menos 10 minutos.Para preparar a mistura mestre de digestão, primeiro pipete 2125 microlitros de tampão B em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, faça um vórtice do VRC quente por cinco segundos para ressuspendê-lo totalmente e adicionar 200 microlitros de VRC ao tubo de 15 mililitros. A mistura deve aparecer na cor verde acastanhada clara.Centrifugar a amostra meiótica a 21 000 x g durante um minuto e meio à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante com cuidado, colocando a ponta de vácuo no lado oposto do pellet para evitar mexer no pellet. Ressuspenda as células em um mililitro e meio de tampão frio B pipetando para cima e para baixo para misturar.Centrifugar a 21 000 x g durante um minuto e meio. Remova a maior parte do líquido por aspiração a vácuo, deixando para trás cerca de 100 microlitros. Ressuspenda as células em um mililitro e meio de tampão frio B. Centrifugue as amostras, remova o líquido e ressuspenda as células em um mililitro e meio de tampão frio B novamente.Centrifugar a 21 000 x g durante um minuto e meio. Aspirar o líquido completamente por pipetagem. Ressuspenda as células em 425 microlitros de mistura mestre de digestão e vórtice brevemente.Adicione cinco microlitros de zimoliase ao tubo e vórtice por dois a três segundos para misturar. Coloque o tubo em um tambor de rolos e digerir a 30 graus Celsius por 15 a 30 minutos. Após 15 minutos, verifique as células por microscopia a cada cinco minutos e interrompa a digestão quando cerca de 80% das células parecerem não transparentes e não refrativas.Centrifugar o tubo a 376 x g durante três minutos. Remova o sobrenadante completamente. Ressuspenda suavemente as células com um mililitro de tampão B, pipetando para cima e para baixo uma a duas vezes para misturar.Centrifugue o tubo e remova o tampão. Ressuspenda suavemente as células em um mililitro de etanol a 70% e incube em temperatura ambiente por três horas e meia a quatro horas. Para iniciar o procedimento de hibridização, centrifugue o tubo de células a 376 x g por três minutos.Remova 500 microlitros do etanol 70% do tubo. Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender as células restantes e transfira as células para um tubo de baixa adesão. A transferência da amostra para um tubo de baixa adesão é fundamental para evitar o excesso de perda de células durante as lavagens subsequentes de formamida.Centrifugue o tubo de baixa aderência e remova todo o etanol. Adicione um mililitro de tampão de lavagem de 10% de formamida ao tubo e pipete suavemente para cima e para baixo duas a três vezes para ressuspender as células. Deixe as células endurecerem à temperatura ambiente por cerca de 20 minutos enquanto prepara as soluções de hibridização, conforme descrito no protocolo de texto.Centrifugar a amostra e eliminar o sobrenadante para os resíduos perigosos. Adicione pelo menos 50 microlitros de cada solução de hibridização ao tubo e agite o tubo para misturar. Incube a 30 graus Celsius em um tambor de rolo por pelo menos 16 horas no escuro.Quando a hibridização estiver completa, coloque o tubo de células em uma caixa coberta com papel alumínio para proteger da luz. Centrifugar a amostra a 376 x g durante três minutos. Remover o sobrenadante para os resíduos perigosos por pipetagem.Ressuspenda a amostra em um mililitro de tampão de lavagem de formamida a 10% pipetando suavemente para cima e para baixo duas a três vezes. Coloque o tubo de células de volta em uma caixa coberta com papel alumínio para proteger da luz e incube a 30 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, centrifugue a amostra.Remova o sobrenadante para resíduos perigosos pipetando, deixando cerca de 50 microlitros. Ressuspenda a amostra em um mililitro de solução DAPI pipetando suavemente para cima e para baixo duas a três vezes. Mais uma vez, coloque o tubo de células na caixa coberta com papel alumínio e incube a 30 graus Celsius por 30 minutos.Centrifugar a amostra e remover completamente o sobrenadante por pipetagem. Para amostras que não serão visualizadas imediatamente, ressuspenda o pellet em 50 microlitros de tampão GLOX sem enzimas. Pipete para cima e para baixo três a quatro vezes para misturar.Mantenha na caixa coberta com papel alumínio a quatro graus Celsius até que esteja pronto para a imagem. Para amostras que estão sendo fotografadas imediatamente, adicione 15 a 20 microlitros de tampão GLOX com enzimas. Pipete cinco microlitros em uma lamínula e coloque a lamínula em uma lâmina.Coloque um lenço de laboratório em cima da lâmina onde a lamínula é colocada. Pressione suavemente o lenço para definir o slide. Coloque a lâmina em uma caixa coberta com papel alumínio para transferência para a sala do microscópio.Este protocolo foi usado para examinar a expressão do gene NDC80, que expressa duas isoformas de mRNA. A isoforma de transcrito longo não decodificado tem uma extensão de 400 pares de bases e cinco primos em comparação com a isoforma curta. Dois conjuntos de sondas foram projetados.O conjunto CF 590 se liga à região única de cinco primos da isoforma longa, e o conjunto Q 670 se liga à região comum de ambas as isoformas. Sob condições otimizadas, pontos distintos de smFISH foram claramente identificados para ambos os conjuntos de sondas. Os dois conjuntos de sondas foram usados para estudar a expressão de NDC80 durante o crescimento vegetativo e a meiose.Em células vegetativas, foi detectado um sinal robusto do conjunto de sondas Q 670, mas não do conjunto de sondas CF 590. Em contraste, o sinal robusto de ambos os conjuntos de sondas foi detectado na prófase meiótica, e a maioria dos pontos tinha sinal co-localizado. A análise de Northern blot confirmou que a isoforma longa foi expressa especificamente na meiose.As células vegetativas apresentaram uma mediana de cinco transcritos de isoformas curtas por célula, enquanto nas células de prófase meiótica, a mediana caiu significativamente para quatro transcritos por célula. Na prófase meiótica, o número médio de transcritos de isoformas longas por célula foi de 21 e 100% das células expressaram o transcrito. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 72 horas se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante primeiro otimizar a duração da digestão e a concentração de sondas smFISH necessárias para obter a relação sinal-ruído ideal. Além disso, lembre-se de adicionar VRC durante a digestão e hibridização durante a noite para evitar a atividade da nuclease. Com esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem a regulação dinâmica de genes e a localização de RNA subcelular.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar RNA molecular único FISH na meiose de levedura em brotamento.

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