Name: Identificação de Optogenetics de um tipo Neuronal com um Optrode de vidro em ratos acordados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda a gravar unidades únicas em camundongos acordados usando um optrode de vidro personalizado. Esta técnica de optogenética permite identificar neurônios GABAérgicos e glutamatérgicos com materiais acessíveis.

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Os autores foram apoiados pela sociedade de Japão para a promoção da ciência KAKENHI Grant JP16K11200 e 17H 02223 e o subsídio para a pesquisa da universidade médica S2016 de Kanazawa-8 e C2017-3. Yuhichi Kuda Agradecemos seu apoio em tirar as fotos.

Todos os procedimentos são feitos em conformidade com os princípios orientadores da sociedade Physiological do Japão e com a aprovação do Animal conta Comissão de Kanazawa médica Universidade.
1. construção do titular do Optrode de vidro
Nota: Para construir um suporte de optrode de vidro, um porta-eletrodo comercial é utilizado (figura 1A).
<ol><li>Suavemente retire o tubo de aço para controle de pressão do cilindro do titular.</li>
	<li>Por perfuração, alargar o buraco do lado do assento pin no cano do titular. Faça o furo de 3 mm de diâmetro e 12 mm em profundidade.</li>
	<li>Colocar um tubo de aço inoxidável (3 mm de diâmetro, de espessura 0,5 mm e 8 mm de comprimento; Figura 1A 2) no buraco.</li>
	<li>Inserir uma cerâmica de dividir o acasalamento manga para virolas de ⌀2.5 mm (figura 1A1) no orifício.</li>
	<li>Consertar o cano do porta eletrodo para uma ranhura em forma de L com adesivo epóxi.</li>
	<li>Faça os furos (3 mm de diâmetro) na ranhura e anexá-lo para um manipulador com parafusos.</li>
</ol>2. cabeça pós instalação
<ol><li>Prepare um Custom-Built post cabeça feito de um espaçador de placa de circuito. Fazer o espaçador de placa de circuito colunar em forma cuboidal com uma fresa e corte em 2 lugares de cabeça com uma serra (figura 1B). Achate a parte inferior do post principal com uma fresa.</li>
	<li>Prepare o animal geneticamente modificado em que um opsin sensível à luz é expresso em um tipo de neurônio específico para o estudo. Neste trabalho, é usado o rato transgénico (ratos VGAT-ChR2) em que os neurônios inibitórios expressam channelrhodopsin-2 (ChR2)11 .</li>
	<li>Anestesia o animal com uma mistura de 0,3 mg/kg de medetomidina, 4,0 mg/kg de midazolam e 5,0 mg/kg de butorfanol pela administração intraperitoneal. Para confirmar que o animal é totalmente anestesiado, teste suas reações para beliscar da cauda.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma armação estereotáxica em uma almofada de aquecimento. Limpo, o aquecimento e a armação estereotáxica almofada antecipadamente com álcool a 70%. Coloque os dentes no buraco da barra dentada e aperte levemente o grampo do nariz. Corrigi a ambos os lados da cabeça usando barras de orelha. Quando a cabeça é fixada corretamente pelas barras de orelha, aperte o grampo do nariz. Aplica uma pomada oftálmica nos olhos.</li>
	<li>Raspar a pele da cabeça com uma tesoura pequena e limpar o couro cabeludo com um cotonete de gluconato de clorexidina. Antes da cirurgia, esterilize todos que os instrumentais cirúrgicos e uma cabeça de postar com uma autoclave (121 ° C, 15 min).</li>
	<li>Corte o couro cabeludo ao longo da linha mediana com uma tesoura e empurrá-lo de lado. Fazer a incisão na parte de trás da cabeça para os olhos (cerca de 20 mm). Remover o periósteo com um cotonete embebido em álcool a 70% e secar o crânio.</li>
	<li>Anexe o posto de cabeça para o manipulador. Posicione o post cabeça plana no crânio em torno do bregma usando o manipulador.</li>
	<li>Misture o monômero (4 gotas), catalisador (1 gota) e polímero (1 colher pequena) de cimento dental em um pequeno prato que é tranquilo na geladeira com antecedência. Ponha o cimento dental (abaixo de 1 g) frontal e parietal osso do crânio para fixar a coifa cabeça no crânio.</li>
	<li>Depois que o cimento dental torna-se difícil, retire o mouse da armação estereotáxica. Coloque uma pomada antibiótica na pele exposta. Injete o antagonista de medetomidina (0,3 mg/kg) e os antibióticos (oxitetraciclina, 20 mg/kg). Coloque e monitorar o mouse sobre a almofada do calor em uma gaiola até que ele acorda e devolvê-lo para uma gaiola de habitação.</li>
	<li>Casa do animal em uma gaiola de habitação individual com algum dispositivo de enriquecimento. Mude o papel de animal fundamento diariamente para manter a gaiola limpa e prevenir a infecção. Monitore cuidadosamente se o animal mostra qualquer sinal de desconforto. Aplicam-se lidocaína a ferida se houver suspeita de qualquer dor. Administrar meloxicam ou carprofeno uma vez a cada 24h por 48h após ambos a cabeça pós instalação e craniotomia cirurgias. A lidocaína local pode ser dado além disso se o AINE não é adequada.
</li>
</ol>3. a aclimatação
<ol><li>(No mínimo) dois dias após a recuperação da anestesia, adapte os animais ao estado cabeça-fixo na câmara de gravação. Realize as sessões de aclimatação para pelo menos 5 dias.</li>
	<li>Durante as sessões de aclimatação, coloca o animal na câmara de gravação com o post cabeça fixado para uma pinça custom-built. Durante a sessão, a fim de limitar o movimento, a tampa do corpo com um tubo de resina feito por metade (Figura 1), feita usando uma impressora 3D. Nota: No dia 1, a sessão de aclimatação deve ser longo 5 min. Ele é então aumentado diariamente para 10, 20, 40 e 60 min para dias 2, 3, 4 e 5, respectivamente.</li>
	<li>No final de cada sessão, o animal de dar uma recompensa de comida. Se o animal se esforça continuamente durante a aclimatação, interromper a sessão.</li>
</ol>4. craniotomia
Nota: Após a aclimatação, uma craniotomia é feita sobre a região do cérebro para a gravação. A craniotomia é realizada no quadro estereotáxicos sob anestesia, como com a cabeça pós instalação. O procedimento de pós operação é o mesmo como a cabeça pós instalação.
<ol><li>Antes a craniotomia, limpe o crânio com um cotonete de algodão com clorexidina gluconato e 70% de álcool.</li>
	<li>Raspe cuidadosamente o crânio sobre o local de gravação com uma broca de dentista. Quando o osso torna-se bastante fino, cortar com a ponta do bisturi e removê-lo.</li>
	<li>Colocar cimento dental em torno da região exposta a fim de reforçar o crânio.</li>
	<li>Cobrir a área do cérebro exposto com adesivo de silicone após o cimento dental torna-se difícil. O procedimento pós-operatório é conforme descrito na etapa 2.8.</li>
</ol>5. eletrofisiológica gravação
<ol><li>Permitir que o animal se recuperar pelo menos 1 dia após a craniotomia antes de executar a gravação eletrofisiológica. Coloque o animal na câmara de gravação da mesma forma que foi feito durante as sessões de aclimatação, quando inicia a gravação.</li>
	<li>Fazer vidro pipetas de capilares de vidro de borosilicato (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm, 90,0 mm de comprimento) apontou um extrator de eletrodo. Seu diâmetro de ponta é de 2 – 3 µm, e sua resistência é 4-6 MΩ quando eles estão cheios de 10mm PBS. O comprimento do eletrodo é de 40 – 50 mm. Em algumas gravações, 2% neurobiotin é adicionado para o PBS de 10 mM.</li>
	<li>Anexe a pipeta de vidro preenchida ao titular do optrode sob medida.</li>
	<li>Coloque o fio de prata Ag-Cl revestido (0,2 mm de diâmetro) dentro da pipeta de vidro. Ligue o fio de prata a um pino através de um fio elétrico revestido fino. Conecte o pino para o headstage do amplificador de gravação.</li>
	<li>Conecte o cabo de remendo de fibra óptica (núcleo = 960 µm, revestimento = 1.000 µm, at = 0,63) com uma virola de zircônia (OD = 2,5 mm) para a divisão de acasalamento manga no porta-optrode. Empurre o cabo de remendo na manga até a ponta da virola entra em contato com as costas da pipeta vidro. O cabo de remendo oferece a luz (comprimento de onda = 465 nm) de LED. O diodo emissor de luz é controlada por um controlador de LED de canal único.</li>
	<li>Remova o adesivo de silicone sobre a craniotomia. Colocar soro aquecido (38 ° C) sobre a superfície do cérebro periodicamente para evitar que a superfície do cérebro de secagem durante a sessão de gravação. Se necessário, remova a dura-máter com Pinças afiadas.</li>
	<li>Introduza o eléctrodo de vidro o tecido do cérebro com um manipulador. Monitore a resistência do eletrodo, quando ele é inserido. Substitua o eletrodo quando a resistência é menor do que o esperado porque a ponta do eletrodo pode ser danificada. Na profundidade de interesse, Pesquisar e isolar os picos da única unidade ajustando a profundidade em passos de 2 a 5 µm.</li>
	<li>Depois que a unidade está isolada, entregar o diodo emissor de luz e observar a resposta aos estímulos leves.</li>
	<li>Grave as atividades neurais após a identificação dos tipos de célula. Realize as gravações de 2 – 3 h. Se a gravação é feita em dias consecutivos (máxima de 2 dias), cubra a craniotomia com adesivo de silicone. Quando a gravação estiver concluída, e o animal é sacrificado, recuperar o post cabeça e colocá-lo em acetona para lavar e reutilizá-lo.</li>
</ol>

<ol><li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons%3A+triumphs+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+mouse+inferior+colliculus+share+similar+response+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757(2016).</li>
<li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-assisted+patching%3A+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099(2009).</li>
<li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit%3A+effects+of+sodium+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).</li>
<li>Duque, D., Malmierca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+adaptation+in+the+inferior+colliculus+of+the+mouse%3A+anesthesia+and+spontaneous+activity+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects.</a> Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).</li>
<li>Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+predictable+versus+random+temporally+complex+stimuli+from+single+units+in+auditory+thalamus%3A+impact+of+aging+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia.</a> Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li>
<li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li>
<li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li>
<li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li>
<li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li>
<li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Optogenetics tornou-se uma ferramenta poderosa em neurociência. Ele tem sido utilizado para identificar neurônio específico tipos na vivo , bem como manipular as atividades das vias neuronais específicas. O esclarecimento da actividade neural de diferentes tipos neuronais promove a compreensão do mecanismo dos circuitos neurais. Aqui, temos demonstrado um método para fornecer a luz para o local de gravação através de um eléctrodo de vidro na IC de ratos de VGAT-ChR2 acordados.
Existem...

O sistema nervoso central consiste de vários tipos de neurônios, que têm funções diferentes. Como esses diferentes tipos de neurônios funcionam dentro do circuito neural é uma das principais preocupações da neurociência. No entanto, em muitas regiões do cérebro, tem sido impossível distinguir os tipos neuronais em gravações na vivo de actividades eléctricas, porque não há nenhuma diferença clara no sinal elétrico spike em si, com algumas exceções. Avanços recentes em optogenetics fizeram uma descoberta1,2. Usando animais transgénicos na qual opsin sensíveis à luz (por exemplo, channelrhodopsin-2) é expressa em tipos específicos de neurônios, tornou-se possível distinguir os tipos neuronais eficientemente na vivo gravações3, 4,5,6. Nestes animais, os neurônios com opsin sensíveis à luz estão animados, dando estímulos de luz durante as gravações elétricas, mas outros neurônios não são. Os neurônios opsin-positivo, portanto, facilmente são distintos dos outros tipos de neurônio por suas respostas à luz.
Em experimentos de optogenetics, é essencial para fornecer a luz para o local de gravação. Como um método não-invasivo, a luz é muitas vezes dirigida da superfície do cérebro. No entanto, porque a força da luz reduz conforme passa pelo tecido cerebral, é difícil estimular as regiões cerebrais profundas da superfície do cérebro. Especialmente, é difícil para a luz de estimulação atingir as regiões profundas do cérebro quando a transparência óptica da superfície do cérebro é baixa, como é frequentemente o caso com gravações de animais acordados. Eletrofisiológicos experimentos frequentemente foram realizados em animais anestesiados porque o movimento do corpo provoca ruído nas gravações. Como está bem documentado, no entanto, anestesia é conhecida para alterar as respostas neurais7,8,9,10. Assim, é necessário utilizar animais acordados para estudar as respostas neurais, sem os efeitos artificiais da anestesia. Ao contrário das experiências com animais anestesiados, as gravações eletrofisiológicas são executadas após a recuperação da cirurgia nos experimentos com animais acordados. Durante o intervalo entre a cirurgia e as gravações, o exsudato tecido frequentemente se acumula na superfície do cérebro e faz com que a transparência óptica da superfície do cérebro baixa.
Aqui, descrevemos um método para gravar gravações unitárias de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida. Neste método, a luz é fornecida através do eléctrodo de vidro de gravação é possível estimular confiantemente o neurônio gravado com luz em regiões profundas do cérebro. Este sistema de optrode sob medida consiste de materiais acessíveis e baratos e é fácil de montar.

<table><tbody><tr><td>Suporte de eletrodo</td><td>Dispositivo molecular</td><td>1-HL-U</td><td>suporte de pipeta para amplificador de microeletrodo</td></tr><tr><td>Luva de acoplamento dividida em cerâmica</td><td>Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2,5 mm ponteira</td></tr><tr><td>Espaçador da placa de circuito</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8,0 mm, 20,0 mm de comprimento</td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico para camundongos</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>Instrumentos estereotáxicos para camundongos</td></tr><tr><td>Manipulador</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>Manipulador manual</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M: 204610557</td><td>Cimento de resina adesiva dental</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td><td>Impressora 3D</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>Adesivo de silicone de baixa toxicidade</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Narishige</td><td>GD-1,5</td><td>OD 1,5 mm, ID 0,9 mm, 90,0 mm de comprimento</td></tr><tr><td>Cabo de remendo de fibra óptica</td><td>Lentes dóricas</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>Cabo de remendo monofibra óptica, OD, 2,5 mm, núcleo = 960 mm, revestimento = 1000 mm, NA = 0,63</td></tr><tr><td>Lentes dóricas LED conectadas</td><td></td><td>LEDC-1B_FC</td><td>Comprimento de onda central = 465 nm, potência de saída = 45 mW (Núcleo 960 mm 0,63 NA)</td></tr> <tr><td>Driver de LED</td><td>Lentes dóricas</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>driver de LED de 1 canal, saída máxima = 1000 mA</td></tr><tr><td>Extrator de eletrodo</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Extrator de micropipeta de vidro de duplo estágio</td></tr><tr><td>Capilar de vidro de borosilicato</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>Capilar de vidro de bolosilicato, OD, 1,5 mm, ID, 0,9 mm, 90,0 mm de comprimento</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>Pomada antibiótica</td></tr><tr><td>Terramicina&reg;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oxitetraciclina</td></tr><tr><td>Tg (Slc32a1- COP4 * H134R / EYFP) 8Gfng / J</td><td>Jackson Labs</td> <td># 14548</td><td>VGAT-ChR2 camundongos</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Amplificador de microeletrodo</td></tr></tbody></table>

identificação de optogenetics de um tipo neuronal com um optrode de vidro em ratos acordados

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

É uma grande preocupação em neurociência como diferente tipos de neurônios funcionam em circuitos neurais. Avanços recentes em optogenetics permitiram a identificação do tipo neuronal na vivo eletrofisiológicos experiências em regiões do cérebro amplo. Em experimentos de optogenetics, é essencial para fornecer a luz para o local de gravação. No entanto, muitas vezes é difícil entregar-se a luz de estimulação às regiões profundas do cérebro da superfície do cérebro. Especialmente, é difícil para a luz de estimulação atingir as regiões profundas do cérebro quando a transparência óptica da superfície do cérebro é baixa, como é frequentemente o caso com gravações de animais acordados. Aqui, descrevemos um método para gravar respostas de pico à luz de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida. Neste método, a luz é fornecida através do eléctrodo de vidro de gravação é possível estimular confiantemente o neurônio gravado com luz nas regiões profundas do cérebro. Este sistema de optrode sob medida consiste de materiais acessíveis e baratos e é fácil de montar.

Na Figura 2, examinamos os efeitos do tamanho da ponta e do comprimento das pipetas de vidro sobre o poder de luz na ponta das pipetas (Fig. 2A-B). O poder da luz foi medido por um medidor de potência óptica colocado 1 mm da ponta. O comprimento total foi definido como 50 ± 2 mm quando o tamanho da ponta variado, enquanto o tamanho da ponta foi definido como 2,5 µm, quando todo o comprimento variado. A haste da p...

Este trabalho apresenta um método para executar uma optogenetic unidade única gravação confiável de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida.

Identificação de Optogenetics de um tipo Neuronal com um Optrode de vidro em ratos acordados

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como as funções de diferentes tipos de neurônios. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite identificar de forma confiável os diferentes tipos de neurônios in vivo com materiais baratos e acessíveis. Estarei demonstrando o procedimento junto com Shinji Muramoto, nosso técnico, e Lanlan Ma, nosso professor assistente de nosso laboratório.Para iniciar este procedimento, puxe suavemente o tubo de aço para controle de pressão do cano do suporte. Amplie o orifício do lado do assento do pino no cano do suporte perfurando. Em seguida, coloque um tubo de aço inoxidável no orifício.Em seguida, insira uma luva de acoplamento dividida em cerâmica para ponteira de 2,5 milímetros de diâmetro no orifício. Faça um furo em um coelho em forma de L e prenda o cano do porta-eletrodo ao coelho com adesivo epóxi. Em seguida, conecte-o a um manipulador com parafusos.Prepare um poste de cabeça personalizado fazendo o espaçador da placa de circuito colunar em uma forma cuboidal com uma fresa e corte-o em dois postes de cabeça com uma serra. Em seguida, alise a parte inferior do poste da cabeça com uma fresa. Antes da cirurgia, esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e um poste de cabeça com uma autoclave.Limpe a estrutura estereotáxica e a almofada de aquecimento com álcool 70%. Em seguida, anestesie o mouse e coloque-o na estrutura estereotáxica em uma almofada de aquecimento. Neste experimento, um camundongo transgênico no qual os neurônios inibitórios que expressam a channelrodopsina-II são usados.Coloque os dentes no orifício da barra de mordida e aperte levemente o grampo do nariz. Em seguida, fixe os dois lados da cabeça usando barras auriculares. Quando a cabeça estiver corretamente fixada pelas barras auriculares, aperte o nariz clamp.Aplique uma pomada oftálmica nos olhos. Apare o cabelo sobre a cabeça com uma tesoura pequena e limpe o couro cabeludo com um cotonete de gluconato de clorexidina. Em seguida, corte o couro cabeludo ao longo da linha média e empurre-o para o lado.Remova o periósteo com um cotonete embebido em álcool 70% e deixe o crânio secar. Em seguida, prenda o poste principal ao manipulador. Posicione o poste da cabeça no crânio ao redor do bregma usando o manipulador.Misture quatro gotas do monômero, uma gota de catalisador e uma colher pequena de polímero em um prato pequeno que é resfriado na geladeira. Aplique cimento dentário no osso frontal e parietal e fixe o poste da cabeça no crânio. Depois que o cimento dental endurecer, remova o mouse da estrutura estereotáxica.Aplique uma pomada antibiótica na pele exposta e injete um coquetel de antagonista da medetomidina e antibiótico. Em seguida, coloque o mouse na almofada térmica em uma gaiola até que ele acorde e devolva-o a uma gaiola de alojamento com enriquecimentos. Para realizar a craniotomia sobre a região alvo do cérebro para registro, limpe o crânio com um cotonete embebido em gluconato de clorexidina e álcool a 70%.Raspe cuidadosamente o crânio sobre o local de gravação com uma broca dentária. Quando o osso estiver fino o suficiente, corte-o com a ponta do bisturi e remova-o. Em seguida, aplique cimento dental ao redor da região exposta para fortalecer o crânio.Cubra a área exposta do cérebro com adesivo de silicone após o endurecimento do cimento dental. Em seguida, coloque o animal na almofada térmica em uma gaiola até que ele acorde e devolva-o a uma gaiola. Permitir que o animal recupere por pelo menos um dia após a craniotomia, antes de realizar o registro eletrofisiológico.Antes de realizar o registro eletrofisiológico, faça algumas pipetas de vidro a partir de capilares de vidro borossilicato usando um extrator de eletrodos. Encha as pipetas com PBS 10 milimolares. Em algumas gravações, dois por cento de neurobiotina são adicionados ao PBS de 10 milimolares.Em seguida, coloque o animal na câmara de gravação. Encaixe uma pipeta de vidro cheia no suporte de optrodo feito à medida. Insira um fio revestido de cloreto de prata na pipeta de vidro.Em seguida, conecte o pino ao cabeçote stage do amplificador de gravação. Em seguida, conecte o patch cord de fibra óptica com uma ponteira de zircônia à luva de acoplamento dividida no suporte do optrodo. Empurre o patch cord na manga até que a ponta da ponteira entre em contato com a parte de trás da pipeta de vidro.O cabo de conexão fornece a luz do LED, que é controlado por um driver de LED de canal único. Em seguida, remova o adesivo de silicone sobre a craniotomia. Aplique solução salina morna na superfície do cérebro periodicamente para evitar que a superfície do cérebro seque durante a sessão de gravação.Se necessário, remova a dura-máter com uma pinça afiada. Aqui, as respostas de pico foram registradas no colículo inferior dos camundongos VGAT canalrodopsina-II acordados. No colículo inferior dos camundongos com canal VGAT de rodopsina-II, os neurônios GABAérgicos expressam especificamente a canalrodopsina-II.Nos camundongos acordados, os neurônios GABAérgicos e glutamatérgicos foram excitados ou suprimidos, respectivamente, quando receberam estímulos luminosos. Quando o estímulo luminoso é entregue através do eletrodo de vidro, ele evoca respostas de pico em alguns neurônios. Em contraste, em outros neurônios, os estímulos luminosos suprimiram as respostas de pico evocadas por estímulos sonoros.Esses resultados mostram que um optrodo de vidro pode registrar a atividade de unidade única bem isolada e estimular de forma confiável os neurônios registrados pela luz. Após o desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem como diferentes tipos de neurônios funcionam no soquete neural de várias regiões do cérebro.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/ single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere, et. al. RNA-seq de célula única de subconjuntos definidos de células ganglionares da retina. J. Vis. exp. (2017). Este vídeo demonstra uma técnica de rastreamento fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares da retina (RGC) em uma retina de camundongo transgênico. O processo envolve proteger a retina isolada em uma...

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