Identificação de Optogenetics de um tipo Neuronal com um Optrode de vidro em ratos acordados

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como as funções de diferentes tipos de neurônios. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite identificar de forma confiável os diferentes tipos de neurônios in vivo com materiais baratos e acessíveis. Estarei demonstrando o procedimento junto com Shinji Muramoto, nosso técnico, e Lanlan Ma, nosso professor assistente de nosso laboratório.

Para iniciar este procedimento, puxe suavemente o tubo de aço para controle de pressão do cano do suporte. Amplie o orifício do lado do assento do pino no cano do suporte perfurando. Em seguida, coloque um tubo de aço inoxidável no orifício.

Em seguida, insira uma luva de acoplamento dividida em cerâmica para ponteira de 2,5 milímetros de diâmetro no orifício. Faça um furo em um coelho em forma de L e prenda o cano do porta-eletrodo ao coelho com adesivo epóxi. Em seguida, conecte-o a um manipulador com parafusos.

Prepare um poste de cabeça personalizado fazendo o espaçador da placa de circuito colunar em uma forma cuboidal com uma fresa e corte-o em dois postes de cabeça com uma serra. Em seguida, alise a parte inferior do poste da cabeça com uma fresa. Antes da cirurgia, esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e um poste de cabeça com uma autoclave.

Limpe a estrutura estereotáxica e a almofada de aquecimento com álcool 70%. Em seguida, anestesie o mouse e coloque-o na estrutura estereotáxica em uma almofada de aquecimento. Neste experimento, um camundongo transgênico no qual os neurônios inibitórios que expressam a channelrodopsina-II são usados.

Coloque os dentes no orifício da barra de mordida e aperte levemente o grampo do nariz. Em seguida, fixe os dois lados da cabeça usando barras auriculares. Quando a cabeça estiver corretamente fixada pelas barras auriculares, aperte o nariz clamp.

Aplique uma pomada oftálmica nos olhos. Apare o cabelo sobre a cabeça com uma tesoura pequena e limpe o couro cabeludo com um cotonete de gluconato de clorexidina. Em seguida, corte o couro cabeludo ao longo da linha média e empurre-o para o lado.

Remova o periósteo com um cotonete embebido em álcool 70% e deixe o crânio secar. Em seguida, prenda o poste principal ao manipulador. Posicione o poste da cabeça no crânio ao redor do bregma usando o manipulador.

Misture quatro gotas do monômero, uma gota de catalisador e uma colher pequena de polímero em um prato pequeno que é resfriado na geladeira. Aplique cimento dentário no osso frontal e parietal e fixe o poste da cabeça no crânio. Depois que o cimento dental endurecer, remova o mouse da estrutura estereotáxica.

Aplique uma pomada antibiótica na pele exposta e injete um coquetel de antagonista da medetomidina e antibiótico. Em seguida, coloque o mouse na almofada térmica em uma gaiola até que ele acorde e devolva-o a uma gaiola de alojamento com enriquecimentos. Para realizar a craniotomia sobre a região alvo do cérebro para registro, limpe o crânio com um cotonete embebido em gluconato de clorexidina e álcool a 70%.

Raspe cuidadosamente o crânio sobre o local de gravação com uma broca dentária. Quando o osso estiver fino o suficiente, corte-o com a ponta do bisturi e remova-o. Em seguida, aplique cimento dental ao redor da região exposta para fortalecer o crânio.

Cubra a área exposta do cérebro com adesivo de silicone após o endurecimento do cimento dental. Em seguida, coloque o animal na almofada térmica em uma gaiola até que ele acorde e devolva-o a uma gaiola. Permitir que o animal recupere por pelo menos um dia após a craniotomia, antes de realizar o registro eletrofisiológico.

Antes de realizar o registro eletrofisiológico, faça algumas pipetas de vidro a partir de capilares de vidro borossilicato usando um extrator de eletrodos. Encha as pipetas com PBS 10 milimolares. Em algumas gravações, dois por cento de neurobiotina são adicionados ao PBS de 10 milimolares.

Em seguida, coloque o animal na câmara de gravação. Encaixe uma pipeta de vidro cheia no suporte de optrodo feito à medida. Insira um fio revestido de cloreto de prata na pipeta de vidro.

Em seguida, conecte o pino ao cabeçote stage do amplificador de gravação. Em seguida, conecte o patch cord de fibra óptica com uma ponteira de zircônia à luva de acoplamento dividida no suporte do optrodo. Empurre o patch cord na manga até que a ponta da ponteira entre em contato com a parte de trás da pipeta de vidro.

O cabo de conexão fornece a luz do LED, que é controlado por um driver de LED de canal único. Em seguida, remova o adesivo de silicone sobre a craniotomia. Aplique solução salina morna na superfície do cérebro periodicamente para evitar que a superfície do cérebro seque durante a sessão de gravação.

Se necessário, remova a dura-máter com uma pinça afiada. Aqui, as respostas de pico foram registradas no colículo inferior dos camundongos VGAT canalrodopsina-II acordados. No colículo inferior dos camundongos com canal VGAT de rodopsina-II, os neurônios GABAérgicos expressam especificamente a canalrodopsina-II.

Nos camundongos acordados, os neurônios GABAérgicos e glutamatérgicos foram excitados ou suprimidos, respectivamente, quando receberam estímulos luminosos. Quando o estímulo luminoso é entregue através do eletrodo de vidro, ele evoca respostas de pico em alguns neurônios. Em contraste, em outros neurônios, os estímulos luminosos suprimiram as respostas de pico evocadas por estímulos sonoros.

Esses resultados mostram que um optrodo de vidro pode registrar a atividade de unidade única bem isolada e estimular de forma confiável os neurônios registrados pela luz. Após o desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem como diferentes tipos de neurônios funcionam no soquete neural de várias regiões do cérebro.